Die Autoren äußern ihren aufrichtigen Dank Katie Fink und Lynn Dondlinger für ihre unschätzbare Hilfe bei der Vorbereitung dieser Handschrift.
Zuschuss: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; und #R01-HL128242.

Die Autoren haben keinen finanziellen Interessenkonflikt.

Wie in der Einleitung erwähnt, dieses Paper beschreibt die Verwendung von Fernsehen Mikroskopie und isolierten Widerstand Arterie Ansätze zur Bewertung der Gefäßfunktion nicht nur in standard Ratte-Modellen (wie im Video), aber auch in hochspezialisierten genetisch veränderter Ratte Stämme, die zeigen, das neuartige und leistungsfähige Einsichten, die unter Verwendung dieser Ansätze gewonnen werden können. Die Verwendung dieser leistungsfähigen Techniken, aktive Ton zu bewerten und passiv mechanischen Eigenscha...

Die frühesten Studien der Gefäßfunktion in Arterien verwendet Conduit Arterien und in vielen Fällen die Aorta. Krafterzeugung in großen Arterien wurde in der Regel untersucht, durch das Anbringen eines Ring-Segments der Arterie zu einem Kraftaufnehmer in einem Gewebe-Bad; bei der Aorta Streifen durch Schneiden spiralförmige des Schiffes, so dass der glatten Muskelfasern in Längsrichtung zwischen den Punkt der Anlage und der Kraftaufnehmer, zu den besten Schätzwert für die Kraft, die durch Kontraktion der orientiert waren die glatte Muskulatur entlang seiner Längsachse. Die Standardtechnik für das Schneiden von spiralförmigen Streifen der Hauptschlagadern war, legen Sie einen Glasstab in das Lumen des Gefäßes, machen Sie einen Schnitt in der Gefäßwand im gewünschten Winkel und halten bis zum Ende der exponierte Kante der Gefäßwand, wie der Schnitt verlängert wurde, um ein Ganzes zu produzieren spiralförmigen Streifen des Schiffes. Zu diesem Zeitpunkt die endotheliale Seite des Schiffes war in der Regel ausgelöscht, um Ablagerungen zu entfernen, vor Befestigung des Schiff-Streifens zu Kraftaufnehmers und Eintauchen der Vorbereitung in Sauerstoff und Temperatur gesteuert Gewebe Bad. Schließlich, dass Ansatz zu einem der bekanntesten und wichtigsten Entdeckungen in der Geschichte der Physiologie von Furchgott und Zawadski1, nämlich die Rolle des Endothels führte abgeleitet entspannende Faktor (EFRE), anschließend identifiziert als Stickstoffmonoxid, in Regulierung der Gefäßfunktion. Das entscheidende Ereignis zu dieser Entdeckung war eine Situation, in der die Ermittler eine intakte Endothel durch Vermeidung des Kontakts der endothelialen Seite der Arterie mit ausländischen Oberflächen beibehalten, und bemerkte, dass der Aorta Streifen nicht die erwarteten aufweisen, Kontraktion von Acetylcholin (ACh), aber stattdessen entspannt als Reaktion auf ACh. Basierend auf dieser Beobachtung, die Ermittler entwickelt eine "Sandwich"-Vorbereitung, in der sie eine Aorten-Segment mit einem intakten Endothel (aber nicht in der Lage, Kontraktionskraft zu generieren) angebracht, zu einem standard spiralförmigen Streifen der Aorta und konvertiert die ACh-induzierte Kontraktion in eine Entspannung.
Zwei bedeutende Fortschritte auf diesem Gebiet, das heute weitgehend benutzt werden sind die Entwicklung von Präparaten Messen aktiv Kontraktionskraft in kleinen Widerstand Arterien2,3 (z. B. im Darm Mesenterium3 ) und kanülierte Widerstand Arterie Vorbereitungen4,5,6. In einer der frühesten Berichte, Mulvany und Halpern3 beschriebenen Verwendung der Draht Myograph Zubereitung, aktive Kontraktionskraft in isolierten Widerstand Arterien aus dem Darm Mesenterium spontan Hypertensive Ratten (SHR) zu studieren und normotonen WKY Kontrollen. Im Anschluss an die Entwicklung des Systems der Draht Myograph waren kanülierte Widerstand Arterie Präparate entwickelt, um Studien der Schiffe näher, die in Vivo Bedingungen4,5,6zu ermöglichen.  Während beide Ansätze wertvolle Ergebnisse zu liefern, hat die kanülierte Arterie Vorbereitung die zusätzlichen Vorteile von mehr effektiv Erhaltung intrinsische aktiv Ton in den Arterien; und so die Ermittler, aktive myogen Reaktionen auf Veränderungen im Transmural Druck und Schiff Reaktionen auf Veränderungen in der Durchflussmenge und endotheliale Schubspannung zu studieren (siehe Beitrag von Halpern und Kelley6).
Ein wesentliches Ziel der vorliegenden Arbeit soll beschreiben, wie die altehrwürdige Technik der Videomikroskopie mit isolierten, kanülierte Widerstand Arterien um genaue Informationen über die Mechanismen zu gewinnen, die aktiv Ton in dieser entscheidenden Regeln beschäftigen Schiffe, unabhängig von Einflüssen der neuronalen, humorale oder parenchymatösen Zelle. Diese Basisinformationen, mit einem standard Rattenmodell und Beispiele aus unseren Studien von neu genetisch engineered Ratte Stämme, vermitteln dem Leser eine Vorstellung von den Arten der Erkenntnisse bezüglich Gefäßfunktion, die mit dem Fernsehen gewonnen werden können Mikroskopie-Ansätze und die eingesetzt werden können, in Studien mit jeder Kontrolle und experimentelle Gruppe(n) der Ermittler zu wählen, darunter mächtige neue experimentelle Ratte Modelle produziert durch gezielte Inzucht und neu entwickelte genetische Engineering-Techniken.
Dank der Präzision des Fernsehens Mikroskopie Ansätze bieten Messung von Durchmesserwechsel kanülierte Arterie Vorbereitungen sehr wertvolle Informationen über Endothel-abhängigen und Endothel-unabhängige Mechanismen der vaskulären Entspannung, als auch wichtige (und manchmal unerwartete) Veränderungen der vaskulären Kontrollmechanismen, die mit Bluthochdruck, hohe salzarme Kost und andere experimentellen Interventionen. Darüber hinaus Messung von Druck-Durchmesser Beziehungen in isoliert und kanülierte Widerstand Arterien, die durch die Behandlung mit Ca2 +maximal entspannt sind-freie Lösung oder eine pharmakologische gefäßerweiternde Medikament, ermöglicht es den Prüfer bewerten strukturelle Veränderungen in den Arterien durch vaskuläre remodeling und passive Spannungs-Dehnungs-Beziehungen-7 zu berechnen, die wichtige Erkenntnisse Änderungen in die passive mechanische Eigenschaften der Arterien bieten kann, die arterielle Funktion beeinflussen können unabhängig von (oder zusätzlich zu) ändert sich der aktive Kontrollmechanismen. Es ist auch wichtig zu beachten, dass Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien durch Informationen, die Verwendung von LDF, eine praktische Methode für die Bewertung der Gewebedurchblutung an das ganze Tier Level8,9 ergänzt werden können ,10, und durch kapilläre Dichte mit Gewebekulturen gekennzeichneten GS1 Lektin Bewertung gewonnenen Informationen, die spezifisch bindet an Glykoprotein Moieties in der Basalmembran der kleinen Arteriolen und Kapillaren11 , 12. letztere Methode ermöglicht eine sehr genaue Schätzung kapilläre Dichte, die nicht die klassische Schwierigkeiten bei der Abschätzung der kapilläre Dichte durch Schiffe in Vivo, z. B. fehlende nicht durchblutet zählen unterliegt Schiffe, wo die Durchblutung durch aktive Schließung der Arteriolen gestoppt ist. Wenn Sie zusammen verwendet, bieten diese Ansätze wichtige Erkenntnisse zum funktionelle Veränderungen in isolierten Widerstand Arterien zu Veränderungen der Gewebedurchblutung Ebene der mikrozirkulatorischen korrelieren; und einige Beispiele für die Verwendung dieser wertvolle Ansätze in Verbindung mit kanülierte Arterie Techniken erhalten Sie auch in der vorliegenden Handschrift.
Der vorliegende Beitrag konzentriert sich auf die Verwendung von Techniken der Videomikroskopie, vaskuläre Veränderungen in den Arterien von fremd-Sprague-Dawley Ratten zu bewerten. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass diese Techniken sehr wertvoll in Aufklärung phänotypische Veränderungen in hochspezialisierten gentechnisch Ratte Stämme erstellt durch selektive Züchtung oder gen Bearbeitung mit Hilfe von Techniken bewährt haben. In diesem Manuskript stellen wir Beispiele dafür, wie video Mikroskopiertechniken wichtige Informationen bezüglich Gefäßfunktion in einer Reihe von wertvollen Rat zur Verfügung gestellt haben-Modelle, darunter die Dahl Salz-Sensitive (SS) Ratte-eine Inzucht Ratte Belastung, die die am weitesten verbreitete ist experimentelles Modell verwendet untersuchen die Mechanismen von Salz sensible Hypertenson18,19,20,21,22,23; und Consomic Ratten durch selektive Züchtung von SS Ratten mit dem Salz-unempfindliche braun Norwegen (BN) Ratte Stamm erstellt. Jedes Chromosom aus Braun Norwegen Ratte wurde in der Consomic-Ratte-Panels Introgressed einzeln in den Dahl SS24,25,26 genetischen Hintergrund. Verwendung von Consomic Ratte Platten lieferte wertvolle Hinweise auf bestimmten Chromosomen, die Salz Empfindlichkeit der Blutdruck und anderen Phänotypen, darunter vaskuläre Reaktivität24,25,26 beitragen ,27,28.
Selektive Zuchtstrategien nutzen SS Ratten und Consomic Ratten tragen einzelne BN Chromosomen konnten auch die Generation der verengten Congenic Stämme mit kleinen Segmenten der einzelnen braun Norwegen Chromosomen Introgressed in die genetische Dahl-SS Hintergrund22,29. Diese können extrem wertvollen input auf bestimmte Gene oder schmale Regionen der Chromosomen, die entscheidende physiologischen Variablen, z. B. Blutdruck, Nierenschädigung und vaskuläre Reaktivität22,29beeinflussen können. Eine weitere leistungsstarke Ergänzung zu der Ratte genetische Toolbox ist die Entwicklung von Ratte gen Knockout Modelle nutzen fortschrittliche gen Bearbeitung Techniken einschließlich ZFN, transcriptional Aktivator-artigen-Effektor Nukleasen (TALENS), und zuletzt CRISPR-Cas913 ,14,15,16,17. Das Aufkommen dieser mächtigen Techniken, mit denen Gene bei der Ratte geschlagen werden können ist eine immens wichtige Entwicklung, weil gen Knockout Studien bisher verwendet haben (und weiterhin verwenden) Mäuse fast ausschließlich. Eine weitere experimentelle Komponente in der vorliegenden Arbeit zeigt die Bedeutung von kanülierte Arterie Techniken und Videomikroskopie, physiologische Kontrollmechanismen bei Knockout Ratten fehlt die master Antioxidans und Zelle schützende Transkription zu bewerten Faktor, nukleare Faktor (2 erythroiden abgeleitet) - wie - 2 (NRF2)30,31, die mit TALEN Technologie in Sprague-Dawley genetischen Hintergrund17entwickelt wurden. In-vitro- Videomikroskopie Techniken wurden in diesen Experimenten Verlust des Gens NRF2 funktionale nachzuweisen und einen potentiell wertvollen therapeutischen Ansatz basierend auf direkte Hochregulation von NRF2-vermittelten Antioxidans zu testen verwendet. Abwehrkräfte. NRF-2 ist der erhebliche therapeutische Bedeutung Bekämpfung vaskulären oxidativen Stress in den Menschen angesichts der enttäuschenden Ergebnisse der klinischen Studien mit direkten Verwaltung von Antioxidantien wie Vitamine C und E32.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SS Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS/JHsd/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.5BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 5BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS.13BN Consomic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS-Chr 13BN/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-BN Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSA Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ren1-SSB Congenic Rat</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates</td>
			<td>Medical College of Wisconsin</td>
			<td>SD-Nfe212em1Mcwi strain</td>
			<td>Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113755</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A</td>
			<td>Dyets, Inc.</td>
			<td>113756</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colorado Video Caliper</td>
			<td>Colorado Video, Inc.</td>
			<td>Model 308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Video Camera</td>
			<td>Hitachi</td>
			<td>KPM1AN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Television Monitor</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>WVBM1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Transducers</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>56360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Pressure Display Unit</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>50115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannulated Artery Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>CH-1</td>
			<td>Single vessel chamber for general use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Controller for Single Chamber</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>TC-09S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>GD-MS</td>
			<td>Provides aeration in the vessel bath</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exchange Oxygenator, Miniature</td>
			<td>Living Systems Instrumentation</td>
			<td>OX</td>
			<td>Allows gas exchange with perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser-Doppler Flowmeter</td>
			<td>Perimed</td>
			<td>PeriFlux 5000 LDPM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GS1 Lectin</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>RL-1102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tubes for Micropipettes</td>
			<td>Fredrich Haer Co.</td>
			<td>27-33-1</td>
			<td>2 mm ODX1 mm ID</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verticle Pipette Puller</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 700C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon suture material (10/0)-3 PLY</td>
			<td>Ashaway Line and Twine Manufacturing Co.</td>
			<td>114-ANM-10</td>
			<td>Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps-Inox</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15003-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protandim</td>
			<td>Protandim</td>
			<td></td>
			<td>NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S233-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose (d-glucose) anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>D16-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M1880-500 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl)</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>P217-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>ED255-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

evaluation of vascular control mechanisms utilizing video microscopy of isolated resistance arteries of rats

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von in-vitro- Fernsehen Mikroskopie auszuwertende Gefäßfunktion in isolierte zerebrale Widerstand Arterien (und andere Schiffe) und beschreibt Techniken für die Bewertung der Gewebedurchblutung mit Laser Doppler Flowmetry (LDF ) und kapilläre Dichte Nutzung Eindringmittel beschriftet Griffonia Simplicifolia (GS1) Lektin. Aktuelle Methoden zur Untersuchung isoliert Widerstand Arterien an Transmural Druck begegnet in Vivo und in Ermangelung von parenchymatösen Zelle Einflüsse stellen ein wichtiges Bindeglied zwischen in-Vivo -Studien und Erkenntnissen aus molekularen reduktionistische Ansätze, die begrenzten in integrative Antworten auf die ganze Ebene Einblick. LDF und Techniken, um selektiv Arteriolen und Kapillaren mit Gewebekulturen beschriftet GS1 Lektin identifizieren bieten praktische Lösungen für Ermittler, die Erkenntnisse aus Studien der isolierten Widerstand Arterien erweitern können. Dieses Whitepaper beschreibt die Anwendung dieser Techniken, grundlegende Kenntnisse der vaskulären Physiologie und Pathologie in der Ratte als allgemeines experimentelles Modell zu gewinnen, und in einer Vielzahl von spezialisierten gentechnisch verändert "Designer" Ratte-Stämme, die bieten kann wichtige Erkenntnisse über den Einfluss bestimmter Gene auf wichtige vaskulären Phänotypen. Nutzen diese wertvolle experimentelle Ansätze in der Ratte Stämme durch selektive Zuchtstrategien und neue Technologien für die Herstellung von gen-Knockout-Modelle bei der Ratte entwickelt dehnt die strenge der wissenschaftlicher Räumlichkeiten in Knockout-Maus-Modellen entwickelt und Dieses Wissen zu mehr relevanten Tiermodell, mit einem gut verständlichen physiologischen Hintergrund und Eignung für physiologische Untersuchungen aufgrund seiner Größe zu erweitern.

In-vitro- Mikroskopie der kanülierte Widerstand Arterien ermöglicht die Untersuchung von Einflussfaktoren auf aktive Ton in kleinen Widerstand Arterien (und größeren Arteriolen) bei normalen in Vivo Transmural drücken und bei fehlender parenchymatösen Zelle beeinflusst. Neben der Beurteilung der Reaktivität der Schiffe auf verschiedene gefäßerweiternde und vasokonstriktorische Reize und myogen Antworten auf Transmural Druck Erhebung im normalen PSS, die Ca2...

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Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Bewertung der vaskulären Kontrollmechanismen Nutzung Videomikroskopie der isolierten Widerstand Arterien von Ratten

This protocol describes the use of in vitro television microscopy to evaluate vascular function in isolated cerebral resistance arteries (and other ...

evaluation-vascular-control-mechanisms-utilizing-video-microscopy

Research

JoVE Journal

Medicine

9.2K Aufrufe.  Marquette University. Dieses Manuskript beschreibt in Vitro Videomikroskopie Protokolle für die Bewertung der Gefäßfunktion in Ratte zerebralen Widerstand Arterien. Das Manuskript beschreibt auch Techniken für die Bewertung der kapilläre Dichte mit Gewebekulturen beschrifteten Lektine und Gewebe Perfusion mit Laser-Doppler-Flowmetry.

Serie: Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats

Accurate and Simple Evaluation of Vascular Anastomoses in Monochorionic Placenta using Colored Dye

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia polycythemia sequence (TAPS)1,2. Injection studies of twin placentas have shown that such anastomoses are almost invariably present in monochorionic twins and extremely rare in dichorionic twins1. Three types of anastomoses have been documented: from artery to artery, from vein to vein and from artery to vein. Arterio-venous (AV) anastomoses are unidirectional and are referred to as "deep" anastomoses since they proceed through a shared placental cotyledon, whereas arterio-arterial (AA) and veno-venous (VV) anastomoses are bi-directional and are referred to as "superficial" since they lie on the chorionic plate. Both TTTS and TAPS are caused by net imbalance of blood flow between the twins due to AV anastomoses. Blood from one twin (the donor) is pumped through an artery into the shared placental cotyledon and then drained through a vein into the circulation of the other twin (the recipient). Unless blood is pumped back from the recipient to the donor through oppositely directed deep AV anastomoses or through superficial anastomoses, an imbalance of blood volumes occurs, gradually leading to the development of TTTS or TAPS. The presence of an AA anastomosis has been shown to protect against the development of TTTS and TAPS by compensating for the circulatory imbalance caused by the uni-directional AV anastomoses1,2. 
Injection of monochorionic placentas soon after birth is a useful mean to understand the etiology of various (hematological) complications in monochorionic twins and is a required test to reach the diagnosis of TAPS2. In addition, injection of TTTS placentas treated with fetoscopic laser surgery allows identification of possible residual anastomoses3-5. This additional information is of paramount importance for all perinatologists involved in the management and care of monochorionic twins with TTTS or TAPS. Several placental injection techniques are currently being used. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of (residual) vascular anastomoses using colored dye injection.

Twin-to-twin transfusion syndrome and twin anemia polycythemia sequence are two potentially devastating problems in perinatal medicine. Both disorders occur only in monochorionic twins and result from unbalanced blood flow through placental vascular anastomoses. We provide a simple protocol to accurately evaluate the presence of vascular anastomoses using colored dye injection of placental vessels after birth.

Präzise und einfache Auswertung der Gefäßanastomosen in Monochoriale Placenta mit Farbstoff

The presence of placental vascular anastomoses is a conditio sine qua non for the development of twin-to-twin transfusion syndrome (TTTS) and twin anemia ...

Forschung

Medizin

Training a Sophisticated Microsurgical Technique: Interposition of External Jugular Vein Graft in the Common Carotid Artery in Rats

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in peripheral arterial bypass surgery as well as in arteriovenous fistulas.1-5 The experimental procedure of vein graft interposition in the common carotid artery by using the cuff-technique has been applied in several research projects to examine the aetiology of neointimal hyperplasia and therapeutic options to address it. 6-8 The cuff prevents vessel anastomotic remodeling and induces turbulence within the graft and thereby the development of neointimal hyperplasia.
Using the superior caval vein graft is an established small-animal model for venous arterialization experiment.9-11 This current protocol refers to an established jugular vein graft interposition technique first described by Zou et al., 9 as well as others.12-14 Nevertheless, these cited small animal protocols are complicated.
To simplify the procedure and to minimize the number of experimental animals needed, a detailed operation protocol by video training is presented. This video should help the novice surgeon to learn both the cuff-technique and the vein graft interposition. Hereby, the right external jugular vein was grafted in cuff-technique in the common carotid artery of 21 female Sprague Dawley rats categorized in three equal groups that were sacrificed on day 21, 42 and 84, respectively. Notably, no donor animals were needed, because auto-transplantations were performed. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice. In addition, the graft patency rate was 60 % for the first 10 operated animals and 82 % for the remaining 11 animals. The blood flow at the time of sacrifice was 8&plusmn;3 ml/min. In conclusion, this surgical protocol considerably simplifies, optimizes and standardizes this complicated procedure. It gives novice surgeons easy, step-by-step instruction, explaining possible pitfalls, thereby helping them to gain expertise fast and avoid useless sacrifice of experimental animals.

Neointimal hyperplasia is the primary cause of stenosis in arterialized veins. We propose a new protocol whereby the right external jugular vein is grafted using the cuff technique in the common carotid artery of Sprague Dawley rats. The survival rate was 100 % at the time point of sacrifice.

Trainieren eines Sophisticated mikrochirurgische Technik: Interposition der Vena jugularis externa Graft in der Arteria carotis communis bei Ratten

Neointimal hyperplasia is one the primary causes of stenosis in arterialized veins that are of great importance in arterial coronary bypass surgery, in ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Beurteilung Myogenic Antwort und Vasoaktivität In Resistance Mesenterialarterien Mit Druck Myographie

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Intravital Video Microscopy Measurements of Retinal Blood Flow in Mice

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered perfusion can aid research into the mechanisms of retinal pathologies. Intravital video microscopy of fluorescent tracers can be used to measure vascular diameters and bloodstream velocities of the retinal vasculature, specifically the arterioles branching from the central retinal artery and of the venules leading into the central retinal vein. Blood flow rates can be calculated from the diameters and velocities, with the summation of arteriolar flow, and separately venular flow, providing values of total retinal blood flow. This paper and associated video describe the methods for applying this technique to mice, which includes 1) the preparation of the eye for intravital microscopy of the anesthetized animal, 2) the intravenous infusion of fluorescent microspheres to measure bloodstream velocity, 3) the intravenous infusion of a high molecular weight fluorescent dextran, to aid the microscopic visualization of the retinal microvasculature, 4) the use of a digital microscope camera to obtain videos of the perfused retina, and 5) the use of image processing software to analyze the video. The same techniques can be used for measuring retinal blood flow rates in rats.

Intravital microscopy can be used in animals to visualize and measure retinal vascular diameters, bloodstream velocities, and total retinal blood flow.

Alterations in retinal blood flow can contribute to, or be a consequence of, ocular disease and visual dysfunction. Therefore, quantitation of altered ...

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical specimens, have been applied to uncover these resistance mechanisms to facilitate follow-up care. Although these approaches have led to clinically relevant discoveries, difficulties in attaining the relevant patient material or in deconvoluting the genomic data collected from these specimens have severely hampered the path towards a cure. To this end, we here describe a tool for expeditious discovery that may guide improvement in first-line therapies and alternative clinical management strategies. By coupling preclinical in vitro or in vivo drug selection with next-generation sequencing, it is possible to identify genomic structural variations and/or gene expression alterations that may serve as functional drivers of resistance. This approach facilitates the spontaneous emergence of alterations, enhancing the probability that these mechanisms may be observed in the patients. In this protocol we provide guidelines to maximize the potential for uncovering single nucleotide variants that drive resistance using adherent lines.

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

Drug resistance to targeted therapeutics is widespread and the need to identify mechanisms of resistance--prior to or following clinical onset--is critical for guiding alternative clinical management strategies. Here, we present a protocol to couple derivation of drug-resistant lines in vitro with sequencing to expedite discovery of these mechanisms.

Implementierung von<em&gt; In-vitro-</em&gt; Drug Resistance Assays: Maximierung des Potenzials für die Aufdeckung klinisch relevanter Resistenzmechanismen

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

Ultrasound Assessment of Flow-Mediated Dilation of the Brachial and Superficial Femoral Arteries in Rats

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of endothelial function can be achieved by employing the flow-mediated dilation technique, typically performed in the brachial or superficial femoral artery. Briefly, a blood pressure cuff placed distal to an ultrasound probe is inflated to a suprasystolic pressure, which results in limb ischemia. After 5 min of occlusion the cuff is deflated, resulting in reactive hyperemia and increases in wall shear rate that signal vasodilatory molecules to be released from the endothelium eliciting vasodilation. Despite the thousands of studies performing flow-mediated dilation in humans, surprisingly, no studies have performed this technique non-invasively in living rats. Considering the recent shift in focus to translational research, the establishment of guidelines for non-invasive measurement of flow-mediated dilation in rats and other rodents would be extremely valuable. In the following article, a protocol is presented for the non-invasive measurement of flow-mediated dilation in brachial and superficial femoral arteries of rats, as those sites are most commonly measured in humans.

Non-invasive assessment of endothelial function in humans can be determined by the flow-mediated dilation technique. Although thousands of studies have used this technique, no study has performed this technique non-invasively in rats. The following article describes non-invasive measurement of flow-mediated dilation in the brachial and superficial femoral arteries of rats.

Ultraschall Beurteilung der Fluss Mediated Dilation des Brachial und Oberflächliche Femoralarterie in Ratten

Arterial vasodilation to increases in wall shear rate is indicative of vascular endothelial function. In humans, the non-invasive measurement of ...

Using the Sleeve Technique in a Mouse Model of Aortic Transplantation - An Instructional Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the aorta in mice using the sleeve method was short and easy averaging 20 min, permitting studies of iso/allo grafts. The following article describes the aortic transplantation procedure used in our laboratory. The mice were anesthetized with a mixture of 1.5% volume isoflurane and 100% oxygen through a face mask. At this point, the segment of the aorta between the renal arteries and its bifurcation was separated from the vena cava, freely prepared and clampedat the proximal and distal segments with a single silk suture. Prior to the removal of the aorta, a saline solution containing heparin was injected into the inferior vena cava. Then the aorta was cut between the clamps and a saline heparin solution was used to flush the lumen. The sleeve technique with monofilament sutures was used in order to transplant the abdominal aorta in the orthotopic position.

We present an orthotopic aortic transplantation model using the sleeve technique in mice. It is a very rapid anastomosis method, which can be employed in studies of vascular disease.

Mit Hilfe der Sleeve-Technik in einem Mausmodell der Aorta Transplantation - ein Lehr-Video

Orthotopic aortic transplantation using the sleeve technique reduces injury to the aorta with failure rate of only 10-20%. The time to anastomose the ...

A Cell Culture Model of Resistance Arteries

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and signaling processes that can control vascular tone and blood pressure. As it is a projection from either the endothelial or smooth muscle cell, and due to its small size (on average, an area of ~1 &#181;m2), the MEJ is difficult to study in isolation. However, we have developed a cell culture model called the vascular cell co-culture (VCCC) that allows for in vitro MEJ formation, endothelial cell polarization, and dissection of signaling proteins and processes in the vascular wall of resistance arteries. The VCCC has a multitude of applications and can be adapted to suit different cell types. The model consists of two cell types grown on opposite sides of a filter with 0.4 &#181;m pores in which the in vitro MEJs can form. Here we describe how to create the VCCC via plating of cells and isolation of endothelial, MEJ, and smooth muscle fractions, which can then be used for protein isolation or activity assays. The filter with intact cell layers can be fixed, embedded, and sectioned for immunofluorescent analysis. Importantly, many of the discoveries from this model have been confirmed using intact resistance arteries, underscoring its physiological relevance.

A cell culture model of resistance arteries is described, allowing for the dissection of signaling pathways in endothelium, smooth muscle, or between endothelium and smooth muscle (the myoendothelial junction). The selective application of agonists or protein isolation, electron microscopy, or immunofluorescence can be utilized using this cell culture model.

Eine Kultur Zellmodell der Widerstand Arterien

The myoendothelial junction (MEJ), a unique signaling microdomain in small diameter resistance arteries, exhibits localization of specific proteins and ...

Mechanisms Underlying Gut Hormone Secretion Using the Isolated Perfused Rat Small Intestine

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, nutrient absorption and distribution, and post-prandial glucose excursions. Understanding the molecular mechanisms that regulate gut hormone secretion is fundamental for understanding and translating gut hormone physiology. Traditionally, the mechanisms underlying gut hormone secretion are either studied in vivo (in experimental animals or humans) or using gut hormone-secreting primary mucosal cell cultures or cell lines. Here, we introduce an isolated perfused rat small intestine as an alternative method for studying gut hormone secretion. The virtues of this model are that it relies on the intact gut, meaning that it recapitulates most of the physiologically important parameters responsible for the secretion in in vivo studies, including mucosal polarization, paracrine relationships and routes of perfusion/stimulus exposure. In addition, and unlike in vivo studies, the isolated perfused rat small intestine allows for almost complete experimental control and direct assessment of secretion. In contrast to in vitro studies, it is possible to study both the magnitude and the dynamics of secretion and to address important questions, such as what stimuli cause secretion of different gut hormones, from which side of the gut (luminal or vascular) is secretion stimulated, and to analyze in detail molecular sensors underlying the secretory response. In addition, the preparation is a powerful model for the study of intestinal absorption and details regarding the dynamics of intestinal absorption including the responsible transporters.

Here, we present a powerful and physiological model to study the molecular mechanisms underlying gut hormone secretion and intestinal absorption &#8212; the isolated perfused rat small intestine.

Mechanismen, die Hormonausschüttung der Darm mit der isolierten durchblutet Ratte Dünndarm

The gut is the largest endocrine organ of the body, producing more than 15 different peptide hormones that regulate appetite and food intake, digestion, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via recanalization of the coronary artery is the most effective strategy for reducing the size of ischemic myocardium. The coronary microvasculature cannot be visualized and imaged&#160;in vivo, but there are several invasive and noninvasive techniques that can be used to assess parameters which depend directly on coronary microvascular function. The endothelial function after ischemia reperfusion can be assessed also at the level of the coronary circulation via the coronary flow reserve (CFR).&#160;In this study, peak velocity of left anterior descending (LAD) coronary arteries was measured in rats in vivo via Transthoracic Doppler Echocardiography during resting and stress challenge (induced by Dobutamine). A normal heart can increase its coronary blood flow up to four times above the resting values during stress induction. Following ischemia reperfusion, we found a significantly diminished CFR, which can be used as a marker of coronary microvascular dysfunction. CFR has opened a window on the importance of microvascular dysfunction and has been shown to predict cardiovascular risk independent of whether the severe obstructive disease is present.

Coronary flow reserve (CFR), is defined as the ratio of maximal coronary blood flow to the resting coronary blood flow. We present a protocol for evaluating CFR in rats via ultrasound, which offers the opportunity to predict cardiovascular risk factors in the absence of obstructive coronary disease.

Bewertung des koronaren Flussreservats nach Myokard-Ischämie-Reperfusion bei Ratten

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...