Samir Hamdan unterstützt bei der Entwicklung dieser Technik. E. coli-Proteine ​​sind aus dem Labor von Prof. Nick Dixon, sind University of Wollongong und T7 Proteine ​​aus Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. Die Arbeit wird durch die National Institutes of Health (GM077248 zu AMvO) und die Jane Coffin Childs Foundation (JJL) unterstützt.

Vor der Durchführung einer Einzel-Molekül-Replikation Experiment, müssen ein paar Materialien im Voraus vorbereitet werden. 1. DNA Replication Vorlage Das Substrat für die Replikation Reaktion ist ein biotinylierter, tailed M13 Rolling-Circle unter Verwendung von Standardverfahren molekularbiologischen Techniken 1,2. Werkstoffe: M13mp18 Einzelstrang-DNA, Biotinylated Schwanz Oligonukleotid-Primer (5&#39;-Biotin-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7-DNA-Polymerase, Heat Block, Phenol / Isoamylalkohol / Chloroform <ol><li> Glühen des biotinylierten Oligo Schwanz der M13 durch Zugabe einer 10-fachen Überschuss von Oligo in TBS-Puffer (330 nM Schwanz Oligo, 33 nM M13). </li><li> Erhitzen Sie die Mischung auf 65 ° C in der Hitze zu blockieren. Einmal erhitzt, schalten Sie die Hitze blockieren und ermöglichen ein langsames Abkühlen auf richtig glühen die Grundierung. </li><li> Fügen Sie die grundierte M13 zu einer Mischung von 64 nM T7 DNA-Polymerase und T7-Replikation Puffer mit dNTPs und MgCl 2. </li><li> Inkubieren Sie die Reaktion bei 37 ° C für 12 Minuten und löschen mit 100 mM EDTA. </li><li> Purify das ausgefüllte Produkt DNA mit Phenol / Chloroform / Isoamylalkohol-Extraktion und Dialyse in TE-Puffer oder einem anderen geeigneten Pufferspeicher und bestimmen DNA-Konzentration (Back-Extrakt jedes organische Phase, um restliche grundiert M13 wiederherzustellen). </li><li> Eine Iteration der Vorlage Vorbereitung kann leicht mehrere Milliliter nanomolaren Konzentrationsbereich Vorlage, genug für Hunderte bis Tausende von Einzel-Molekül-Experimente. </li></ol> 2. Funktionalisierte Deckgläser Zur Befestigung der DNA, die Deckglas wird das Glas zunächst mit einem Aminosilan, die dann an biotinylierte PEG-Moleküle gekoppelt ist funktionalisiert. Diese Beschichtung hilft, die unspezifische Wechselwirkungen der DNA-Replikation und Proteine ​​mit der Oberfläche 1,3 zu reduzieren. Materialien: Glas-Deckgläschen, Küvetten, 3-Aminopropyltriethoxysilan, Methoxy-PEG5k-NHS-Ester, Biotin-PEG5k-NHSester, Aceton, 1M KOH, Ethanol, Backofen, Ultraschallbad <ol><li> Reinigen Sie die Deckgläschen, indem man sie in Küvetten und Befüllen der Gläser mit Ethanol. Ultraschallbad für 30 Minuten und spülen Sie die Gläser füllen und mit 1 M KOH. Ultraschallbad für 30 Minuten sowohl wäscht wiederholen. </li><li> Zum ersten Funktionalisierung Reaktion, müssen alle Spuren von Wasser entfernt werden. Füllt die Krüge mit Aceton und beschallen für 10 min. Spülen Sie die Gläser nochmals mit Aceton. </li><li> Bereiten Sie eine 2% v / v Lösung des Silans Reagenz in Aceton. Hinzufügen, um die Küvetten und agitieren für 2 Minuten. Diese Reaktion koppelt die Alkoxygruppe des Aminosilan auf das Glas, so dass eine reaktive Amin für die nächsten Kupplungsschritt. Die Reaktion wird mit einem großen Überschuss an Wasser. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläschen durch Backen sie bei 110 ° C in den Ofen für 30 Minuten. </li><li> Bereiten Sie eine 50:1 methoxy: Biotin PEG-Gemisch in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Ziel für rund 0,2% w / v biotinylierten PEG. </li><li> Je 100 ul der PEG-Gemisch auf ein trockenes silanisiert Deckglas und legen Sie eine weitere Deckglas an der Spitze. Inklusive einem Deckglas spacer erlauben Trennung der Deckgläser. </li><li> Inkubieren Sie die Deckgläser in der PEG-Lösung für 3 Stunden, dann trennen Sie jedes Paar von Deckgläsern und waschen gründlich mit Wasser. Seien Sie vorsichtig, damit die Deckgläser funktionalisierten Seitenketten als nur einmal an Seite mit PEG beschichtet werden. </li><li> Trocknen Sie die Deckgläser und speichern unter Vakuum. Die Oberflächen bleiben für mindestens einen Monat stabil, so Dutzende von Deckgläsern können in einer Batch gemacht werden und nach Bedarf verwendet. </li></ol> Diese Materialien sollten vor der Zeit gemacht werden, und dann für jedes Experiment verwendet. Zu Beginn jedes Einzel-Molekül-Experiment, von der Montage der Flusskammer beginnen. 3. Flusskammer Vorbereitung Das Experiment wird mit Hilfe einer einfachen Flusskammer mit einem funktionalisierten Deckglas, doppelseitiges Klebeband, ein Quarz-Objektträger und Schläuche hergestellt. Eine Flusskammer wird für jede Einzel-Molekül-Experiment 1,4 zubereitet. Material: Doppelseitiges Klebeband, Rasierklinge, Quartz slide mit Bohrungen für Schläuche, Quick-dry Epoxy, funktionalisierten Deckglas (siehe oben), Streptavidin-Lösung (25 ul 1 mg / mL in PBS), Tubing, Blocking-Puffer (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Beginnen Sie, indem 20-25 ml Blocking-Puffer in einem Exsikkator, um mögliche Luftblasen für spätere Schritte zu entfernen. </li><li> Werfen Sie einen PEG-funktionalisierten Deckglas und breitete 125 von PBS-verdünnten Streptavidin-Lösung über die Oberfläche. Lassen Sie diese für 20 Minuten inkubieren während der Vorbereitung in anderen Teilen der Kammer, so dass Streptavidin an die Oberfläche Biotine binden. </li><li> Schneiden Sie ein Stück zweiseitigd-Band zu passen die Größe des Quarz-Objektträger. Markieren Sie die Position des Schlauches Löcher auf dem Band mit einem Bleistift, so dass ein Überblick über die Flusskammer auf dem Band (1 mg / mL) gezogen werden können. </li><li> Machen Sie einen 2 mm breiten Rechteck um die Löcher. Dies wird als der Strömungskanal dienen, so achten Sie darauf, geraden Seiten zu machen und lassen Raum um das Rohr Einlass und Auslass. Falls gewünscht, können mehrere Kanäle oder verschiedene Größen verwendet werden. </li><li> Schneiden Sie entlang der gezeichneten Kontur, so dass gerade, saubere Schnitte zu machen, dass kein Klebstoff ragt in den Kanal. </li><li> Reinigen Sie den Quarz gründlich mit Aceton oder Ethanol, um Klebstoff von der vorherigen Durchflusszelle Bau zu entfernen. </li><li> Finden Sie die beste Ausrichtung des Kanals skizzieren, entfernen Sie die eine Seite der Rückseite und setzt vorsichtig das Band auf den Quarz-Objektträger. Seien Sie vorsichtig, um das Band richtig auszurichten, da die Ein-und Auslass Löcher zu bleiben entsperrt brauchen. </li><li> Cut Rohrlängen für die Einlass-und Auslass der Durchflusszelle. Es hilft, die Ende der Röhre bei etwa einem 30 ° Winkel geschnitten, so dass das Rohr nicht drücken wird gegen die Kammer unten flach. Legen Sie die Rohre auf irgendeine Art von Unterstützung sie für die einfache Befestigung an der Messzelle in die nächsten Schritte zu suspendieren. </li><li> Spülen Sie die Streptavidin-beschichteten Deckglas gründlich mit Wasser ab und trocknen mit Druckluft. Denken Sie daran, dass nur eine Seite funktionalisiert wird, darauf achten, nicht das Deckglas umdrehen. Entfernen Sie die andere Seite der Band sichern und Ort der Quarz-Objektträger auf das Deckglas. </li><li> Leicht auf dem Deckglas drücken, um Push-out keine Luft in den Klebstoff der Falle. So vermeiden Sie Luftblasen immer in den Strömungskanal. </li><li> Verschließen Sie die Seiten der Kammer mit Epoxy. Legen Sie das ausgeschnittene Schlauch in die Löcher der Quarz und Dichtung in Stelle mit Epoxidharz. Dies muss für ein paar Minuten trocknen lassen. </li><li> Nach dem Trocknen beginnen Blockierung der Oberfläche, indem einige der entgasten Blockierungspuffer durch eine der Röhren. Ein 21-Gauge-Nadel passt perfekt in die 0,76 mm Schlauch. Flush ein paar Mal, um Luftblasen zu entfernen und damit die Kammer für mindestens eine halbe Stunde zu inkubieren. </li></ol> 4. Single-Molecule Replication Experiment Werkstoffe: Vorbereitet Flusskammer, SYTOX Orange, TIRF-Mikroskop, 532 nm Laser, CCD-Kamera, Computer mit der Bildaufnahme-Software, Rolling-circle DNA-Substrat, Replication Proteine <ol><li> Nach der Durchflusszelle blockiert wurde, ist alles bereit für die Einzel-Molekül-Experiment zu beginnen. </li><li> Nehmen Sie die Durchflusszelle und legen Sie es auf dem Mikroskoptisch. Halten Sie die Kammer in Platz mit Bühne Clips und sicher sein, dass der Strömungskanal geradeaus entlang der y-Achse positioniert ist. </li><li> Schließen Sie die Durchflusszelle Auslaufrohr der Spritzenpumpe mit einem größeren Durchmesser Anschluss Schlauch oder einer Nadel. Setzen Sie den Einlass in Blocking-Puffer und ziehen wieder auf die Spritze, um die Luft in den Schlauch zu entfernen. Eine sanfte Bewegung aus dem Auslaufrohr wird klar, keine Luftblasen in der Messzelle gefangen. </li><li> Von der Stammlösung DNA-Template zu 25 pM in 1 ml Blocking-Puffer. Durchfluss in die Kammer zu moderaten Durchfluss gute Flächendeckung von DNA ermöglichen. 0,025 ml / min für 30 Minuten gut funktioniert. Dies kann je nachdem, wie viele DNA-Moleküle auf der Oberfläche für jede Charge von Deckgläsern oder wie viele sind für das Experiment gewünscht variiert werden. </li><li> Sobald DNA ist in ausspülen, überflüssige DNA mit Blockierungspuffer. Wash für mindestens 200 Flow-Zelle Bände loswerden alle freien DNA. </li><li> Begin Entgasung der Replikation Puffer. Für die E. coli-Replikation Versuche, dies zu tun bei 37 ° C, um das Risiko von Blasen in der beheizten Flusskammer zu reduzieren. </li><li> Schalten Sie den Laser und Kamera. Die gekühlte CCD muss Temperatur zu erreichen, bevor es verwendet werden kann. </li><li> Wenn der Durchführung einer 37 ° C Experiment, schalten die Heizung auf. Seien Sie sicher, dass das Ziel ist in Kontakt mit der Durchflusszelle oder es wird ein Kühlkörper später. </li><li> Nach dem Waschen und der Entgasung kann die Reaktion hergestellt werden. Mix Nukleotide, DTT und SYTOX in die Replikation Puffer. Dann fügen Sie Proteine ​​und vorsichtig mischen. </li><li> Durchfluss des Reaktionsgemisches in die Messzelle. Diese Strömungsgeschwindigkeit muss ausreichend sein, um dsDNA strecken. Bei einem 2-mm breit, 100-um hohe Strömungskanal 0,04 ml / min gut funktioniert. </li><li> Nehmen Sie sich Zeit für das Gemisch in die Kammer eintreten und beginnen Bildgebung. Ein guter Tipp ist es, das Blickfeld auf die Seite des Kanals zu bewegen und sich auf den Klebstoff. Dadurch wird sichergestellt, Sie sind in der Nähe der Oberfläche zu fokussieren. </li><li> Passen Laserleistung, Mikroskop zu konzentrieren, und TIRF Winkel. Halten Sie die Leistung gering, um irgendeine Photospaltung der gefärbten DNA zu vermeiden. Erwerben Sie bei 1-5 Frames / Sekunde für einige Minuten in Abhängigkeit von der Rate der DNA-Replikation. Wenn gewünscht, wiederholen, um mehr Replikation Bahnen zu bekommen oder zu verschieben, um ein neues Feld mehr Moleküle sehen. </li><li> Nachdem das Reaktionsgemisch fast leer ist, ist es eine gute Idee, in mehr Puffer mit S flowYTOX um zu sehen, anderen Bereichen der Blick. Unter mehreren Bildern verschiedener repliziert Moleküle bietet Statistiken für Prozessivität Entschlossenheit. </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse Aktiv replizierenden Moleküle werden leicht als wachsenden Linien der gefärbten DNA gesehen. In unseren Experimenten, fließende 25 pM der M13 Substrat gibt 100-1000 Moleküle in einem 60x, 125 um x 125 um Sichtfeld (Abbildung 1). Performing Replikation Experimente mit dem E. coli replisome Proteine ​​bei 37 ° C (siehe Materialien für weitere Details) gibt 5-50 replizierenden Molekülen pro Gesichtsfeld. Bei vergleichbaren Konzentrationen der T7 replisome, die auf dem Substrat initiiert wesentlich effizienter, beobachten wir&gt; 70% der Moleküle in einem Feld zu replizieren. Diese Bedingungen ergeben ein Produkt Dichte so hoch, dass einzelne Moleküle schwer zu lösen und zu analysieren, so dass die T7 Experimente sind bei niedrigeren Proteinkonzentrationen durchgeführt. Datenanalyse: Um Tarifdaten, einfach Grundstück der Endpunkt der DNA gegen die Zeit und berechnen Sie die Steigung (Abbildung 2). Für Prozessivität, bestimmen die Gesamtlänge der DNA. Beide Zahlen werden sich an Basenpaare umgewandelt werden. Vor der Durchführung des Experiments, sollten Sie wissen, die Pixelgröße der Kamera an der richtigen Vergrößerung. Für Basenpaar Umwandlung ist eine gute Schätzung einfach konvertieren basierend auf den kristallographischen Länge der DNA, 2,9 bp / nm. Allerdings Laminar Flow wird nicht vollständig strecken die DNA, so dass ein DNA Längenkalibrierung, indem eine bekannte Länge DNA, zB 48.502 bp λ DNA, Befestigung an der Durchflusszelle mit einem biotinylierten Oligo und die Messung ihrer SYTOX gebeizt Länge an durchgeführt werden soll der Durchfluss für die Replikation Experiment verwendet. Ermittlung der Anzahl der Basenpaare / Pixel ermöglicht eine genaue Berechnung der Replikation Preise und processivities. Unter zahlreichen Bildern und Filmen liefert eine große Anzahl von Produkt-Molekül, so dass das Plotten von Geschwindigkeit und Prozessivität Distributionen (Abbildung 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1: (aus Lit. 1). A) Cartoon des Rolling-Circle-Replikation Assay. (SA, Streptavidin). Leading-Strang-Synthese erweitert den Schwanz Verknüpfung des Kreises und der Oberfläche. Der Schwanz ist an dsDNA durch die nacheilenden Strang Polymerase umgewandelt und streckte von Laminar-Flow. b) Beispiel-Sichtfeld mit SYTOX Orange und 532 nm Anregung. Kleine fluoreszierende Flecken angebunden werden, nicht repliziert Substraten. Beachten Sie die extreme Länge der Produkte und die große Anzahl der Produkte pro Feld (jeder Messzelle enthält&gt; 5000 solcher Felder). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2: (nach Lit. 1). A, b) Kymographs typischer replizierenden Molekülen aus T7 (a) und E. coli (b) Experimente. c) Endpoint Flugbahnen von Molekülen aus a) und b) aufgetragen gegen die Zeit. Trajektorien sind mit lineare Regression anzupassen, um die Replikation Preise zu erhalten. Gezeigten Beispiele sind 99,4 bp s -1 und 467,1 bp s -1. d) Länge Verteilungen der Replikation Produkte, mit Einzel-exponentiellen Anpassung an Prozessivität erhalten: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Rate Verteilungen der einzelnen Moleküls Bahnen, mit Einzel-Gauß-Fit. Mittel: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

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	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Eine kritische Kontrollpunkte prüft die Wirkung der Beize, SYTOX Orange, auf die Replikation Proteine ​​von Interesse. Ein einfacher Weg, dies zu tun ist, um die Replikation Experiment in der Messzelle, wie beschrieben, aber mit dem Wegfall der SYTOX durchzuführen. Nachdem die Reaktionsmischung durch die Kammer geflossen ist, fügen Puffer mit SYTOX auf DNA-Färbung und untersuchen die Länge Verteilung der replizierten Moleküle. Alternativ können Standard-Bulk-Reaktionen verwendet werden, um eine Wirkung von SYTOX auf die Replikation Geschwindigkeit und Effizienz zu überprüfen. Das hier beschriebene Experiment verwendet nur einen einzigen Strömungskanal. Dies kann leicht durch die Schaffung von Multi-Channel-Flow Kammern oder mit PDMS oder ähnliche mikrofluidischen Systemen geändert werden. Eine Erhöhung der Anzahl der Kanäle erleichtert Screening von Protein-Konzentrationen, Mutanten oder Inhibitor-Moleküle und erhöht die Geschwindigkeit der Replikation der Datenerhebung. Wie bereits erwähnt, führen wir die E. coli-Replikation Experimente bei 37 ° C mit Hilfe eines selbst gebauten Aluminium-flow-Heizgerät, ein Widerstandsheizelement (Heizpatrone) und variable Spannungsversorgung. Das gibt gute Temperaturstabilität und vermeidet den Kauf eines objektiven Heizung. Zur Kalibrierung der Heizung haben wir einfach ein Loch in der Mitte eines Quarz-Durchflusszelle oben gebohrt, eingefügt ein Thermoelement in den Strömungskanal und floss Puffer als normal. Die Messung der Durchflusszelle Puffer Temperatur bei zunehmender Spannungen ermöglicht eine präzise Heizung.

T7-Replikation: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM Kalium-Glutamat, 10 mM Magnesiumchlorid, 100 ug / mL BSA, mit 5 mM Dithiothreitol, 600 uM dNTPs, 300 nM ATP, 300 uM CTP und 15 nM SYTOX orange aufgenommen unmittelbar vor zu verwenden. Proteine ​​hinzugefügt: 5 nM gp4 (Hexamer), 40 nM-Polymerase (1:1 gp5: Thioredoxin), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli-Replikation: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM Magnesium-Acetat, 80 mM Kaliumchlorid, 100 ug / mL BSA mit 10 mM Dithiothreitol, 40 uM dNTPs, 200 nM rNTPs und 15 nM SYTOX orange aufgenommen unmittelbar vor dem Gebrauch. Proteine ​​hinzugefügt: 30 nM DnaB (Hexamer), 180 nM DNAC (Monomer), 30 nM αεθ, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ oder τ 3 δδ&#39;χψ, 30 nM β (Dimer), 300 nM DNAG, 250 nM SSB (Tetramer), 20 nM Pria, 40 nM Prib, 320 nM Pric, 480 nM dnaT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Wir beschreiben eine einfache Fluoreszenzmikroskopie-basierte Echtzeit-Methode zur Beobachtung der DNA-Replikation in der Einzel-Molekül-Ebene. Eine kreisförmige, Gabel DNA Vorlage wird auf einer funktionalisierten Deckglas befestigt und umfassend nach Einführung der Replikation Proteinen und Nukleotiden (Abbildung 1) repliziert. Die wachsende Produkt doppelsträngige DNA (dsDNA) ist mit Laminar-Flow erweitert und visualisiert mit Hilfe eines interkalierende Farbstoff. Die Messung der Position des wachsenden DNA-Ende in Echtzeit ermöglicht eine präzise Bestimmung der Replikation Rate (Abbildung 2). Darüber hinaus gibt die Länge der abgeschlossenen DNA-Produkte auf dem Prozessivität der Replikation. Dieses Experiment kann sehr einfach und schnell durchgeführt werden und erfordert nur ein Fluoreszenzmikroskop mit einer relativ empfindlichen Kamera.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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Research

JoVE Journal

Biology

22.3K Aufrufe.  Harvard Medical School. Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Serie: Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

Visualizing Einzelne molekulare Komplexe In Vivo Verwenden der erweiterten Fluoreszenzmikroskopie

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Forschung

Biologie

Automated System for Single Molecule Fluorescence Measurements of Surface-immobilized Biomolecules

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, such as nucleic acids and proteins. Single molecule FRET (sm-FRET) measurements on immobilized molecules permit long observations of the system -effectively until both dyes photobleach- resulting in time-traces that report on biomolecular dynamics with a broad range of timescales from milliseconds to minutes. To facilitate the acquisition of large number of traces for statistical analyses, the process must be automated and the sample environment should be tightly controlled over the entire measurement time (~12 hours). This is accomplished using an automated scanning confocal microscope that allows the interrogation of thousands of single molecules overnight, and a microfluidic cell that permits the controlled exchange of buffer, with restricted oxygen content and maintains a constant temperature throughout the entire measuring period. Here we show how to assemble the microfluidic device and how to activate its surface for DNA immobilization. Then we explain how to prepare a buffer to maximize the photostability and lifetime of the fluorophores. Finally, we show the steps involved in preparing the setup for the automated acquisition of time-resolved single molecule FRET traces of DNA molecules.

In this article we describe how we obtain FRET traces from individual DNA molecules immobilized to a surface using an automated scanning confocal microscope.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) microscopy has been widely used to study the structure and dynamics of molecules of biological interest, ...

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

Direkte Beobachtung von Enzymen Replizieren DNA Mit einem Single-Molekül DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Zeitraffer-Imaging der Mitose Nach siRNA-Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Zell Elektroschweißmuffe Visualisierte mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

Überwachung Plasmid-Replikation in lebenden Säugerzellen über mehrere Generationen durch Fluoreszenz-Mikroskopie

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Studying DNA Looping by Single-Molecule FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into nucleosomes. Thermodynamics of dsDNA bending has been studied by a method called cyclization which relies on DNA ligase to covalently join short sticky ends of a dsDNA. However, ligation efficiency can be affected by many factors that are not related to dsDNA looping such as the DNA structure surrounding the joined sticky ends, and ligase can also affect the apparent looping rate through mechanisms such as nonspecific binding. Here, we show how to measure dsDNA looping kinetics without ligase by detecting transient DNA loop formation by FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). dsDNA molecules are constructed using a simple PCR-based protocol with a FRET pair and a biotin linker. The looping probability density known as the J factor is extracted from the looping rate and the annealing rate between two disconnected sticky ends. By testing two dsDNAs with different intrinsic curvatures, we show that the J factor is sensitive to the intrinsic shape of the dsDNA.

This study presents a detailed experimental procedure to measure looping dynamics of double-stranded DNA using single-molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). The protocol also describes how to extract the looping probability density called the J factor.

Studieren von DNA-Looping von Einzelmolekül-FRET

Bending of double-stranded DNA (dsDNA) is associated with many important biological processes such as DNA-protein recognition and DNA packaging into ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizing Stromulus Frequenz mit Fluoreszenzmikroskopie

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

A method is described for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts in fixed bacteria for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH allows the measurement of cell-to-cell variability in mRNA copy number of genes of interest, as well as the subcellular location of the transcripts. The main steps involved are fixation of the bacterial cell culture, permeabilization of cell membranes, and hybridization of the target transcripts with sets of commercially available short fluorescently-labeled oligonucleotide probes. smFISH can allow the imaging of the transcripts of multiple genes in the same cell, with limitations imposed by the spectral overlap between different fluorescent markers. Following completion of the protocol illustrated below, cells can be readily imaged using a microscope coupled with a camera suitable for low-intensity fluorescence. These images, together with cell contours obtained from segmentation of phase contrast frames, or from cell membrane staining, allow the calculation of the mRNA copy number distribution of a sample of cells using open-source or custom-written software. The labeling method described here can also be applied to image transcripts with stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).

Method for Labeling Transcripts in Individual Escherichia coli Cells for Single-molecule Fluorescence In Situ Hybridization Experiments

This manuscript describes a method for labeling individual messenger RNA (mRNA) transcripts with fluorescently-labeled DNA probes, for use in single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) experiments in E. coli. smFISH is a visualization method that allows the simultaneous detection, localization, and quantification of single mRNA molecules in fixed individual cells.

Methode zur Kennzeichnung Transkripte in einzelnen Escherichia coli Zellen für Einzelmolekül-Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Experimente