Name: a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna
Uploaded: 2017-10-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
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Wir danken Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick und Evangelos Gatzogiannis für Unterstützung bei der anfänglichen Instrumentierung einrichten und testen. Wir danken weiter Tony Kulesa für bedeutende Hilfe schreiben und Bewertung der individuellen Einzelkorn-Tracking-Software. Diese Arbeit wurde durch die Finanzierung von Start und einen Karriere-Award auf der wissenschaftlichen Schnittstelle (PCB) von Burroughs Wellcome Foundation unterstützt.

1. Vorbereitung der Biotin-λ-DNA Hinweis: Biotin-λ-DNA-Moleküle sind bereit, durch Ligation eine Biotin-markierten Oligonukleotid, 5 &#39;-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - Biotin - 3 &#39;, Λ-DNA Moleküle 20.
<ol><li>Prepare 0,1 mM Biotin beschriftet Oligo in TE-Puffer.</li>
	<li>Wärme 0,5 mg/mL λ-DNA Lager bei 65 ° C für 60 s und Sprung in nassem Eis sofort. 
	Hinweis: Schnelle Quench Kühlung reduziert λ-DNA-Concatemerization.</li>
	<li>Pipette 100 µL der λ-DNA-Lösung zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Add 1 µL 0.1 mM Oligo in 9 µL TE-Puffer.</li>
	<li>Add 2 µL der Oligo-Lösung für den Microcentrifuge Schlauch mit λ-DNA. Gründlich mischen. 
	Hinweis: Oligo ist in etwa eine 12-fold Molaren Überschuss über ergänzende λ-DNA Ende.</li>
	<li>Erhitzen Sie die Mischung der λ-DNA/Oligo bei 65 ° C für 60 s.</li>
	<li>Langsam die Mischung auf Raumtemperatur abkühlen. 
	Hinweis: In diesem Schritt können die Oligo bis zu ergänzenden λ-DNA Ende Tempern.</li>
	<li>Legen Sie die Mischung auf dem Eis. Fügen Sie 11 µL T4 DNA-Ligase Reaktion Puffer (endgültige Puffer Konzentration 1 X). Mischen Sie vorsichtig. Fügen Sie 2 µL (800 Stück) T4 DNA-Ligase-Enzym. Vorsichtig mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Mischung für 2 h bei 16 ° C oder über Nacht bei 4 ° c</li>
	<li>Reinigen Sie das Produkt mit zentrifugalen Filterschläuche mit einem nominalen Molekulargewicht Limit von 100 kDa. Insbesondere übertragen die Schritt 1,9-Mischung in eine zentrifugale Filter Schlauch und Zentrifuge bei 14.000 x g für 5 min, mit 400 µL TE-Puffer zweimal waschen und sammeln das gereinigte Produkt. 
	Hinweis: Die als gereinigt Biotin-λ-DNA in TE-Puffer sind stabil bei-20 ° C bis zu einem Jahr.</li>
</ol> 2. Deckglas Funktionalisierung Hinweis: Glasdeckgläser sind durch die Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Diese einstufige Reaktion Protokoll ist einfacher und zuverlässiger erfahrungsgemäß als standard zweistufige Reaktion Protokoll 20. Deckglas Funktionalisierung mit Silan-PEG-Biotin schafft Bindungsstellen für Streptavidin und minimiert die unspezifische DNA und Protein Adsorption an der Oberfläche des Deckglases.
<ol><li>Sonicate fünf Nr. 1 Deckgläsern in 95 % igem Ethanol im Inneren eine Färbung jar für 10 min und dann mit Reinstwasser dreimal ausspülen. 
	Hinweis: Die fünfte Deckglas bietet einen Ersatz bei Bruch.</li>
	<li>Füllen Sie die Färbung Glas mit 1 M KOH, 10 min. lang beschallen und dann spülen Sie mit Reinstwasser dreimal.</li>
	<li>2.1-2.2 Zyklus zweimal wiederholen.</li>
	<li>Trocknen Deckgläsern unter trockenen, sauberen Gasstrom der N 2.</li>
	<li>Weitere reinigen und trocknen Sie die Deckgläsern durch Luft Plasmabehandlung bei 900 mTorr Druck für 5 min.</li>
	<li>Brüten Deckgläsern mit 25 mg/mL Silan-Peg-Biotin speziell in 95 % igem Ethanol bei Raumtemperatur für 2 h aufgelöst, sandwich-50 µL Silan-Peg-Biotin Lösung zwischen zwei sauberen und trockenen Deckgläsern und inkubieren Sie das Deckglas &#34; Sandwiches &#34; innerhalb einer geschlossenen Pipette Tip Box mit ca. 10 mL Wasser an der Unterseite (nicht in Kontakt mit den Deckgläsern) Lösungsmittel verdampfen zu minimieren.</li>
	<li>Waschen entfernt überschüssige PEG Molekülen mit Reinstwasser und Trocknen der PEG Deckgläsern unter sauberen beschichtet trocknen Gasstrom N 2. 
	Hinweis: Die funktionalisierten Deckgläsern können bis zu drei Tage unter Umgebungsbedingungen gelagert werden.</li>
</ol> 3. Bau der Zelle fließen Hinweis: Durchflusszellen entstehen durch sandwiching eine Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen eine PEG funktionalisiert Deckglas und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen. Mehrere Kanäle fließen pro Durchflusszelle.
<ol><li>Strömungskanäle in einer CAD-Software-design und Schnitt die Kanäle (Breite, Tiefe und Länge der einzelnen Kanäle sind 1, 0,13 und 12 mm, beziehungsweise) auf ein Doppel-Klebeband mithilfe einer Bandabschneider (in der Regel acht Kanäle fließen pro Zelle). Entfernen Sie Klebeband Residuen der Strömungskanäle bilden.</li>
	<li>Zu PDMS Platten, mischen Sie 45 g PDMS mit 5 g Vernetzung Reagenz (genug für die Herstellung von zwölf 5 mm dicker PMDS Platten die unter Umgebungsbedingungen auf unbestimmte Zeit gespeichert werden kann) mit einem Mixer, den Teig in zwei 10 cm Petrischalen und lassen die Gerichte in einer Vakuumkammer bis im Wesentlichen alle Luftblasen sind verschwunden (manuell entfernen Luftblasen, wenn irgendwelche bleiben, wenn die Gerichte aus der Vakuumkammer entfernt werden). Übertragen Sie dann die Gerichte in einem Ofen 80 ° C bis PDMS erstarrt (ca. 2 h).</li>
	<li>Schneiden Sie ein PDMS-Platte, die die Größe der Doppel-Klebeband mit vorgestanzten Kanälen entspricht. Peel ein Schutzfilm aus dem Doppel-Klebeband und halten den Film auf eine Ebene Fläche der Platte PDMS. Ablauf und Zulauf Lochen auf der PDMS-Platte mit einem 23 Gauge-Nadel eine Biopsie Loch-Puncher.</li>
	<li>Schälen die zweite Schutzfolie aus dem Doppel-Klebeband und halten die PDMS-Band Montage an die funktionalisierten Oberfläche das Deckglas (stellen Sie sicher, dass das Deckglas flach ist. Sehen ein Bild von einer fertig montierten Durchflusszelle in Abbildung 1a).</li>
</ol> 4. Imaging-TIRF Hinweis: Biotin-λ-DNA sind angebunden an eine Flow-Kanal-Oberfläche und Laminar-Flow gilt für Flow erstrecken sich die DNA-Moleküle ( Abbildung 1 b). Die &#62; 80 % gedehnt DNA Moleküle dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu beobachten. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse TIRF Imaging ( Abbildung 1 c &#38; e).
<ol><li>Fix der Messzelle am Mikroskop Bühne und Last bereits entgast leeren Puffer (10 mM Natriumphosphat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM Ethanol, 5 % (V/V) Glycerin, 0,01 % Tween-20, 1 % (V/V) β-Mercaptoethanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 1 mg / mL Bovine Serum Albumin (BSA) und 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung in vier Stauseen, dass jeweils ein Tygon-Schlauch mit einem Magnetventil-Wert verbunden und eine PEEK-Schlauch durch Sleeven den Tygon-Schlauch über die kleineren PEEK Rohr (ein weiteres Tygon Schlauch verbunden verhindert Rückfluss von Reagenzien). Entgasen von Kleinmengen des Puffers durch Übernachtung Exposition, Vakuum oder kürzeren Exposition gegenüber Vakuum unter Rühren (bis Bläschen nicht mehr sichtbar sind).</li>
	<li>PEEK-Schläuche des leeren Puffer Reservoirs in einer Bucht Loch der Durchflusszelle einfügen Prime den Kanal fließt in leeren Puffer, und drei andere PEEK-Schlauch In Saugbohrungen ist der Luftdruck angetrieben von Energiefluss jedes Reagenz durch Magnetventile gesteuert und vollautomatisch über ein Computer-Skript einfügen. Achten Sie darauf, keine Luft Blasenbildung im Kanal zu induzieren.</li>
	<li>Schließen Sie ein Tygon-Schlauch mit einer kurzen PEEK Schläuche aus der Austrittsöffnung zu einem Abfallbehälter. Der kurze Blick Schlauch am Ausgang hilft Luft Blasenbildung während der Infusion zu unterdrücken, durch die Aufrechterhaltung der Überdruck im Inneren des Kanals.</li>
	<li>Tethering Biotin-λ-DNA-Moleküle zu einer Strömung Kanal Oberfläche.
	<ol><li>Flow in 0,2 mg/mL Streptavidin Lösung, 5 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen Streptavidin.</li>
		<li>Durchfluss bei 1 mg/mL BSA-Lösung 1 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen BSA. 
		Hinweis: BSA weiter unterdrückt DNA und Probe Adsorption an der Oberfläche.</li>
		<li>Flow in 100 pM Biotin-λ-DNA-Lösung, 10 min inkubieren und fließen dann in leere Puffer zum Auswaschen der ungebundenen DNAs. 
		Hinweis: Nachdem die DNA an die Oberfläche gebunden ist, vermeiden Sie schnelle fließt die gefesselte DNA-Moleküle beschädigt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Um die Qualität der funktionalisierten Deckglas, fließen in DNA Färbung Farbstoff wie Sytox orange unter der Assay-Bedingungen verwendet werden (siehe 4.6 unten), und starten Sie Fluoreszenz imaging unter 532 nm Laser Beleuchtung. 
	Hinweis: Die Qualität der funktionalisierten Deckglas ist in der Regel gut, und die Dichte der Strömung gestreckt DNA-Moleküle wird hoch sein. Es ist wichtig, hochdichte der Fluss erstreckte sich DNA-Moleküle haben, dass DNA-Bindung und Schiebe/1D Verbreitung Ereignisse beobachtet werden können.</li>
	<li>Feinabstimmung den TIRF Winkel zum besten Signal Rauschabstand von Bildern der gestreckten DNA-Moleküle ( Abbildung 1-d) zu erreichen.</li>
	<li>Bahnen der einzelne Moleküle DNA, voran aufzeichnen wiederholen Sie die Schritte 4.2-4.4 in einen neuen Kanal (ohne DNA Farbstoff Färbung), dann ziehen bereits entgast Sub-nanomolaren Fluorophore beschriftet Moleküle mit einer genug hohen Durchflussrate mithilfe einer Spritzenpumpe und sammeln Sie Zeitraffer Fluoreszenzbilder mit einer Frame-Rate von 100 Hz. 
	Hinweis: Eine Durchflussmenge entspricht einem Weissenberg-Zahl (Wi: die dimensionslose Produkt die längste Polymer-Relaxationszeit - ca. 0,2 s für λ-DNA- und die Scherrate - die Veränderung der Strömungsgeschwindigkeit mit Abstand von der Oberfläche des Deckglases) von 500 innerhalb der Kanal wird für die Einzelmolekül-Bildgebung mit einer Frame-Rate von 100 Hz 21 empfohlen.
	<ol><li>Sammeln 10.000 Bilder in einem Field Of View (FOV), einen Film zu produzieren und ähnliche Filme aus mehreren (in der Regel zehn) FOVs pro Probe zu sammeln. 
		Hinweis: Die Dichte der Partikel in einem FOV sollte weder zu hoch - das wird Datenanalyse erschweren, indem man Objektzuordnung in Frames nicht eindeutig noch zu niedrig - die zu geringe Auftreten von Einzelmolekül-Veranstaltungen auf DNA führen könnte.</li>
		<li>Die Beleuchtungsintensität so optimieren, dass Moleküle gebunden an das Deckglas Oberfläche sind schnell Foto-gebleicht, Hintergrund zu unterdrücken, während Moleküle diffundieren auf DNA nicht vorschnell gebleicht werden, so dass längere Trajektorien erkannt werden können. 
		Hinweis: Wir verwenden in der Regel 200-800 W/cm 2 Leistungsdichte in der FOV.</li>
	</ol></li> <li>Am Ende des Schrittes 4.6 Infusion DNA Farbstoff Färbung zu bestätigen, dass DNA-Moleküle noch Strömung gestreckt werden können.</li>
	<li>Laufen sowohl positive als auch negative Kontrollproben. 
	Hinweis: Eine gute positive Kontrolle ist ein Tetrapeptid, TetraMethylRhodamine (TMR)-KRRR (TMR ist gekoppelt an das N-terminale Amin) hat eine mittlere 1D Verbreitung konstante 10,5 ± 0,7 (Standardfehler) M (bp- 2/s) bei neutralem pH 11. Eine gute Negativkontrolle ist beschriftete Proben von Interesse in Testpuffer in einem Kanal zu messen, die hat keine DNA angebunden, wo keine Diffusion auf DNA-Aktivität erkannt werden sollten.</li>
</ol> 5. Datenanalyse: Hinweis: eine benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software wird verwendet, um die Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen Verbreitung Konstanten. Diese Software ermittelt zunächst Zentroid Positionen der einzelnen Partikel mit hoher Genauigkeit, Partikel, die auf das Deckglas Oberfläche geklebt sind identifiziert und dann links Partikel in verschiedenen Frames Time-Lapse Trajektorien bilden. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten geschätzt.
<ol><li>Zur Datenanalyse zu starten, öffnen Sie eine scripting Software (siehe Tabelle der Materialien) und gehen Sie zum Verzeichnis der einzelnen Partikel tracking-Software. Öffnen Sie das Skript mit dem Namen &#34; largedataprocess3.m &#34;. Ein wichtiger Parameter definiert werden, ist der Schwellenwert für einzelne Partikeldetektoren.</li>
	<li>Zu bestimmen, die optimale Schwellwert, laufen die &#34; Determine_threshold_value.m &#34; Skript. Dieses Skript zeigt wie der Schwellenwert einzelner Partikeldetektoren auswirkt. Nach der Bestimmung des optimalen Schwellenwerts, laufen die &#34; largedataprocess3.m &#34; Skript</li>
	<li>Nach Abschluss der einzelnen Partikels tracking-Analyse, filtern die rohen Flugbahnen durch Ausführen der &#34; Trajectory_filtering.m &#34; Skript. Eine grafische Benutzeroberfläche (GUI) basiert der Filterung Schritt zu visualisieren.</li>
	<li>Auf die GUI-Panel setzt die minimale Verschiebung entlang DNA, MinXDisp, auf 2 Pixel soll die maximale Verschiebung quer zur DNA, MaxYDisp, 2 Pixel die minimale Anzahl der Frames, MinFrames, auf 10 festgelegt; minimale Anzahl der Staaten von Triplett, MinTriplets, um 10; Geben Sie die minimale Diffusion konstante entlang DNA, D_par, 0; Geben Sie die maximale geschätzte Verbreitung Konstante, DNA, D_trans, auf 10 M (bp 2) S -1 quer; der minimale statistische Parameter, Chi 2 _stat auf-5 festgelegt; Legen Sie das minimale Verhältnis der Verschiebung entlang der DNA, die quer zur DNA, MinX/Y, 2. 
	Hinweis: Alle rohe Flugbahnen, die diese Filterung Parameter übergeben sind in Tabelle 1 aufgeführt, und diejenigen, die nicht in Tabelle 3 aufgeführt sind.</li>
	<li>Klicken Sie auf eine Flugbahn Nummer in der Tabelle 1, die Flugbahn wird in Grafik 1 verdrängt &#38; 2. Klicken Sie auf die &#34; Play &#34; der rohen Fluoreszenzbilder abzuspielen. Klicken Sie auf die &#34; Add_to_Table2 &#34;, die Flugbahn als ein einzelnes Molekül Schiebe-Flugbahn zu identifizieren. Am Ende werden alle Trajektorien zu Tabelle2 hinzugefügt gespeichert werden, beim Schließen der GUI.</li>
	<li>, Berechnen Sie die durchschnittliche Verbreitung konstanten, führen Sie das Skript &#34; Calculate_mean_diffusion_constant.m &#34;. Die durchschnittliche Verbreitung konstante beläuft sich aus der Menge der Flugbahnen, die haben alle Filter Schritte bestanden und wurden hinzugefügt, Tabelle 2.</li>
</ol>

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+of+DNA+replication+in+Xenopus+egg+extracts.">Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts.</a> Methods. 57, 179-186 (2012).</li><li>Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Curtains+for+High-Throughput+Single-Molecule+Optical+Imaging.">DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging.</a> Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).</li></ol>

Broad Institute können wählen, Patentanmeldungen, die Aspekte der hier vorgestellten Arbeit enthalten.

Beim Umschalten von der traditionellen zweistufigen Deckglas Funktionalisierung Reaktion Protokoll auf eine einstufige Reaktion Protokoll, bemerkten wir, dass die Zuverlässigkeit des Deckglases Funktionalisierung deutlich verbessert wird. Wie die praktische Gesamtzeit für Deckglas Vorbereitung weniger als 30 min ist, empfehlen wir bereitet frische Deckgläsern jeden Tag Einzelmolekül-Bildgebung geplant ist. Um die Verschlechterung von Silan-PEG-Biotin zu minimieren, sollte das Reagenz regelmÄÑig und abgelegt unter N2 Trockengas bei-20 ° C nach Erhalt. Hier verwenden wir keine PEG-Moleküle, die produzieren -COO– oder -CH3 terminal Gruppen, die in den letzten20verwendet wurden. Die negativen Ladungen von -COO– und die hydrophoben -CH3 Gruppen wurden genutzt, um unspezifische Adsorption von DNA-Molekülen und spezifische Proteinproben bzw. an die Oberfläche zu verhindern. Wir beobachten sehr geringe Oberfläche Adsorption von kleinen Peptid Proben auf der Biotin-terminierte PEG Oberfläche, während Silan-PEG-COOH und/oder Silan-PEG-CH3 für Tests von bestimmten Proteinproben nützlich sein könnte oder wenn Bedingungen Test (z.B. pH &#60; 7,5) Förderung der DNA-Oberflächen-Wechselwirkungen.
Die Verlagerung von Glas-Folie-Durchflusszellen PDMS Flow Zellen beschleunigt den Fluss Zelle-Bau und ermöglicht die einfache Integration von mehreren Kanälen. Oft konstruieren wir acht Kanäle pro Durchflusszelle acht unabhängige Experimenten pro funktionalisierten Deckglas zu ermöglichen. Durchsatz pro Deckglas weiter zu steigern, könnte sogar größere Anzahl von Mikro-fabrizierten Kanäle verwendet werden.
Es ist ratsam, zu verhindern, dass Luft Blasenbildung im Inneren des Kanals zu jedem Zeitpunkt nach der Erstbefüllung. Luftblasen verursachen in der Regel keinen Verlust der gefesselte DNAs (obwohl dies möglich ist), sondern eher Fluss gestört und möglicherweise verursachen DNAs an das Deckglas halten. Puffer Entgasung und die Zugabe von kleinen Tensid Mengen sind in der Regel wirksam verhindern Blasenbildung innerhalb der Schläuche und Flow-Kanal. Versuchen Sie in Fällen, wo Luftblasen in das Rohr eingeführt werden, die Bläschen unter eine langsame Strömung durchspülen und stellen Sie sicher, dass sie nicht durch die Region fließen wo DNAs angebunden sind.
Eine schlanke und effiziente Datenanalyse-Software ist von entscheidender Bedeutung, durch die riesige Menge an Daten generiert. Wir sammeln in der Regel 700.000 hochauflösende Bilder von Messungen auf einer Messzelle, die unsere benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software innerhalb eines Tages auf einem Desktop-Computer mit einem Quadcore-Prozessor und 32 Gb Speicher verarbeitet werden können. False-positive-Rate 1D Verbreitung Flugbahnen von der Software (Schritt 5.5) zu erkennen ist Probe abhängig und kann ziemlich niedrig da: 1) die Dichte der einzelnen Partikel in das Blickfeld ist niedrig genug, so dass es etwas Mehrdeutigkeit Teilchen ganz Frames (verbindet Proteinproben sind im Allgemeinen anfälliger für unspezifische Adsorption auf das Deckglas als Peptid Proben, und somit der Puffer und die Leistungsdichte für jedes Protein probieren muss optimiert werden); (2) das Signal Rauschabstand von einzelnen Partikeln ist hoch genug, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch-Identifikation der Partikel gering ist. Doch die Software kann gelegentlich Fehler machen, und wir empfehlen manuelle Inspektion der Daten mit dem mitgelieferten GUI zur Bewertung der Softwareleistung. In einer Anwendung, die besonders empfindlich auf falsch-Positive Flugbahn Erkennung Prozess-Parameter einschließlich der Schwellenwert, MinFrames, MinTriplets und Chi2_stat stringenter auf Kosten der geringeren Empfindlichkeit für wahre Bindung einstellbar Veranstaltungen und potenziell höhere statistische Verzerrungen bei der Flugbahn Identifikation. Wir hier teilen und unsere Einzelkorn-Tracking-Software mit der Hoffnung auf Hilfe für Daten-Analyse-Methoden zu standardisieren und zur Diskussion über best Practices zu beschreiben.
In unserem Protokoll, die kontinuierlichen Fluss erfordert während der Bildgebung um den gestreckten Zustand der DNA Schablone Moleküle zu erhalten, könnte der Flüssigkeitsströmung den Transport einiger Proteine entlang DNA-Templates bias, wenn sie durch einen hopping-Mechanismus diffundieren oder der hydrodynamischen Radius der beschrifteten Fluorophor ist große22,23. Während solche Vorurteile gemessen und in die meisten Datensätze korrigiert werden kann, der Transport von Proteinen mit einer kleinen Fluorophore beschriftet und Verbreitung durch einen Schiebemechanismus ist nicht in der Regel voreingenommen nachweisbar Maße von Flow2,4, 24. Insbesondere wurde die Auswirkungen der Strömungsgeschwindigkeit auf den Transport von Proteinen entlang DNA verwendet, die Mechanismen der Verbreitung entlang DNA23Protein zu studieren. A eng im Zusammenhang mit alternativer Ansatz, die es Messungen in Ermangelung des Flusses ermöglicht nutzt DNA-Templates mit Biotin an beiden Termini, die vorübergehend im Fluss gestreckt sind und angebunden durch beide Enden auf dem Deckglas so, dass die DNA-Moleküle bleiben ein Erweiterte Konfiguration25,26,27,28der Strom ausgeschaltet ist. Die Doppel-Tether-Methode hat den Vorteil, dass strömungsfreien Transport Experimente aber erfordert eine Änderung der beiden Enden der DNA-Vorlage Moleküle, sorgfältige Flusssteuerung in Anbindehaltung und charakterisieren die Abstände zwischen den beiden Standorten angebunden. Darüber hinaus muss die Auswirkungen der heterogenen Spannungen und DNA Konformationsänderungen Dynamik über DNA-Moleküle auf der Einzelmolekül-Assay bewertet werden.
Insgesamt neben dem Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA, als berichtet Einzelmolekül-Assay profitieren viele in-vitro- biochemischen und biophysikalische Studien Ebene einschließlich DNA Einzelmolekül Ziel Suchprozesse durch Proteine, enzymatischen Aktivitäten auf DNA und mehr.
Fehlerbehebung
Problem 1: Die Strömungskanäle auslaufen.
Lösung: Stellen Sie zunächst sicher, dass die Gestaltung der Strömungskanäle mindestens 1,5 mm Rand zur Abdichtung rund um und zwischen den Kanälen ermöglicht; und dann, während der Montage der Messzelle, stellen Sie sicher, dass Kontaktflächen zwischen dem Deckglas, Doppel-Klebeband und PDMS-Platte sind flach, trocken und frei von Schmutz, dass der Druck angewendet, um die Dichtung zu bilden einheitliche, und der Schweißvorgang wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
Problem 2: Die Dichte der gefesselte DNAs ist zu niedrig.
Lösung: Dieses Problem entsteht, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist oder die DNA-Moleküle sind nicht mit Biotin funktionalisiert. Aus unserer Erfahrung, die Dichte der gefesselte DNA sollte so hoch für &#62; 90 % von den Deckgläsern zubereitet aus frischen oder Silan-PEG-Biotin Reagens ordnungsgemäß gelagert. In Fällen wenn die Dichte der gefesselte DNA mit einem bewährten Batch von Biotin-λ-DNA niedrig ist, versuchen Sie, Steigerung der Konzentration von Silan-PEG-Biotin während PEG Funktionalisierung und Konzentrationen von Streptavidin und Biotin-λ-DNA während DNA Anbindehaltung. Wenn dies fehlschlägt, ersetzen Sie die PEG und Streptavidin Reagenzien.
Problem 3: DNAs halten Sie sich an das Deckglas eind kann nicht durch Strömung gedehnt werden.
Lösung: Dieses Problem kann auch entstehen, wenn die PEG Funktionalisierung Effizienz gering ist und wird durch niedrige Assay pH verschärft. Versuchen Sie fließt in mehr BSA oder Erhöhung des pH-Werts (zB auf 8.0) zu helfen, DNA-Adsorption an der Oberfläche (Schritt 4.3.2) zu unterdrücken. Wenn DNA-Adsorption eine anhaltende Problem unter einer bestimmten Assay-Bedingung ist, versuchen Sie auch bis zu 90 % Silan-PEG-COOH während PEG Funktionalisierung.
Daten-Analyse-Hinweise:
Wir verwenden benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software, um Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA, von identifizieren die ihre 1D Verbreitung konstanten, D1 geschätzt. Um die Datenanalyse zu verbessern, haben wir die radiale Symmetrie Algorithmus18 zur Lokalisierung der Partikel und der Kovarianz-basiertes Kalkulationstool19 für die Schätzung der 1D Verbreitung konstanten, die Datenanalyse ohne dramatisch beschleunigt Genauigkeit. Wir zuvor validiert die Individualsoftware durch die Analyse von simulierten Daten11. Die wichtigsten Schritte sind nachfolgend beschrieben.
Teilchenidentifikation:
Dieser Schritt ist für die Erkennung und Segmentierung Partikel - Beugung begrenzte Flecken - Hintergrund. Erstens räumlich Bandpass-filtern die Bilder verbessern das Signal von Partikeln im 3-5 Pixelbereich (entspricht der Größe der Point-Spread Funktion in unserem System) und dann Schwelle anhand der Intensität (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).
Schwerpunkt-Zuordnung
Segmentierung des Bildes lokalisiert nur Moleküle auf Pixel-Ebene räumliche Auflösung. Um Moleküle zu viel höhere Präzision zu lokalisieren, beschäftigen Sie die radiale Symmetrie Superresolution Algorithmus18 Bilder gefiltert wie oben beschrieben. (Diese Methode basiert auf einer analytischen Berechnung und rechnerische Belastung im Vergleich zu anderen beliebten präzise Methoden wie 2D "glockenförmig" Montage erheblich reduziert (siehe Skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Particle tracking:
Um die Flugbahn eines Teilchens durch die Zeit zu verfolgen, müssen wir die gleichen Partikel wieder erkennen, wie sie zwischen den Rahmen bewegen. Wir betrachten die Einleitung, blinken und Beendigung Stadien Komponenten eine Flugbahn. Wir beschränken die Verknüpfung der Partikel im aktuellen Frames für diejenigen, die in vorherigen Frames durch die maximale Verschiebung erlaubt pro Frame. In Fällen wo mehrere Verbindungen möglich sind, der Jonker-Volgenant-Algorithmus wird verwendet, um Global optimale Verknüpfung Sätze ergeben (siehe Skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1-Einschätzung:
Um D1-Werte von Trajektorien abschätzen zu können, verwenden wir die Kovarianz-basierten Schätzer (CVE)19. Basierend auf eine analytische Berechnung, diese Methode ist mehr rechnerisch effizient und statistisch strenger als andere gängigen Methoden wie die Rückbildung der mittleren quadratischen Verschiebungen (siehe Skript: runspt5_SD.m).
Flugbahn zu filtern:
Einige Bahnen Artefakte wie Anbindung an Oberfläche gebundene Moleküle enthalten und müssen entfernt werden. Wir implementiert verschiedene Funktionen wie minimale Verschiebung parallel zur DNA, maximale Verschiebung quer zur DNA, minimale Länge der Flugbahn, minimale Anzahl von Triolen in Folge erkannt Positionen und minimale Wahrscheinlichkeitsergebnis (siehe Xiong Et al.,11 Definition), kann gefiltert werden, um einen minimal voreingenommene Satz von Trajektorien Moleküle diffundieren auf DNA dar zu isolieren (siehe Skript: sptViewFig2_update3x.m).

Ein altes Problem in der Biologie ist wie körpereigene Proteine, die auf spezifische Handeln stellen im Genom finden ihre DNA Ziele schnell genug für den Organismus zu überleben und wirksam auf seine Umwelt reagieren. Studien in den vergangenen vierzig Jahren vorgeschlagen und weitgehend Unterstützung, die die Hypothese, dass die Kinetik der DNA durch ein Protein Suche gezielt durch beschleunigt werden kann erleichterte Diffusion, in dem das Protein zwischen 3D Diffusion in der Masse und 1D Diffusion (einschließlich wechselt Rutschen und hüpfen Prozesse) entlang des DNA-1. Es ist nun bekannt, dass viele Proteine, die in der Genregulation, Nukleinsäure-Stoffwechsel und andere Prozesse in der Lage des Gleitens auf DNA-2,3,4,5,6,7 ,8,9. Neuere Studien berichtet darüber hinaus, dass sogar kleine Peptide binden an und schieben Sie auf DNA, mit der Fähigkeit, eine Ladung tragen können; zum Beispiel ein Eiweißmolekül oder PCR Primer entlang DNA-10,11,12,13,14.
In den letzten 15 Jahren hat Einzelmolekül Fluss-stretching Assay verbreitet, Bindung und Diffusion von Molekülen entlang DNA2,15,16zu studieren. Bei dieser Art des Tests, Biotinylierte doppelsträngige DNA-Moleküle auf der Oberfläche immobilisiert sind und eine laminare Strömung gilt für Durchfluss dehnen die DNA. Die &#62; 80 % gedehnt DNAs dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Untersuchung von Bindung und Transport Aktivität von Molekülen mit Fluorophore beschriftet wo werden die Bahnen der einzelnen Moleküle entlang DNA durch Time-Lapse Fluoreszenz-Bildgebung verfolgt. In unserer Implementierung optimiert hinsichtlich Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit, dieser Test besteht aus fünf Hauptschritte: Vorbereitung der Biotin-λ-DNA, Deckglas Funktionalisierung, Flow Zelle Bau, Fluoreszenz-Bildgebung und Datenanalyse. In früheren Protokollen17waren Glasdeckgläser funktionalisiert durch erste reagierenden mit (3-Aminopropyl) Triethoxysilane (APTES) und dann mit Amin-reaktive Polyethylenglykol (PEG) Reagenzien (z. B. NHS-PEG-Biotin) um eine PEG Schicht bilden, die widersteht unspezifische Adsorption von Assay-Komponenten auf dem Deckglas Oberfläche. Die Qualität der funktionalisierter Deckgläsern hing weitgehend von der Qualität der PEG Reagenzien und Reaktionsbedingungen bei jedem Schritt. Unser Protokoll beschreibt eine vereinfachte Funktionalisierung Protokoll und Multiplex-Flow Zelle Konstruktion erfordert keine flüssigen Klebstoff oder Aushärtungszeit auf die Tag-Durchflusszellen montiert. Wir beschreiben auch eine schlanke und robuste Daten Analyse Verfahren11 , die rechenintensive Regression Schritte beseitigt durch die Anwendung einer radiale Symmetrie-Methode für Zentroid Lokalisierung18 und eine Kovarianz-basierte diffusion konstante Schätzer19.
Hier berichten wir eine einfache, robuste und Hochdurchsatz-Molekül fließen stretching Assay-Umsetzung mit signifikanten Verbesserungen im Deckglas Funktionalisierung, Flow-Zelle-Bau und Datenanalyse. Unter anderem entwickelten wir eine einstufige Deckglas Funktionalisierung Protokoll, in dem sauberen und trockenen Deckgläsern direkt mit Silan-PEG-Biotin reagieren. Dieses Protokoll vereinfacht die Vorbereitung Deckglas und verbessert die Zuverlässigkeit der Qualität der funktionalisierten Oberflächen im Vergleich zu den standard zweistufige Reaktion Protokoll. Wir beschreiben die Verwendung von so funktionalisiert Deckgläsern mit Mehrkanal PDMS Durchflusszellen, die robuste Schlauchverbindungen erfolgen ohne Leim zu ermöglichen. Diese Durchflusszellen weiter gehören mehrere computergesteuerte Einlässe für jede Kammer fließen die automatisierte Reagenz Stromfluss, Hands-on-Zeit während der Installation und erhöhte Assay Durchsatz zu verringern zu können.

<table><tbody><tr><td>Biotin labeled oligo, 5&amp;rsquo;-AGGTCGCCGCCC(A)&lt;sub&gt;20&lt;/sub&gt;-biotin-3&amp;rsquo;</td><td>IDT</td><td>Custom oligo synthesis</td><td>Standard desalting purification is sufficient</td></tr><tr><td>&amp;lambda;-DNA</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N3011S</td><td>Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number</td></tr><tr><td>T4 DNA ligase and ligation reaction buffer</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC510008</td><td></td></tr><tr><td>No. 1 glass coverslips</td><td>VWR</td><td>48393-106</td><td></td></tr><tr><td>Pure ethanol</td><td>VWR</td><td>89125-186</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide pellets</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td></td></tr><tr><td>Plasma cleaner, model No. PDC-32G</td><td>Harrick Plasma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silane-peg-biotin</td><td>Nanocs</td><td>PG2-BNSL-5k</td><td>Store at -20&lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C in dry nitrogen gas</td></tr><tr><td>A CAD software</td><td>Autodesk</td><td>AutoCAD</td><td></td></tr><tr><td>Double-adhesive tape</td><td>Adhesive Applications</td><td>8512-2-DP/DL</td><td></td></tr><tr><td>Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP</td><td>Graphtec America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS and crosslink reagent kit</td><td>R.S. Hughes</td><td>RTV615 CLEAR 010</td><td></td></tr><tr><td>Degassing chamber, model No. F42010-0000</td><td>BEL-ART Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mixer, model No. ARV-310</td><td>Thinky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm</td><td>Harris Uni-Cores</td><td></td><td>This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size</td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-06420-02</td><td>0.020&quot; ID, 0.060&quot;OD</td></tr><tr><td>Peek tubing</td><td>Western Analytical</td><td>PK007-031-Y</td><td>0.007&quot; ID, 0.031&quot;OD</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>N7021S</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>New England Biolabs Inc.</td><td>B9000S</td><td></td></tr><tr><td>Sytox orange nucleic acid stain</td><td>Invitrogen</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>Ti-E Microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment</td></tr><tr><td>100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CMOS camera</td><td>Hammamatsu</td><td>Orca Flash 4.0</td><td></td></tr><tr><td>Dichroic mirror</td><td>Semrock</td><td>FF560/659-Di01-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Bandpass filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-577/690-25</td><td></td></tr><tr><td>532 nm laser</td><td>Rayscience Innovation Limited, Shanghai</td><td>OEMLL-FN-532nm-C</td><td>Select wavelength to correspond to stain of choice</td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>Chemxy</td><td>Fusion 200</td><td></td></tr><tr><td>TMR-KRRR, &gt;=85% purity</td><td>MIT Biopolymer lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pVIc-Cy3B, HPLC purified</td><td>A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Script programming software</td><td>MathWorks</td><td>Matlab</td><td></td></tr><tr><td>* see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple, robust, and high throughput single molecule flow stretching assay implementation for studying transport of molecules along dna

Wir beschreiben einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium 1D Diffusion von Molekülen entlang DNA. In diesem Test sind Glasdeckgläser in eine einstufige Reaktion mit Silan-PEG-Biotin funktionalisiert. Durchflusszellen entstehen durch ein Klebeband mit vorgestanzten Kanäle zwischen einem funktionalisierten Deckgläschen und ein PDMS-Platte mit Einlass und Auslass Öffnungen sandwiching. Mehrere Kanäle in einer Messzelle integriert sind und die Strömung von Reagenzien in jedem Kanal kann vollständig automatisiert werden, die deutlich erhöht den Durchsatz Assay und Hands-on-Zeit pro Assay reduziert. In jedem Kanal Biotin-λ-DNA sind auf der Oberfläche immobilisiert und eine laminare Strömung wird angewendet, um Fluss-die DNAs Stretch. Die DNA-Moleküle werden gedehnt &#62; 80 % ihrer Kontur Länge und dienen als räumlich erweiterte Vorlagen für die Bindung und den Transport Aktivität Eindringmittel beschrifteten Moleküle zu studieren. Die Bahnen der einzelnen Moleküle werden verfolgt von Time-Lapse Total interne Reflexion Fluoreszenz (TIRF) Bildgebung. RAW-Bilder werden analysiert, optimierte benutzerdefinierte Einzelkorn-Tracking-Software verwenden, um automatisch Bahnen der einzelnen Moleküle diffundieren entlang DNA erkennen und schätzen ihre 1D-Diffusion-Konstanten.

Abbildung 2a zeigt die erkannten Flugbahnen der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle diffundieren auf DNA in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. Die Verbreitung von pVIc ist Bi-direktional und getrieben von ambient Wärmeenergie. Aus diesen Bahnen werden die 1D Verbreitung konstanten (D1-Werte) für jede Trajektorie geschätzt (siehe das Histogramm in Abbildung 2 b). Der Mittelwert D1 Wert dieser pVIc Konjugat ist sein 22,2 ± 0,9 (Standardfehler) M (bp2/s) von durchschnittlich jeder D1-Wert über Flugbahnen gewichtet nach der Anzahl der Triplett aufeinander folgende Position Forderungen in jeder Bahn berechnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig1.jpg"> 
Abbildung 1 : Vorrichtung zum Verfolgen von Bewegung der einzelnen Moleküle entlang DNA. (a) eine achtkanalige PDMS Mikrofluidik-Chip eingehalten einem funktionalisierten Deckgläschen auf die DNA kann angebunden werden, (mit USA Viertel für Skala Münze); (b) fließen Sie Zelle Zoom Schaltplan zeigt Fluss-gestreckten λ-DNA-Moleküle; (c) schematische Darstellung der TIRF Mikroskop und Flutsystem zur Dehnung DNA; (d) TIRF Bild der Flow-gestreckten λ-DNA; (e) TIRF Bild der pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B ist konjugiert, die Cystein-Reste) Moleküle gebunden an einen Fluss gestreckt λ-DNA. Diese Zahl wurde mit Erlaubnis2,12geändert. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55923/55923fig2.jpg"> 
Abbildung 2 : Eindimensionale Diffusion von pVIc (GVQSLKRRRCF) entlang DNA. (a). Verbreitung der pVIc entlang erstreckte sich λ-DNA (137 Trajektorien) in 2 mM NaCl-Puffer bei pH 6,5. x(t) und y(t) sind die Verschiebungen entlang und quer zur λ-DNA. Gepunktete horizontale Linien zeigen fehlende Punkte aus Farbstoff zu blinken. (b). Histogramm der Diffusion Konstante, D1 für pVIc diffundieren entlang λ-DNA. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55923/55923fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

We describe a simple, robust and high throughput single molecule flow-stretching assay for studying 1D diffusion of molecules along DNA. In this assay, ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.1K Aufrufe.  Massachusetts Institute of Technology and Harvard Medical School. Dieses Protokoll zeigt einen einfache, robuste und hohen Durchsatz Einzelmolekül Fluss-stretching Assay für das Studium eindimensionale (1D) Diffusion von Molekülen entlang DNA.

Serie: A Simple, Robust, and High Throughput Single Molecule Flow Stretching Assay Implementation for Studying Transport of Molecules Along DNA

Stretching Short Sequences of DNA with Constant Force Axial Optical Tweezers

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many interesting biological events such as histone binding and protein-mediated looping of DNA1,2, occur on this length scale. In recent years, the mechanical properties of DNA have been shown to play a significant role in fundamental cellular processes like the packaging of DNA into compact nucleosomes and chromatin fibers3,4. Clearly, it is then important to understand the mechanical properties of short stretches of DNA. In this paper, we provide a practical guide to a single-molecule optical tweezing technique that we have developed to study the mechanical behavior of DNA with contour lengths as short as a few hundred basepairs.
The major hurdle in stretching short segments of DNA is that conventional optical tweezers are generally designed to apply force in a direction lateral to the stage5,6, (see Fig. 1). In this geometry, the angle between the bead and the coverslip, to which the DNA is tethered, becomes very steep for submicron length DNA. The axial position must now be accounted for, which can be a challenge, and, since the extension drags the microsphere closer to the coverslip, steric effects are enhanced. Furthermore, as a result of the asymmetry of the microspheres, lateral extensions will generate varying levels of torque due to rotation of the microsphere within the optical trap since the direction of the reactive force changes during the extension.
Alternate methods for stretching submicron DNA run up against their own unique hurdles. For instance, a dual-beam optical trap is limited to stretching DNA of around a wavelength, at which point interference effects between the two traps and from light scattering between the microspheres begin to pose a significant problem. Replacing one of the traps with a micropipette would most likely suffer from similar challenges. While one could directly use the axial potential to stretch the DNA, an active feedback scheme would be needed to apply a constant force and the bandwidth of this will be quite limited, especially at low forces.
We circumvent these fundamental problems by directly pulling the DNA away from the coverslip by using a constant force axial optical tweezers7,8. This is achieved by trapping the bead in a linear region of the optical potential, where the optical force is constant-the strength of which can be tuned by adjusting the laser power. Trapping within the linear region also serves as an all optical force-clamp on the DNA that extends for nearly 350 nm in the axial direction. We simultaneously compensate for thermal and mechanical drift by finely adjusting the position of the stage so that a reference microsphere stuck to the coverslip remains at the same position and focus, allowing for a virtually limitless observation period.

We illustrate the use of a constant force axial optical tweezers to explore the mechanical properties of short DNA molecules. By stretching DNA axially, we minimize steric hindrances and artifacts arising in conventional lateral manipulation, allowing us to study DNA molecules as short as ~100 nm.

Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Single-molecule techniques for stretching DNA of contour lengths  less than a kilobase are fraught with experimental difficulties. However, many ...

Forschung

Biotechnik

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA processing, and telomere elongation. During these processes, various proteins bind and resolve G4 structures to perform their function. As the function of G4 often depends on the stability of its folded structure, it is important to investigate how G4 binding proteins regulate the stability of G4. This work presents a method to manipulate single G4 molecules using magnetic tweezers, which enables studies of the regulation of G4 binding proteins on a single G4 molecule in real time. In general, this method is suitable for a wide scope of applications in studies for proteins/ligands interactions and regulations on various DNA or RNA secondary structures.

A single-molecule magnetic tweezers platform to manipulate G-quadruplexes is reported, which allows for the study of G4 stability and regulation by various proteins.

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Biochemie

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Biologie

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the averaging that takes place in bulk-phase studies. To achieve visualization, dual optical tweezers, where one trap is fixed and the other is mobile, are focused into one channel of a multi-stream microfluidic chamber positioned on the stage of an inverted fluorescence microscope. The optical tweezers trap single molecules of fluorescently labeled DNA and fluid flow through the chamber and past the trapped beads, stretches the DNA to B-form (under minimal force, i.e., 0 pN) with the nucleic acid being observed as a white string against a black background. DNA molecules are moved from one stream to the next, by translating the stage perpendicular to the flow to enable the initiation of reactions in a controlled manner. To achieve success, microfluidic devices with optically clear channels are mated to glass syringes held in place in a syringe pump. Optimal results use connectors permanently bonded to the flow cell, tubing that is mechanically rigid and chemically resistant, and which is connected to switching valves that eliminate bubbles that prohibit laminar flow.

Visual, single-molecule biochemistry studied through microfluidic chambers is greatly facilitated using glass barrel, gas-tight syringes, stable connections of tubing to flow cells, and elimination of bubbles by placing switching valves between the syringes and tubing. The protocol describes dual optical traps that enable visualization of DNA transactions and intermolecular interactions.

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Visual biochemistry is a powerful technique for observing the stochastic properties of single enzymes or enzyme complexes that are obscured in the ...

<meta charset="utf8"></head><body>CMG-vermittelte DNA-Dewindung durch Wachstum des ssDNA-RPA-Trakts beobachtet

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Entschlüsselung der Dynamik der eukaryotischen DNA-Replikation durch Einzelmolekül-Visualisierung

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

Einfach, Robust und hohen Durchsatz Molekül fließen Stretching Assay-Implementierung für das Studium Transport von Molekülen entlang DNA

Zusammenfassung

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Stretching kurze DNA-Sequenzen mit Constant Force Axial Optische Pinzetten

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Einzelmolekül-Verweilzeitanalyse der Restriktionsendonuklilease-vermittelten DNA-Spaltung

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Einzelmolekül-Echtzeit-Visualisierung der DNA-Abwicklung durch CMG-Helikase

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie