Name: multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
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著者らは、AAV1-GCaMP6fの寛大な寄贈について、Howard Hughes Medical InstituteのJanelia Research CampusのGenetically-Encoded Neuronal Indicator and Effector（GENIE）プロジェクトのV. Jayaraman、DS Kim、LL LoogerおよびK. Svobodaに感謝したい。ペンシルバニア大学のVector Coreに彼らはまた、共焦点顕微鏡検査サービスのためのNIH NS069375助成金によって支えられているスタンフォード大学のA.オルソンと神経科学顕微鏡コアに感謝したいと思います。

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著者はジャーナルの方針を読み、以下の競合する利益を持っています：SG、SO、VCはInscopixの従業員です。

覚醒行動中の神経回路活動を理解することは、健康および疾患における脳機能を効果的に解剖するために必要な神経科学的調査の極めて重要なレベルである。皮質は、多くの重要な感覚、認知および執行機能において重要な役割を果たすので、目覚め行動の文脈において研究するために特に重要な領域である 28,29 。 皮質柱は皮質の基本機能単位であると考えられ、皮質細胞の集団レベルの活動は柱内の物理的位置に基づいて異なることが知られている。例えば、体性感覚皮質の層2/3の興奮性ニューロンは、主に他の新皮質領域に投射し、他の皮質網30を変調するが、深層の細胞は主に視床31のような皮質下領域に投射する。百の活動を記録する自由行動する被験者の異なる薄層を経て、時間と共に同時に予め指定された皮質細胞の塊状構造が、皮質情報フローの我々の理解を大きく促進し、リアルタイムの行動情報およびタスク関連の時間依存性の情報によって知らされる皮質柱の、スケール。 このレベルの神経回路データを収集することは、自由に行動する被験者（または頭に固定された被験者）における大規模なCa 2+イメージングを行うための、効率的かつ合理化された小型化された顕微鏡プラットホームの使用によって可能となる。このプロトコルは、細胞型特異的標的化を可能にする遺伝的にコード化されたカルシウムインジケータとともに使用され、慢性的に移植されたプリズムプローブによって提供される多層視野を画像化する、このプロトコルは、多くの可能な用途の1つのケースを探究した：マウスの体性感覚皮質処理物理的に新しい物体と噛み合っていた（ 図5 ）。これは、起きて自由に行動する動物において複数の皮質層を研究するためのこの種の細胞型特異的インビボアプローチの最初の手順図であり、能動的な脳の層状構造を理解するのに利用可能な実験方法のスペクトルを広げる。 関心領域に直接背側の組織の保存が望まれる場合、この技術におけるプリズムプローブによって有効にされる展望視野は、他の脳構造に適用可能である。例えば、CA3画像化は、海馬の機能を中断させることなく達成することができた。 Ca 2+活性をイメージングするためのプリズムプローブベースのアプローチは、皮質へのマイクロプリズムの物理的挿入および永久移植を必要とし、これはレンズプローブが挿入される皮質病変の生成に相当する。これは、頂端の樹状突起およびプロセスの切断を含む、局所的な神経回路への混乱をもたらす可能性がある。 T彼の手順はまた、領域内のグリア細胞の初期活性化を引き起こすが、これは、プリズム表面から約150μmの組織に局在し、脳が治癒した後に鎮静すると予想される。実験を計画するとき、この技法が動物の正常な回路解剖学および/または行動に影響するかどうかを検討することは非常に重要である。行動対照群は、交絡実験結果を生み出すベースライン行動に重大な変化がないことを確実にするために常に実施すべきである。 神経薬理学的操作、様々な認知的、社会的、運動的または内的行動学的パラダイムを用いたこの小型化された移動性Ca 2+イメージング技術を使用し、それを他の生理学的測定基準と組み合わせることにより、行動および信号における神経回路の機能的役割処理32 。抑制または活動薬物によって調節される特定の経路の作用は、この技術を用いて容易に研究することができる関連する行動に影響し得る33 。カルシウムインジケータのターゲッティングを変更することによって異なる細胞型に分岐することは、他の強力かつ有用な応用であり、様々な神経回路の問題に対処するための実験ツールの多くの独創的な組み合わせを可能にする。

皮質は、注意、知覚、トップダウンの認知制御1,2,3から動機づけ、報酬、中毒経路まで、多くの複雑な精神的および行動的機能における必須の要素である 4,5 。その機能の基礎となる計算プロセスを理解することは、多くの精神的および行動的障害のより良い臨床的理解を促進する重要な目標である。 皮質神経回路の機能不全または不調和が、精神分裂病6 、自閉症7または強迫性障害8のような状態の特徴である認知および行動異常の基礎をなす可能性があるという考えのまわりの精神医学的疾患センターの多くの現在の理論が中心である。したがって、共同体からの集団レベルの神経活動データを得ること同時行動情報の適切な文脈内の回路は非常に重要であり、理想的には、より細かい神経回路解剖のための特定の細胞型を標的とすることができる。 埋め込み型勾配屈折率（GRIN）マイクロレンズと組み合わせた小型化された顕微鏡は、皮質14,15,16を含む多様な可能な脳領域9,10,11,12,13から自由に動く条件下でニューロンアンサンブルへの光学的アクセスを可能にする。遺伝的にコード化されたカルシウムインジケータと結合した移動式顕微鏡検査システムを使用することにより、多くの脳領域9において数日から数週間にわたる何百ものニューロンを包含する同じ細胞集団の一貫したイメージングが可能になり、ウイルスベクターまたはトランスジェニック技術を用いて特定の細胞型に遺伝的に標的化される。 皮質が異なる機能をサポートし、皮質薄層17,18,19内の細胞の位置に依存して異なる脳領域に接続することが知られているので、我々は目覚める行動する被験者において同時多層神経活動を得ることに興味がある。ここでは、小型蛍光顕微鏡20を皮質の多層ビュー（ 図1 ）を提供する移植されたプリズムプローブと組み合わせて使用​​して、自由に行動するマウスにおいて何百もの蛍光標識されたニューロンを画像化する方法を示す 。 ここで使用されているプリズムプローブは、2つの別々のGRINレンズで構成されています：プリズムとシリンドリカルリレーレンズ（ 図1 ）。顕微鏡からの光は、蛍光標識されたプローブのプリズム部分の斜辺から反射された後に、プリズムプローブの撮像面に沿って配置される。細胞から放出された光は、プリズムの斜辺から反射し、顕微鏡の対物レンズを通して集められ、顕微鏡内のセンサーに到達する。この手順で使用されるプリズムプローブは、標準の定位固定装置で簡単に使用できるようになっています。 小型蛍光顕微鏡20は、Ca 2+感受性遺伝的にコードされた蛍光インジケータで特異的に標識された後、単一細胞分解能を有するニューロン集団における活動電位誘発性のCa 2+トランジェントを検出する。このプロトコールでは、ウイルスベクター（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）にコードされたCa 2+インジケーターを注入し、プリズムプローブを移植し、顕微鏡を設置し、次に体性感覚（S1後肢）神経活動データ動物からの暴露dを自由探査中の新規物体表面に適用する（ 図2 ）。

<table><tbody><tr><td>Neurostar Motorized&lt;br/&gt; Ultra Precise Small Animal Stereotaxic Instrument</td><td>Kopf</td><td>Model 963SD</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Stereoscope</td><td>Labomed</td><td>Prima DNT</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Mini Rectal Thermistor Probe (.062&quot;/1.6 mm diameter) - 1/4&quot; Jack</td><td>FHC</td><td>40-90-5D-02</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Heating Pad 5 X 12.5 cm&amp;nbsp;</td><td>FHC</td><td>40-90-2-07</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>DC Temperature Controller</td><td>FHC</td><td>40-90-8D</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Microsyringe Pump</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3 model; serial 155788 F110</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>NanoFil 10 &amp;mu;L Syringe</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>35 G Beveled Tip Nanofil NDL 2PK</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF35BV-2</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Omnidrill35, 115 - 230 V</td><td>World Precision Instruments</td><td>503598</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Burrs for Micro Drill</td><td>Fine Science Tools</td><td>19007-05</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>nVista</td><td>Inscopix</td><td>100-001048</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-1-PV3435</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Ketoprofen</td><td>Victor Medical</td><td>5487</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Carprofen</td><td>Victor Medical</td><td>1699008&amp;nbsp;</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Victor Medical</td><td>1001054</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Gelfoam (Patterson Veterinary Supply Inc Gelfoam Sponge 12 cm x 7 mm)</td><td>Pfizer (Fisher Scientific)</td><td>NC9841478</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-35</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dumont #5 forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-30</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Dissecting knives</td><td>Fine Science Tools</td><td>10055-12</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>ProView Implant Kit</td><td>Inscopix</td><td>100-000756</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>ProView Prism Probe 1.0 mm-Dia. ~4.3 mm Length</td><td>Inscopix</td><td>100-000592</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Kwik-Sil adhesive pack of 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-SIL</td><td>Surgery</td></tr><tr><td>Kwik-Cast Sealant</td><td>World Precision Instruments</td><td>KWIK-CAST</td><td>Surgery and Imaging</td></tr><tr><td>Miniature Optical Mounting Post</td><td>Newport</td><td>M-TSP-3</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate</td><td>Inscopix</td><td>BPL-2</td><td>Imaging</td></tr><tr><td>Microscope Baseplate Cover</td><td>Inscopix</td><td>BPC-2</td><td>Imaging</td></tr></tbody></table>

multi-layer cortical ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy

インビボでの回路および細胞レベルの機能イメージングは​​、脳を実際に理解するための重要なツールです。 2光子顕微鏡法を用いたマウス大脳皮質ニューロンの高解像度イメージングは​​、皮質構造、機能および可塑性についてのユニークな洞察を提供している。しかし、これらの研究は頭部固定動物に限られており、研究に利用可能な行動の複雑さを大幅に低減する。この論文では、自由に行動するマウスの複数の皮質層にわたる細胞解像度で慢性蛍光顕微鏡検査を行うための手順を説明する。本発明者らは、移植されたプリズムプローブと組合わされた小型の蛍光顕微鏡を使用して、数日間に亘って新しい物体探査課題に関与するマウスとして、体性感覚皮質の複数の層にわたって数百のニューロンのカルシウム動態を同時に視覚化し記録した。この技術は、異なる動物種の他の脳領域に、他の行動paradigms。

ここに概説されたプロトコルは、プリズムプローブ（ 図1 ）を用いて自由に行動するマウスにおいて、何百もの皮質ニューロンから縦多層のCa 2+イメージングを行う効果的かつ効率的な方法を説明している。多層皮質画像化への以前のアプローチは、主に固定動物22,23,24,25,26,27に限定されていた。自由に行動する状況でこのレベルのデータを取得するために、小型化された顕微鏡プラットフォームを行動の柔軟性のために使用した。遺伝的にコードされたカルシウム指示薬（GCaMP6f）を用いて特定の細胞集団（CAMKII +細胞の皮質）を標的化した。慢性の多層視野を提供するためにプリズムプローブを選択した。 図2 、ステップ1）。イメージングセッション中に顕微鏡を配置するための安全な一時的ドックとして機能するベースプレートを動物頭部に設置し（ 図2 、ステップ3）、覚醒している実験的実験で複数の細胞層にわたる皮質活動の可視化を可能にしたセットアップ（ 図2 、ステップ4）。 所望の細胞集団を確実に標的とするために、代表的なマウス由来の死後の冠状脳切片を図3に示し、プリズムプローブ領域および視野をGCaMP6fラボに関連してマークした身体感覚皮質の2/3および5層における神経細胞の脱出。 Open Field（1日目）、Object Familiarization（2日目〜4日目）、およびNovel Object（5日目）の3つの異なる環境にマウスを曝露したとき、体感感覚皮質ニューロンの活動が記録された。 図4 ）。 1日目に、マウスは何の物体も欠いている行動アリーナに置かれた。 2〜4日目に、同じ2つのテクスチャ的に異なるオブジェクト（ゲルパッドと木ブロック）を用いてマウスをアリーナに配置した。 5日目に、オブジェクトの1つが新しいオブジェクトに置き換えられました。動物を毎日20分間5日間にわたって撮像した。 Ca 2+画像データ分析ソフトウェアを用いた細胞抽出後、細胞位置に対応する空間フィルタを、顕微鏡記録データの平均蛍光強度投影上に重ねた（ 図5） 。白い破線は、層2/3および5のセルを分離する。各層からの5つの細胞からの対応するCa 2+トレースは、2つの異なる行動状況、すなわち、オブジェクトのファミリアリゼーションおよび新規のオブジェクト曝露における細胞の発火パターンを示す。層2/3細胞は、マウスを新規対象に曝露した日に層5細胞と比較してより活性であった。これは、1日目、4日目および5日目に撮像されたすべての細胞の閾値化された発火活性を示すラスタプロットからも明らかである。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig1.jpg" /> 図1：自由に動くマウスにおける複数の皮質層にわたるインビボ Ca 2+イメージング。 （ A ）プリズムプローブの仕様とイメージング面の描写。斜辺の内側の反射コーティングは、プリズムプローブの挿入面から90°の結像を可能にする。レンズcuffはレンズホルダーと一体化し、移植手順を合理化し、移植中の周辺組織の蛍光を潜在的に見ることができる（ B ）（i）。 （ii）ナイフ切開およびウイルス注射部位に対するプリズムプローブの平らな側面の位置の図解である。 （ C ）マウス大脳皮質に移植されたプリズムプローブを介して全視野内の小さな領域の光路を示すインビボ Ca 2+イメージング設定の図。 （ D ）プリズムプローブ設置中の視野の例。ミニチュア顕微鏡はプリズムプローブを保持するレンズホルダーに取り付けられており、プリズムプローブの設置中にウイルスの発現を確認することができます。 （ E ）GCaMP6f標識S1細胞の多層皮質画像化のためのプリズムプローブと顕微鏡の統合。 F視野の例ベースプレートの取り付け時。生の画像にいくつかの細胞を入れたベースプレートの設置時に、明確な血管パターンが見えます。取得ソフトウェアウィンドウでDF / Fをオンにすると、より多くのセルがはっきりと見えます。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig2.jpg" /> 図2：Prism Probe ImplantationとMicroscope Installationのワークフローイベントのタイムラインを示す図。週数は、Y軸に沿ったプロシージャのX軸とワークフローのステップで表されます。 （ A ）マウス体性感覚皮質の複数の層を標識するために、同じ背側腹軸に沿ったウイルス注射（AAV1.CaMKII.GCaMP6f.WPRE.SV40）を示す図。 （ B ）ウイルス注射の2週間後、プリズム・プローブeは、ウイルス注入部位に平行な軸に移植される。 （ C ）プリズムプローブ移植のおよそ1週間後、動物の顕微鏡での発現をチェックし、細胞集団が見える場合には、ベースプレートを頭部に装着する。 （ D ）その後、動物は、関連する行動課題（マウスクリップアートは、UW-Madison Biochemistry MediaLabから許可を得て変更された）の間、慢性画像化の準備が整う。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig3.jpg" /> 図3：プリズムプローブの位置およびGCaMP発現の死後の組織学的検証。 （ A ）プリズムプローブ領域を示し、そのイメージング側が向いている代表的なマウスの脳からの冠状切片GCaMP6f発現細胞（AAV1.CaMKII.GCaMP6fは、層2/3および5のニューロンにおいて発現される）。 （ B ）DAPIに対する染色後の同じ冠状脳切片。スケールバー=250μm（ C ）体性感覚皮質におけるGCaMP6f発現細胞の視野を拡大。スケールバー=100μm。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig4.jpg" /> 図4：慣れている間のマウスの活動、ファミリアリゼーション、および新規オブジェクトの露出テストはビデオソフトウェアを使用してビデオトラッキングされました。 （ A ）1日目に、動物は何の物体も欠いている行動場に置かれた（オープンフィールド）。 （ B ）2〜4日目に、同じ2つのテクスチャ的に異なるオブジェクト（ゲルパッドと木ブロック）をアリーナに置いた（Object Fami嘘つき）。 （ C ）5日目に、物体の1つを新しい物体（砂の木を有する木ブロック）（新規物体曝露）に置き換えた。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55579/55579fig5.jpg" /> 図5：顕微鏡で撮影された代表的なマウスの体性感覚皮質の表層および深層からのカルシウム動態。 （ A ）ニューロンの空間フィルタ（緑色の斑点）と、プリズムプローブ視野を通した顕微鏡記録の平均蛍光強度投影の合成画像。白い破線で示される顆粒層と顆粒層の間の境界。スケールバー=100μm。 （ B ）5つの例示的な表層細胞および深層細胞からのカルシウムトレース（青色および赤色のcパネルAのells）、主成分分析および独立成分分析後の蛍光の標準偏差の単位を示す。水平スケールバー50sおよび垂直スケールバー10SD（ C ）オープンフィールド、オブジェクトファミリアリゼーションおよびノベルオブジェクトの探索で示された表面（レイヤ2/3）および深層（レイヤ5）からのセルのラスタプロット。スケールバー= 100秒。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55579/55579fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

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Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。

多層皮質Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;プリズムプローブと小型蛍光顕微鏡を用いて自由に動くマウスのイメージング

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

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Research

JoVE Journal

Behavior

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

30.9K ビュー.  Inscopix Inc.. ここでは、自由に動くマウスの複数の皮質層にわたる細胞 - 解像度で大規模なCa 2+イメージングを行うための手順を提示する。移植されたプリズムプローブと結合された小型頭部装着型顕微鏡を使用して、数百の活性細胞を同時に観察することができる。 

ビデオ: Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Two-photon Calcium Imaging in Mice Navigating a Virtual Reality Environment

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically identified cells during behavior1-6. Here we describe methods to perform two-photon imaging in mouse cortex while the animal navigates a virtual reality environment. We focus on the aspects of the experimental procedures that are key to imaging in a behaving animal in a brightly lit virtual environment. The key problems that arise in this experimental setup that we here address are: minimizing brain motion related artifacts, minimizing light leak from the virtual reality projection system, and minimizing laser induced tissue damage. We also provide sample software to control the virtual reality environment and to do pupil tracking. With these procedures and resources it should be possible to convert a conventional two-photon microscope for use in behaving mice.

Here we describe the experimental procedures involved in two-photon imaging of mouse cortex during behavior in a virtual reality environment.

仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

In recent years, two-photon imaging has become an invaluable tool in neuroscience, as it allows for chronic measurement of the activity of genetically ...

行動学

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution . The method consists in implanting a cranial imaging window, injecting a fluorescent calcium indicator dye that can be taken up by large numbers of neurons and finally recording the activity of neurons with time lapse calcium imaging using an in-vivo two photon microscope. Co-injection of astrocyte-specific dyes allows one to differentiate neurons from astrocytes. The technique can be performed in mice expressing fluorescent molecules in specific subpopulations of neurons to better understand the network interactions of different groups of cells.

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons . In-vivo two-photon calcium imaging is the only method that allows one to record the activity of a dense neuronal population with single-cell resolution .

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

生物学

Functional Calcium Imaging in Developing Cortical Networks

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in intact spinal cord, brainstem, retina, cortex and dissociated neuronal culture preparations. During periods of spontaneous activity, neurons depolarize to fire single or bursts of action potentials, activating many ion channels. Depolarization activates voltage-gated calcium channels on dendrites and spines that mediate calcium influx. Highly synchronized electrical activity has been measured from local neuronal networks using field electrodes. This technique enables high temporal sampling rates but lower spatial resolution due to integrated read-out of multiple neurons at one electrode. Single cell resolution of neuronal activity is possible using patch-clamp electrophysiology on single neurons to measure firing activity. However, the ability to measure from a network is limited to the number of neurons patched simultaneously, and typically is only one or two neurons. The use of calcium-dependent fluorescent indicator dyes has enabled the measurement of synchronized activity across a network of cells. This technique gives both high spatial resolution and sufficient temporal sampling to record spontaneous activity of the developing network.
A key feature of newly-forming cortical and hippocampal networks during pre- and early postnatal development is spontaneous, synchronized neuronal activity (Katz &amp; Shatz, 1996; Khaziphov &amp; Luhmann, 2006). This correlated network activity is believed to be essential for the generation of functional circuits in the developing nervous system (Spitzer, 2006). In both primate and rodent brain, early electrical and calcium network waves are observed pre- and postnatally in vivo and in vitro (Adelsberger et al., 2005; Garaschuk et al., 2000; Lamblin et al., 1999). These early activity patterns, which are known to control several developmental processes including neuronal differentiation, synaptogenesis and plasticity (Rakic &amp; Komuro, 1995; Spitzer et al., 2004) are of critical importance for the correct development and maturation of the cortical circuitry.
In this JoVE video, we demonstrate the methods used to image spontaneous activity in developing cortical networks. Calcium-sensitive indicators, such as Fura 2-AM ester diffuse across the cell membrane where intracellular esterase activity cleaves the AM esters to leave the cell-impermeant form of indicator dye. The impermeant form of indicator has carboxylic acid groups which are able to then detect and bind calcium ions intracellularly.. The fluorescence of the calcium-sensitive dye is transiently altered upon binding to calcium. Single or multi-photon imaging techniques are used to measure the change in photons being emitted from the dye, and thus indicate an alteration in intracellular calcium. Furthermore, these calcium-dependent indicators can be combined with other fluorescent markers to investigate cell types within the active network.

Spontaneous activity of developing neuronal networks can be measured using AM-ester forms of calcium-sensitive indicator dyes. Changes in intracellular calcium, indicating neuronal activation, are detected as transient changes in indicator fluorescence with one- or two-photon imaging. This protocol can be adapted for a range of developmentally-dependent neuronal networks in vitro.

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

A hallmark pattern of activity in developing nervous systems is spontaneous, synchronized network activity. Synchronized activity has been observed in ...

神経科学

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in Awake Mice

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in the brain sense various biological conditions in the periphery and transmit the signals to neurons. Microglia, immune cells in the brain, are involved in synaptic development and plasticity. Therefore, the contribution of microglia to neural circuit construction in response to the internal state of the body should be tested critically by intravital imaging of the relationship between microglial dynamics and neuronal activity.
Here, we describe a technique for the simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice. Adeno-associated virus encoding R-CaMP, a gene-encoded calcium indicator of red fluorescence protein, was injected into layer 2/3 of the primary visual cortex in CX3CR1-EGFP transgenic mice expressing EGFP in microglia. After viral injection, a cranial window was installed onto the brain surface of the injected region. In vivo two-photon imaging in awake mice 4 weeks after the surgery demonstrated that neural activity and microglial dynamics could be recorded simultaneously at the sub-second temporal resolution. This technique can uncover the coordination between microglial dynamics and neuronal activity, with the former responding to peripheral immunological states and the latter encoding the internal brain states.

Here, we describe a protocol combining adeno-associated virus injection with cranial window implantation for simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice.

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

Since brain functions are under the continuous influence of the signals derived from peripheral tissues, it is critical to elucidate how glial cells in ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the other hand, two-photon imaging can resolve the activity of local neural circuits at the single-cell level. It is critical to make a large cranial window to perform multiple-scale analysis using both imaging techniques in the same mouse. To achieve this, one must remove a large section of the skull and cover the exposed cortical surface with transparent materials. Previously, glass skulls and polymer-based cranial windows have been developed for this purpose, but these materials are not easily fabricated. The present protocol describes a simple method for making a large cranial window consisting of commercially available polyvinylidene chloride (PVDC) wrapping film, a transparent silicone plug, and a cover glass. For imaging the dorsal surface of an entire hemisphere, the window size was approximately 6 x 3 mm2. Severe brain vibrations were not observed regardless of such a large window. Importantly, the condition of the brain surface did not deteriorate for more than one month. Wide-field imaging of a mouse expressing a genetically-encoded calcium indicator (GECI), GCaMP6f, specifically in astrocytes, revealed synchronized responses in a few millimeters. Two-photon imaging of the same mouse showed prominent calcium responses in individual astrocytes over several seconds. Furthermore, a thin layer of an adeno-associated virus was applied to the PVDC film and successfully expressed GECI in cortical neurons over the cranial window. This technique is reliable and cost-effective for making a large cranial window and facilitates the investigation of the neural and glial dynamics and their interactions during behavior at the macroscopic and microscopic levels.

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

The present protocol describes making a large (6 x 3 mm2) cranial window using food wrap, transparent silicone, and cover glass. This cranial window allows in vivo wide-field and two-photon calcium imaging experiments in the same mouse.

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...

上丘における2光子および広視野カルシウムイメージング

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

著者スポットライト:上腺における神経コーディングと視覚処理のメカニズムの解明 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

多層皮質Ca

要約

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仮想現実環境をナビゲートマウスにおける二光子カルシウムイメージング

レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

多層皮質Ca

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レイヤーin vivoでの2光子カルシウムイメージングマウスの2 / 3

皮質ネットワークの開発で機能的カルシウムイメージング

マイクロプリズムを使ってDeep皮質層のin vivoイメージング

インビボ マウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

マウス上結腸におけるカルシウムイメージング

インビボマウス劣オリーブにおけるカルシウムイメージング

インビボ大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング