Es ist ein sehr strenges Protokoll erforderlich, damit wir Präparate von denselben Tieren oder von verschiedenen Tieren oder Arterien in Gegenwart oder Abwesenheit des Fettes, das sie umgibt, oder in Gegenwart oder Abwesenheit des Endothels wirksam vergleichen können. Der Hauptvorteil dieser experimentellen Technik besteht darin, dass wir Ringe derselben Arterie unter isometrischen Bedingungen vergleichen und so stichhaltige Rückschlüsse auf die Auswirkungen der von uns untersuchten experimentellen Faktoren ziehen können. Dieses Protokoll liefert Einblicke in die Modulation der vaskulären Reaktionsfähigkeit durch perivaskuläre Fettgewebe verschiedener genetisch veränderter Tiere.
Adipose Gewebe Funktionsstörungen stellen einen unabhängigen Risikofaktor für Bluthochdruck und die damit verbundenen kardiovaskulären Komplikationen. Unser Myograph beinhaltet mehrere komplizierte Schritte, die an jedem Punkt äußerste Vorsicht erfordern, um eine Beschädigung des Behälters zu vermeiden, insbesondere während der Montage, und um sicherzustellen, dass das Schiff angemessen auf verschiedene Reize reagiert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit Vorbereitungen und Zerlegung der mesenterischen Arterienringe, wie im Textprotokoll beschrieben.
Schalten Sie den Computer ein und öffnen Sie die Datenaufzeichnungssoftware. Speichern Sie das Experiment als Lab-Diagramm-Datendatei mit einem neuen Namen, um das Überschreiben der ursprünglichen Einstellungsdatei zu vermeiden. Öffnen Sie das Fenster mit den Normalisierungseinstellungen, und legen Sie den K-Faktor auf eins fest.
Akzeptieren Sie die Standardwerte für IPs-Kalibrierung, Zieldruck, Online-Mittelungszeit und Verzögerungszeit. Klicken Sie auf OKAY, um die Einstellungen zu speichern. Wählen Sie Kanäle aus, die den Drahtdurchmesser, die Gewebeendpunkte und den ersten Mikrometerwert im Normalisierungsfenster verwenden.
Um den Normalisierungsvorgang zu starten, wenden Sie die erste passive Dehnung auf das Blutgefäß an, indem Sie die Mikrometerschraube gegen den Uhrzeigersinn drehen. Nachdem Sie drei Minuten gewartet haben, bis sich das Gefäß stabilisiert hat, geben Sie den neuen Mikrometerwert in das Normalisierungsfenster ein. Die Wandspannung wird automatisch berechnet und als Punkt im Diagramm dargestellt.
Ersetzen Sie nach jeder passiven Dehnung den Kontrollkrebspuffer durch einen iso-osmotischen Kaliumhochkaliumkrebs, der 150 Millimolar Kaliumchlorid enthält. Wenn die Kontraktion ein Plateau bei etwa drei Minuten erreicht, erfassen Sie die aktive Kraft, indem Sie die passive Kraft bei jeder Strecke von der Kalium-aktivierten Kraft subtrahieren. Berechnen Sie die Wandspannung sowie die inneren Umfangswerte.
Entfernen Sie den hohen Kaliumzustand, indem Sie den hohen Kaliumpuffer durch einen frischen Krebspuffer ersetzen. Waschen Sie dreimal über fünf Minuten. Wiederholen Sie die Normalisierungsschritte, indem Sie passive Dehnungen, gefolgt von aktiver Kontraktion in wechselnden Kurven, dann induzieren, bis die aktive Spannung zu abnehmen beginnt.
Den hohen Kaliumkrebspuffer gründlich auswaschen und die Präparate für weitere 30 bis 45 Minuten ausdemieren. Setzen Sie die Basalspannungen auf Null zurück, sodass während des folgenden Experiments nur aktive kontraktile Reaktionen aufgezeichnet werden. Vorbereiten und montieren Sie gepaarte Arterienringe, wie im Textprotokoll beschrieben, aus den angrenzenden Abschnitten jeder Arterie.
Bereiten Sie einen Arterienring mit PVAT intakt und der andere mit PVAT entfernt. Nach der Normalisierung die arteriellen Segmente mit hohem Kaliumkrebspuffer vorzutragen, indem 115 Millimolar Kaliumchloridlösung in die Kammer mit Krebs gegeben wird. Nach der Kontraktion auf die Plateauperiode das hohe Kalium auswaschen und den Puffer durch einen frisch belüfteten Krebspuffer ersetzen.
Dreimal über fünf Minuten waschen. Wiederholen Sie die Kaliumchloridstimulation und das Waschen dreimal und zeichnen Sie die maximale kontraktile Reaktion auf Kaliumchlorid auf, indem Sie die Ausgangsspannung von der Spannung aufgrund der Kaliumchloridstimulation subtrahieren. Nach der letzten Kontraktion und dem Waschen die Kammer mit einem warmen, belüfteten Krebspuffer auffüllen und die Arterie für etwa 30 Minuten erholen lassen, bevor die nächste Aufgabe ausgeführt wird.
Zu jeder Kammer, fügen Sie kumulative Mengen an Phenylephrin, um die konzentrationsabhängigen Erhöhungen und isometrische Spannung der Ruhepräparate zu induzieren. Nach Zugabe der letzten Dosis Von Agonist, waschen Sie das Medikament gründlich aus und füllen Sie die Kammer mit frischem Krebspuffer. Plotten Sie die konzentrationsabhängigen Reaktionen als steigende Prozentsätze des Kaliumchlorids induzierte maximale Kontraktionen.
Um den Beitrag von Stickstoffmonoxid zu bewerten, inkubieren Sie die Präparate mit dem Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitor L-NAME für 30 Minuten vor der Zugabe von Phenylephrin. Um eine zweite Konzentrationsreaktionskurve sequenziell durchzuführen, waschen Sie die Kammer vollständig und wiederholt, um alle vorherigen Agonisten zu entfernen, bis keine weiteren Tonänderungen beobachtet werden. Normalisierung der Länge-Spannungs-Beziehung wurde für mesenterische Arterien durchgeführt, die von Mausmodellen isoliert wurden, die mit Standard-Chow oder einer fettreichen Ernährung gefüttert wurden.
Durch inkrementelle Dehnung der Arteriensegmente wurde eine passive Längen-Spannungs-Beziehung hergestellt, bis ein interner Umfang von 100 Millimetern Quecksilbertransmuraldruck (IC100) erreicht wurde. Nach jeder Dehnung wurde 115 Millimolar Kaliumchlorid aufgetragen, um Kontraktionen zu stimulieren. Die aktiven Längenspannungskurven wurden aus den Aktivenkraftdaten auf der Y-Achse und den berechneten IC-Werten aus den Mikrometerdaten auf der X-Achse dargestellt.
Ein IC-Wert, der innerhalb des Gipfelplateaus liegt, ist IC1. Der Normalisierungsfaktor K wurde als Verhältnis von IC1 und IC100 berechnet, das dann im folgenden Versuch auf Proben desselben Gefäßtyps angewendet werden konnte. Hier sind Ausgangsaufzeichnungen der Vasokonstriktor-Antworten auf Phenylephrin in mesenterischen Arterien mit oder ohne umgebenden PVAT zu sehen.
Kumulative Konzentrationen von Phenylephrin wurden angewendet, um die Kontraktionen der mesenterischen Arterien zu stimulieren, die von 16 Wochen alten Fettmäusen gesammelt wurden. Die kontraktilen Reaktionen wurden aufgezeichnet und als Prozentsatz von 150 Millimolaren Kaliumchlorid induziert e.H. maximale Kontraktion berechnet. Die Fläche unter den Kontraktionskurven wurde zum Vergleich gezeichnet.
Beachten Sie, dass PVAT von einer Fettmaus eine anti-kontraktile Wirkung auf die Reaktion auf Phenylephrin auslöste. Bei der Erlangung von KCL-induzierten Kontraktionen müssen die Reaktionen stabil und stabil sein. Wenn die Reaktion nach drei inkrementellen Verabreichungen von KCL weiter zunimmt, kann eine KCL-Stimulation erforderlich sein.
Um optimale Bedingungen der Spannungen zu erreichen, ist der Normalisierungsschritt sehr wichtig, da dies die Kraft bestimmt, die Blutgefäße zu öffnen. Wenn es nicht richtig gemacht wird, wird es das ganze Experiment beeinflussen. Dieses Protokoll kann auf andere Einstellungen neben Phenylephrin-induzierte Kontraktion oder Entspannung angewendet werden.
Zum Beispiel in Gegenwart oder Abwesenheit von perivaskulärem Fettgewebe, autonomen Nerven oder Endothel. Mit diesem Protokoll können Forscher kleine Blutgefäße von erkrankten Tiermodellen unter verschiedenen pathophysiologischen Bedingungen wie Fettleibigkeit, Diabetes und Herz-Kreislauf-Erkrankungen untersuchen.
