Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschüsse HL44485 und HL28607 unterstützt.

Ethics Statement: Alle Verfahren wurden überprüft und von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1. Vorab Herstellung von Mikropipetten, Einschränkung der Bewegungsfreiheit, und Blockers <ol><li> Ziehen mehreren sauberen Borosilikatglas Kapillarröhrchen Hälfte mit Hilfe eines elektronischen Abzieher so eingestellt, daß, wenn er gezogen wird, ist der gestreckte Abschnitt des Rohrs etwa 1 cm in der Länge und die beiden Hälften sind etwas symmetrisch. Stellen Sie sicher, dass die Verjüngung steht im Einklang mit den Abmessungen in Abbildung 1. Verwenden Sie beide Hälften für Mikropipetten, Verzögerer und Blocker. <ol><li> Bevel die Mikropipetten mit einem luftbetriebenen Schleifscheibe 30 mit 0,5 &amp; mgr; m-Schleifpapier mit Wasser gebadet. Den Winkel der Mikropipette Halter, so daß es etwa 30 Grad von der Horizontalen. </li><li> Gründlich reinigen und abtrocknen die Mikropipetten mit Hilfe Absaugen, um saubere Aceton durch die Spitze und bis der Welle ziehen. Überprüfen Sie die Mikropipetten (1A) mit einem kleinen aufrechten Mikroskop mit 4 × und 40 × Ziele mit einer Krokodilklemme Mikropipette Halter und einem Okular-Strich ausgestattet. </li><li> Wählen Mikropipetten mit Spitzenöffnung etwa 50 &amp; mgr; m lang mit einer Fase, deren Länge / Breite-Verhältnis zwischen 3,1 und 3,5 und mit einem stark verjüngenden Punkt, dringen in die harte Kollagenfasern im Mesenterium hilft. </li><li> Speichern 15-20 Mikropipetten aus leicht unterschiedlicher Größe in einer staubfreien Feld. </li></ol></li><li> Machen Verzögerer mit gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Glaskapillarrohr kurz in der Nähe einer Mikroflamme, um ein stumpfes Ende (1B) zu bilden. Bewahren Sie mehrere in einer staubfreien Feld. </li><li> Machen microoccluders Verwendung gezogen Kapillaren in Schritt 1.1) hergestellt. Halten Sie eine gezogen Kapillare unter einem Mikroflamme und vorsichtig biegen (unter Verwendung eines Schlauchadapter, z. B. 23G) die feine Spitze (ca. 4 mm von der Spitze), um einen Winkel von fast 120 Grad, um die Welle zu machen ( <strong&gt; 1C). Machen Sie und speichern Sie mehrere. </li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere und Chirurgie <ol><li> Anästhesiert männliche (350-450 g) oder weiblichen Sprague-Dawley-Ratten (200-300 g) mit Natriumpentobarbital (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) subkutan injiziert; Schutz des Mesenteriums indem keine intraperitoneale Injektion. </li><li> Gesamten chirurgischen Verfahren und experimentelle Protokolle, Aufrechterhaltung einer Narkose durch zusätzliche Injektionen (30 mg / kg) nach Bedarf. Bestimmen Sie Narkosetiefe durch toe Prise oder Hornhautreflex. Nach Beendigung des experimentellen Verfahrens, euthanize die Ratte über Pentobarbitalüberdosis oder intrakardiale Injektion von gesättigtem Kaliumchlorid unter Anästhesie. </li></ol> 3. Bereiten Solutions und Erythrozyten zur Verwendung als Durchfluss Markers <ol><li> Vorbereitung Säugerringerlösung für Superfusat und Steuerungs Perfusatlösung (typischerweise Säuger Ringerlösung, die 10 mg / ml Fettsäurekostenlos Rinderserumalbumin, BSA). <ol><li> Filter Perfusat durch 0,2 &amp; mgr; m-Spritzenfilter, um winzige Partikel, die die Mikropipettenspitze blockieren könnten, zu entfernen; Filter in kleine sauberen Behälter. </li></ol></li><li> Vorbereitung Erythrozyten, indem etwa 0,2 ml Blut aus der Schwanzvene der narkotisierten Ratte in einer 20G-Nadel auf einer kleinen Spritze mit 0,05 ml Heparin (1000 U / ml) und in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit etwa 14 ml Säugerringerlösung Lösung . <ol><li> Zentrifuge vorsichtig packen roten Zellen (ca. max 200 g für 7 min). Beziehen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die roten Zellen in Ringer-Lösung. </li><li> Nach Zentrifugieren und Entfernen verlassen Stand dreimal die gepackten roten Zellen, die in der Unterseite des Rohres für eine spätere Verwendung. Man beachte, dass diese Vorgehensweise reduziert Blutplättchen in der endgültigen perfusates auf weniger als 0,1% des normalen Niveaus 31. </li></ol></li></ol> 4. Ordnen Sie die Tissue auf dem TierTray <ol><li> Rasieren Sie den Bauch des narkotisierten Ratten von unten Nabel bis Schwertfortsatz. Sicherzustellen, daß die rasierten Bereich erstreckt sich um die rechte Seite (für Ratten auf der rechten Seite angeordnet), so daß das Haar nicht einen Docht zu bilden, um das Superfusat aus dem Gewebe heraus und ziehen. Entfernen Cut Haare mit einem befeuchteten Gaze oder Gewebe. <ol><li> Halten Sie die Haut mit einem stumpfen gezahnten Pinzette und eine Mittellinie Schnitt (2-3 cm lang) durch die Haut mit ein robustes Schere. Mit einem feinen (Iris) Schere machen einen ähnlichen Schnitt durch die Linea alba, die Aufhebung der Bauchwand mit Wellenzange um eine Beschädigung der Darm. </li><li> Mit dem Tier auf seiner Seite auf dem Tier Fach, ziehen Sie vorsichtig den Darm aus der Bauchhöhle mit Wattestäbchen (Holzstab) in Ringer-Lösung und stumpf gezähnten Zange eingeweicht. Ordnen Sie die gut in das Gewebe gut, so dass das Mesenterium wird über die Säule für die Betrachtung durch das Mikroskop die Pflege zu vermeiden, berühren Sie die Gekröse (pote drapiertntially beschädigen Mikrogefäßen) entweder mit einer Pinzette oder Baumwolle. Hinweis: Das Tier Fach (2A) aus Plexiglas gebaut werden und erfordert eine Gewebe gut (ca. 3 mm tief), ein optisch klares Säule (zB poliert Quarz ca. 2 cm Durchmesser und 5 mm hoch.) Und eine wärmende Unterlage so eingestellt, daß das Tier Temperatur aufrechtzuerhalten. Die Dicke der Säule muß der Arbeitsabstand der Objektiv nicht überschreiten. </li></ol></li><li> Die Position des Tieres Tablett auf dem Mikroskoptisch, so dass das Mesenterium durch die Okulare sichtbar ist. </li><li> Positionieren Sie einen der Schwerkraft gespeiste Tropflinie kontinuierlich superfuse das Mesenterium mit Säugetier-Ringer-Lösung bei 35-37 ° C gehalten. Verwenden Gaze-Pads, die gut in Position zu halten, zu helfen, Feuchtigkeit zu speichern und zu saugen überschüssige Ringer-Lösung von der Oberfläche. Stellen Sie die Strömung und saugen Sie den Abfluß, um eine konsistente Superfusat Dicke zu erhalten. </li><li> Identifizieren Sie Ziel venulären Mikrogefäße, die sindunverzweigte Segmenten nachgeschaltet konvergenten Strömungs eine oder zwei Verzweigungen distal wahre Kapillaren. Finden Sie einen unverzweigten Gefäß (idealerweise 600 bis 1000 &amp; mgr; m in der Länge) mit flotten Durchblutung und frei von weißen Blutkörperchen kleben an der Gefäßwand. </li><li> Positionieren Sie den Testmikrogefäß in der Mitte des Mikroskopfeld und bewegen Sie den Verzögerer in die richtige Position in der Nähe der gewählten Kanülierungsstelle. </li></ol> 5. Füllen Mikropipette und Mount in Halter <ol><li> Kurz vor Kanülierung, auszusetzen: die Erythrozyten im Perfusat. Hinzufügen 7 ul gepackter roter Zellen auf 0,5 ml Perfusat in einem sauberen Borosilikat Reagenzglas. Hinweis: Hämatokritwerte von 1-3% können verwendet werden, aber im Einklang Hämatokrit wird, um konsistente Perfusat Konzentrationen von Stoffen aus den roten Blutkörperchen freigesetzt führen. </li><li> Eine 1-ml-Spritze mit einer 23G-Schlauchadapter und PE 50 Schläuchen (5-15 cm Länge). Zeichnen Sie das Perfusat / rot Zellgemisch in die Spritze. Kehren Spritze zu mischen und zu vertreiben alle Luftblasen aus Schlauch undAdapter. Für mehr Effizienz, fit Schlauch an mehreren Spritzen vor dem Beginn des Experiments und halten sie in einer staubfreien Karton oder Plastikbeutel. </li><li> Füllen der Mikropipette durch Vorschieben der Rohrleitung in das große Ende der Mikropipette bis es den sich verjüngenden Bereich anliegt. Tragen Sie eine sanfte kurzer Druck auf den Spritzenkolben, um die Mikropipettenspitze zu füllen. Hinweis: Eine kleine Stream oder Tropfen sollte an der Spitze sichtbar sein, um eine vollständige Füllung nachzuweisen. </li><li> Ziehen Sie den Schlauch unter leichtem Druck auf den Kolben, um den breiteren Teil des Mikropipette Welle zu füllen. Entfernen Sie kleine Blasen in der breiten Welle durch vorsichtiges Schwenken der Mikropipette Welle. Hinweis: Ein ähnliches Verfahren wurde 32 dargestellt. </li><li> Platzieren der Mikropipette in eine Pipettenhalter mit einer Seitenöffnung, die eine kontinuierliche Fluidverbindung mit einem Wassermanometer ermöglicht. Sicherzustellen, dass der Halter, der mit einem hydraulischen Antrieb verwendet werden, um sehr feine Weiterentwicklung der Mikropipette unter Kontrolle gebunden ist, in einem kleinen Winkel (15-25 °)zur Horizontalen, so dass der Rand der Mikropipette Verjüngung nicht traf den Darm oder Fach. </li><li> Montieren Sie den hydraulischen Antrieb auf einer beweglichen Mikromanipulator, der x, y und z-Antrieben muss eine enge Abstimmung mit dem Testgefäß (Abbildung 2) zu ermöglichen. </li><li> Einstellen des hydrostatischen Drucks auf das Fluid in der Mikropipette unter Verwendung einer Spritze oder wassergefüllte Gummiblase, die Höhe der Flüssigkeit in der Wassersäule des Manometers bis ungefähr 40 cmH 2 O oberhalb des Mesenteriums ändern. </li><li> Kanülieren die Mikrogefäß so bald wie möglich nach dem Füllen der Pipette; Erythrozyten setzen sich am Boden der Pipette, so dass nach etwa 40 Minuten sehr wenige Erythrozyten in den Behälter fließen. </li></ol> 6. Microcannulation und mikrovaskuläre Druckmessung <ol><li> Vor der Positionierung des gefüllte Mikropipette unter dem Mikroskop, vorsichtig auf die Rückhalteeinrichtung auf das Gewebe in der Nähe des Mikrogefäß eine ausreichende Kraft zum Greifen des Gewebes. Zeichnen Sie dieRestrainer zurück, das Gewebe in Übereinstimmung mit der Mikrogefäß leicht ausdehnt, so daß die Spannungen in den mesenterialen Kollagenfasern werden mit dem Behälter ausgerichtet ist. <ol><li> Richten Sie die Mikropipette mit dem Behälter und setzen Sie sie in den Blick durch die Okulare. Setzen Sie die Spitze kurz vor dem gewählten Kanülierungsstelle und senken Sie es auf das Gewebe, so dass es teilweise behindert Fluss innerhalb des Gefäßes, aber nicht zu verschließen ist. </li></ol></li><li> Kanülieren das Gefäß durch Antreiben der Pipettenspitze langsam in das Gefäßlumen mit dem hydraulischen Antrieb. Achten Sie darauf, durch die untere Seite des Behälters zu drücken. Hinweis: Da die Mikropipette in die Lumen, das Perfusat schnell wäscht das Blut in den Behälter aus dem Lumen und Perfusat frei fließt in Umlauf distal des Tieres auf die Probe microvessel verdrängen einige der normalen Durchblutung in den nachgeschalteten Behälter. </li><li> Senken Sie den Perfusionsdruck durch Einstellen der Manometer, bis das Blut (wie angegebenvon roten Zellen des Tieres) zurück in den perfundierten Segment gezogen wird; dies bestimmt die ausgeglichene Druck, wo die roten Zellen vorsichtig oszillieren im Gefäßlumen und misst den hydrostatischen Mikrogefäßdruck (P c) an dem distalen Ende des Mikrogefäßsegment. Pflegen Gefäßdurchblutung bei allen Drücken oberhalb dieses Gleichgewicht Druck. </li></ol> 7. Microocclusion und Erhebung von Daten <ol><li> Optionaler Schritt: Vor der Verwendung der Mikro-Okkluder, um den Behälter zu sperren, drücken Sie sie in das Gewebe in einem nicht verwendeten Bereich des Mesenterium weit von jedem Schiff, so dass die Spitze sammelt sich eine feine Polster aus Gewebe, das die Versuchsgefäß während wiederholter Mikro schützt Verschlüsse. </li><li> Setzen Sie den Blocker oberhalb des durchströmten Behälter in der Nähe des unteren Randes des Mikroskops ein. </li><li> Nehmen Sie die folgende mit Video und Audio. <ol><li> Mündlich erfassen die Position des Blocks Website und unteren Bildschirmrand auf der Okular-Strich gesehen. </li><li> Mit der Spitzedes Blockers gerade oberhalb des Mikrogefäß platziert Mit dem Fein z Steuerung des Mikromanipulators sanft absenken Blocker, bis die Strömung im Behälter verschlossen wird. Beachten Sie das Manometer Druck (P c) auf Audio. Bewerben Okklusion in der Regel für 3-10 sec und dann freigeben, die Wiederherstellung frei Perfusion. Bewegen Sie den Block Website bis das Schiff in Richtung auf die Pipettenspitze in 5-10 um Schritte basierend auf Zeit (&gt; 5 min nach dem ersten Block an einem Standort), die Anzahl der Verschlüsse (3-5), um Gefäßwandschäden am Block Website zu verhindern . </li></ol></li></ol> 8. Analyse von Daten und Messung der L p (Wasserdurchlässigkeit) <ol><li> Während der Wiedergabe, bestimmen die Anfangsabstand (ℓ 0) von einer Markierung von roten Blutkörperchen an die Okklusions-Stelle unter Verwendung eines Bildes einer Objektmikrometer und die bekannten Positionen in den Bildern. Bestimmung der Anfangsgeschwindigkeit (dl / dt) des Markers Zelle von ihrer Position in mehreren Rahmen während des 3-10 sec von aufgezeichneten Bildern. AbschreckenMinen das Schiff Radius (r) aus den Bildern während der Okklusion (Abbildung 3) übernommen. </li><li> Berechnen J v / S für jede Okklusion (dl / dt) x (1 / ℓ 0), x (r / 2). Berechnen L p auf einem konstanten Druck (J v / S) dividiert durch den Antriebsdruck (Mikrogefäßdruck - effektive kolloidosmotischen Druck, siehe Diskussion). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Details von L p Berechnungen. Obwohl transvaskulären Flüssigkeitsbewegung auftritt, während das Schiff frei durchströmt, ist ein solcher Austausch viel zu klein, um im freien Durchblutung gemessen, weil es in der Regel weniger als 0,01% des Schiffes Perfusionsrate werden. Jedoch, wenn die Perfusion transient durch Verschließen der Mikrogefäß, transvaskulär Strom gestoppt (dh Filtration) von der Bewegung des Markers roten Zellen in das Lumen als die Fluidsäule zwischen einem Marker r...

Mikroperfusionskammer im Gefäß gehört der Aufbau gesteuerte Strömung eines künstlichen Perfusat bekannter Zusammensetzung über eine Mikropipette in einem Blutgefäß in der Regel weniger als 40 um im Durchmesser. Die durchströmten Gefäß bleibt innerhalb seiner normalen Gewebeumgebung und ist mit Blut bis das Tier zum Zeitpunkt der Kanülierung perfundiert. Wenn sie in Verbindung mit einer Reihe von Video-Imaging oder fluorometrische Techniken in situ Mikroperfusionskammer verwendet ermöglicht die Messung von Wasser und Stoffströme in den Wänden von Mikrogefäßen unter Bedingungen, wo die treibende Kraft für diese Ströme bekannt sind, und die Durchlässigkeitseigenschaften der Gefäßwand kann direkt ausgewertet. Ferner kann durch Steuern der Zusammensetzung der Flüssigkeit um das Mikrogefäß in dem Gewebe (Perfusat und Superfusat), Regelung der Mikrogefäßdurchlässigkeit und den Austausch kann durch Aktivierung der Endothelzellen Bildung der Mikrogefäßwand, um eine Vielzahl von E ausgesetzt werden untersucht werdenxperimental Bedingungen für präzise gemessen Zeit (Sek hr) (Agonisten, modifizierte Perfusionsbedingungen, Fluoreszenzindikatoren an intrazelluläre Zusammensetzung und Signalisierung zu messen). Zusätzlich können ultra oder cytochemischen Evaluierungen zelluläre Schlüsselmolekülstrukturen Regulieren der Barriere in den gleichen Mikrogefäßen in denen Durchlässigkeit direkt gemessen wird untersucht werden. Der Ansatz bildet dabei eine Brücke zwischen Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen zu Endothelbarriere Funktion in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und die Untersuchung in intakten Mikrogefäßen zu modifizieren. Auch die folgenden Beiträge zu weiteren Auswertung 1-6. Eine Begrenzung der Mikroperfusionskammer ist, dass sie nur in mikrovaskulären Betten, die dünn, transparent sind und eine ausreichende strukturelle Integrität Kanülierung mit einer Glasmikropipette verwendet werden, ermöglichen. Während frühe Untersuchungen verwendet Frosch Mikrogefäße im Mesenterium und dünne Haut pectoris muscle 7,8, die bei weitem am häufigsten verwendete Zubereitung in Säugermodellen ist die Rattengekröse 9-15. Die meisten Untersuchungen auf akute Veränderungen der Gefäßdurchlässigkeit untersucht über einen Zeitraum von 1-4 Stunden konzentriert, aber neuere Untersuchungen haben Messungen an einzelnen Schiffen nach einer anfänglichen Perfusion 12,16 erweitert 24-72 h. Die neu entwickelte CRISPR-Technologie, die zur Untersuchung der vaskulären Permeabilität Regulierung 17 sollten die in dieser Mitteilung beschriebenen Methoden ermöglichen mehr gentechnisch veränderte Rattenmodellen verfügbar zu machen verspricht, in venulären Mikrogefäßen des Mesenteriums in dieser wichtigen neuen Rattenmodellen angewendet werden. Das Verfahren erfordert eine inverse Mikroskop mit einem speziell angefertigten Mikroskoptisch groß genug ausgestattet, um sowohl den Tier Vorbereitung und mindestens drei Mikromanipulatoren zur Position in der Nähe des Mikrowerk perfundierten Gefäß und einen Perfusion Mikropipette mit dem Behälter auszurichten verwendet haltenLumen. Zum Beispiel eine individuelle Plattform für einen xy Mikroskoptisch (ca. 90 × 60 cm) aus einer 1 cm dicken Stahlplatte mit einem Rostschutzbeschichtung hergestellt werden. Die Phase auf eine Engineering-Indextabelle oder zwei Schwalbenschwanzschlitten rechtwinklig zur Bewegung in der horizontalen Ebene montiert ist und auf Teflonsäulen oder Kugelrollen abgestützt angebracht ist. Eine typische rig (siehe Abbildung 2) hat viel gemeinsam mit dem Mikroskop und Mikropositionierung Ausrüstung für eine Vielzahl von Intravitalmikrozirkulation Experimente, wie sie verwendet werden, um Einzelgefäß Blutfluss und Hämatokrit, lokalen Sauerstoffversorgung von durchbluteten Mikrogefäße, die Regulierung der vaskulären glatten messen Muskeltonus und der örtliche mikrovaskuläre Akkumulation von fluoreszierenden Indikatoren in den gesamten Kreislauf injiziert. 18-26 Die grundlegenden Aspekt der Technik ist die Messung der Volumenstrom (J v) in einer definierten Oberfläche (S) der Mikrogefäßwand. ErreichenDieses über das modifizierte Landis Technik beschrieben eine einfache invertierte Mikroskop ist ausreichend. Eine kleine Videokamera wird auf dem Bild-Port und dem Videosignal angebracht ist, mit einem zusätzlichen Zeitbasis wird auf einem Videomonitor angezeigt und entweder in digitaler Form in einem Computer oder als digitales oder analoges Signal auf einem Videorekorder aufgezeichnet. Sobald die Mikrogefäß kanüliert ist der Teil des Mikrogefäß für die Kamera sichtbar ist, indem die Phase und Manipulatoren als Einheit ohne Unterbrechung der Kanülierung geändert werden. Die Messung der transvaskulären Ströme kann auch mit mehr detaillierte Untersuchungen mit Hilfe eines hoch entwickelten Fluoreszenzmikroskop mit geeigneten Filtern, wie Bohrinseln für die Messung des gelösten Stoffes Durchlässigkeit, Fluoreszenz-Verhältnis Überwachung der zytoplasmatischen Calcium oder anderen zellulären Mechanismen und konfokale Bildgebung 6,12,13 verwendet kombiniert werden, 27. Ein wesentlicher Vorteil aller Mikroperfusionskammer Ansätze ist die Fähigkeit, wiederholte Messungen zu machen, auf dem gleichen Gefäß, Unter kontrollierten Veränderung der Antriebskraft, wie beispielsweise hydrostatischen und onkotischen Drücke oder induzierte Veränderung der Gefäßreaktionen auf Entzündungszuständen. Die häufigste Design ist eine paarweise Vergleich der gemessenen hydraulischen Leitfähigkeit (L p) auf dem gleichen Schiff mit dem Gefäß zunächst über eine Mikropipette mit einer Steuer Perfusat und der Erythrozytensuspension gefüllt perfundiert, um eine Grundlinie Lässigkeit Zustand mit einem zweiten Pipette zu etablieren, dann mit dem Testmittel zugesetzt, um dem Perfusat. Mehrere Kanülierungen sind mit dem Zyklus nach der Reperfusion mit dem Steuerpipetten wiederholt möglich. Dieses Protokoll zeigt die Kanülen sowie Mikroperfusionskammer eines venulären Gefäß Rattengekröse Wasserflüsse über die Mikrogefäßwand erfassen und messen die L p der Gefäßwand, ein nützlicher Index der Permeabilität des gemeinsamen Syntheseweges für Wasser und gelösten Stoffen durch die intakte endothelialen Barriere. Das Verfahren wird als modifiziert Landis technique, weil die ursprüngliche Landis Prinzip der Verwendung die Relativbewegung der roten Zellen als Maß für die transvaskuläre Flüssigkeitsaustausch nach Perfusion blockiert wird beibehalten 28, aber die Auswahl der Versuchsbedingungen (beispielsweise die hydrostatische und Albumin onkotischen Druckdifferenzen über die Mikrogefäßwand) nach Mikroperfusion verfügbar ist weit größer als in uncannulated blutet Mikrogefäßen 8,29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE, TABLE AND STAGE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CK-40</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMIL</td>
			<td>try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow diameter, long working distance objective: example</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Nikon E Plan 10&#215;/0.25 LWD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel</td>
			<td>welding shop</td>
			<td></td>
			<td>this should be heavy to reduce vibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unislide x-y table: dove tail slides</td>
			<td>Velmex</td>
			<td>AXY4006W1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VIDEO</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD video camera: example</td>
			<td>Pulnix</td>
			<td>TM-7CN (no longer available)</td>
			<td>no color needed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video capture system with audio--generic</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>video playback system (completely still frame, single frame motion)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small microphone</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROMANIPULATORS, HOLDERS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micromanipulator, XYZ (3)</td>
			<td>Prior/Stoelting (no longer available)</td>
			<td></td>
			<td>look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hydraulic probe drive, one way</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-1C</td>
			<td>need to buy either manual drive or electronic drive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manual drum drive&#160;</td>
			<td>FHC</td>
			<td>50-12-9-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>or hydraulic drive, 3 way</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MX610 (1-way) or MX630 (3-way)</td>
			<td>great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>connectors/rods/holders</td>
			<td>Siskiyou Corporation</td>
			<td>MXC-2.5, MXB etc.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pin vise</td>
			<td>Starrett</td>
			<td>162C</td>
			<td>to hold restrainer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette holder</td>
			<td>World Prescision Instruments</td>
			<td>MPH3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>water manometer ~120 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROSCOPE TRAY</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clear Plexiglas for microscope tray for animal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall</td>
			<td>Quartz Scientific Inc.</td>
			<td>custom</td>
			<td>&#160;(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical adhesive for tissue well</td>
			<td>NuSil</td>
			<td>MED-1037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>All-purpose silicone rubber heat mat, 5&#34; L x 2&#34; W</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03125-20</td>
			<td>heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-03122-75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out</td>
			<td>Cole Parmer</td>
			<td>EW-01575-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPET MANUFACTURE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vertical pipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>P-30 with nichrome filament</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm OD thin wall capillary tubing</td>
			<td>Sutter Instrument Company</td>
			<td>B150-110-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RX Honing Machine, System II</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td>MAC-10700 Rx System II Machine</td>
			<td>alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160; with ceramic sharpening disc</td>
			<td>RX Honing Machine Corporation</td>
			<td></td>
			<td>use &#34;as is&#34; or attach lapping film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um</td>
			<td>3M</td>
			<td>part no. 051144 80827</td>
			<td>268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microperfusion technique to investigate regulation of microvessel permeability in rat mesentery

Versuche, um die Durchlässigkeitseigenschaften individuell perfundiert microvessels messen eine Brücke zwischen Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen, die die vaskuläre Permeabilität in kultivierten Endothelzellen-Monoschichten und den Funktionsaustauscheigenschaften von Voll mikrovaskulärer Betten. Ein Verfahren, um kanülieren und perfundieren venulären Mikrogefäßen des Rattengekröse und messen die hydraulische Leitfähigkeit des Mikrogefäßwand beschrieben. Die wichtigsten Geräte benötigt umfasst eine Intravitalmikroskop mit einer großen Bühne, die modifizierten Mikromanipulatoren unterstützt zu drei verschiedene Mikrowerk positionieren: (1) eine abgeschrägte Glas-Mikropipette zu kanülieren und Perfusion der Mikrogefäß; (2) eine Glasmikro Okkluder transient zu blockieren Perfusion und ermöglichen die Messung der transvaskulären Wasserströmungsbewegung mit einer gemessenen hydrostatischen Druck, und (3) ein stumpfer Glasstab um den mesenterialen Gewebe an der Stelle der Kanülierung stabilisieren. Die modifizierte Landis Mikro Okklusion technique verwendet Erythrozyten im künstlichen Perfusat als Marker für transvaskuläre Flüssigkeitsbewegung ausgesetzt ist, und ermöglicht auch wiederholte Messungen dieser Ströme als Versuchsbedingungen geändert werden, und hydrostatischen und kolloidosmotischen Druckdifferenz über den Mikrogefäßen werden sorgfältig gesteuert. Messungen der hydraulischen Leitfähigkeit zunächst unter Verwendung eines Steuer Perfusat, dann nach erneuter Kanülierung der gleichen Mikrogefäß mit den Test Perfusaten ermöglichen Paarvergleiche der Mikrogefäßreaktion unter diesen gut kontrollierten Bedingungen. Versuche, das Verfahren auf Mikrogefäße im Mesenterium von Mäusen mit genetischen Veränderungen erwartet, Gefäßdurchlässigkeit ändern erstrecken waren stark eingeschränkt wegen der Abwesenheit von langen Geraden und unverzweigten Mikrogefäße in der Maus Mesenterium, aber die jüngsten Verfügbarkeit der Ratten, die mit ähnlichen genetischen Veränderungen mit die CRISPR / Cas9 Technologie wird erwartet, dass neue Bereiche der Untersuchung, wo die hier beschriebenen Verfahren angewendet werden kann, zu öffnen. </p&gt;

Figur 4 zeigt die Ergebnisse aus der Messung der Zeitverlauf von Änderungen des L p in einem Ratten venulären microvessel nacheinander mit vier perfusates kanüliert. 33 Die Grße L p auf einem konstanten Druck wurde berechnet als Maß für die Änderungen in der Mikrogefäßwanddurchlässigkeit verwendet wird, zunächst im Steuerzustand mit einem Perfusat, das 1% Rinderserumalbumin, dann, wenn der Behälter auf dem Entzündungsmittel Bradykinin (Bk) unter Verwendung e...

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Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Mikroperfusion Technik zur Untersuchung von Mikrogefäßdurchlässigkeit Verordnung in Rattengekröse

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

microperfusion-technique-to-investigate-regulation-microvessel

Research

JoVE Journal

Biology

9.6K Aufrufe.  University of California Davis. The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions. 

Serie: Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play a key role in the development of a functionally competent T-cell pool. However, the complexity of T-cell development in the thymus in vivo can limit analysis of individual cellular components and particular stages of development. In vitro culture systems provide a readily accessible means to study multiple complex cellular processes. Thymus organ culture systems represent a widely used approach to study intrathymic development of T-cells under defined conditions in vitro. Here we describe a system in which mouse embryonic thymus lobes can be depleted of endogenous haemopoeitic elements by prior organ culture in 2-deoxyguanosine, a compound that is selectively toxic to haemopoeitic cells. As well as providing a readily accessible source of thymic stromal cells to investigate the role of thymic microenvironments in the development and selection of T-cells, this technique also underpins further experimental approaches that include the reconstitution of alymphoid thymus lobes in vitro with defined haemopoietic elements, the transplantation of alymphoid thymuses into recipient mice, and the formation of reaggregate thymus organ cultures. (This article is based on work first reported Methods in Molecular Biology 2007, Vol. 380 pages 185-196).

This video demonstrates the dissection and removal of the fetal thymus as well the preparation of ex vivo cultures of 2-dGuo-treated thymus.

Herstellung von 2-dGuo-Behandelte Thymus Organkulturen

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Forschung

Biologie

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat Mesenterium Angiogenese Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Die Ex vivo Isoliert Skeletal Mikrogefäßdichte Vorbereitung für Untersuchung der vaskulären Reaktivität

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Rat Mesentery Exteriorization: A Model for Investigating the Cellular Dynamics Involved in Angiogenesis

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease conditions1, 2. Network growth is commonly attributed to angiogenesis, defined as the growth of new vessels from pre-existing vessels. The angiogenic process is also directly linked to arteriogenesis, defined as the capillary acquisition of a perivascular cell coating and vessel enlargement. Needless to say, angiogenesis is complex and involves multiple players at the cellular and molecular level3. Understanding how a microvascular network grows requires identifying the spatial and temporal dynamics along the hierarchy of a network over the time course of angiogenesis. This information is critical for the development of therapies aimed at manipulating vessel growth.
The exteriorization model described in this article represents a simple, reproducible model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. It was adapted from wound-healing models in the rat mesentery4-7, and is an alternative to stimulate angiogenesis in the mesentery via i.p. injections of pro-angiogenic agents8, 9. The exteriorization model is attractive because it requires minimal surgical intervention and produces dramatic, reproducible increases in capillary sprouts, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows for the two-dimensional visualization of entire microvascular networks down to single cell level. The stimulated growth reflects natural angiogenic responses in a physiological environment without interference of foreign angiogenic molecules. Using immunohistochemical labeling methods, this model has been proven extremely useful in identifying novel cellular events involved in angiogenesis. Investigators can readily correlate the angiogenic metrics during the time course of remodeling with time specific dynamics, such as cellular phenotypic changes or cellular interactions4, 5, 7, 10, 11.

This article describes a simple model for stimulating angiogenesis in the rat mesentery. The model produces dramatic increases in capillary sprouting, vascular area and vascular density over a relatively short time course in a tissue that allows en face visualization of entire microvascular networks down to the single cell level.

Rattengekröse Exteriorisation: Ein Modell für die Untersuchung der Zelluläre Dynamik an der Angiogenese beteiligt

Microvacular network growth and remodeling are critical aspects of wound healing, inflammation, diabetic retinopathy, tumor growth and other disease ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolierung von Ribosom gebunden Nascent Polypeptide<em&gt; In-vitro-</em&gt; Identifizieren Translational Pause Standorten entlang mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway that polypeptide chain follows during co-translational folding to achieve its functional form is still an enigma. In order to understand this process and to determine the exact conformation of the co-translational folding intermediates, it is essential to develop techniques that allow the isolation of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes to allow their further structural analysis.
SecM (secretion monitor) is a 170 amino acid E. coli protein that regulates expression of the downstream SecA (secretion driving) ATPase in the secM-secA operon6. Nakatogawa and Ito originally found that a 17 amino acid long sequence (150-FSTPVWISQAQGIRAGP-166) in the C-terminal region of the SecM protein is sufficient and necessary to cause stalling of SecM elongation at Gly165, thereby producing peptidyl-glycyl-tRNA stably bound to the ribosomal P-site7-9. More importantly, it was found that this 17 amino acid long sequence can be fused to the C-terminus of virtually any full-length and/or truncated protein thus allowing the production of RNCs carrying nascent chains of predetermined sizes7. Thus, when fused or inserted into the target protein, SecM stalling sequence produces arrest of the polypeptide chain elongation and generates stable RNCs both in vivo in E. coli cells and in vitro in a cell-free system. Sucrose gradient centrifugation is further utilized to isolate RNCs.
The isolated RNCs can be used to analyze structural and functional features of the co-translational folding intermediates. Recently, this technique has been successfully used to gain insights into the structure of several ribosome bound nascent chains10,11. Here we describe the isolation of bovine Gamma-B Crystallin RNCs fused to SecM and generated in an in vitro translation system.

We describe here a technique that is now routinely used to isolate stably bound ribosome nascent chain complexes (RNCs). This technique takes advantage of the discovery that a 17 amino acid long SecM "arrest sequence" can halt translation elongation in a prokaryotic (E. coli) system, when inserted into (or fused to the C-terminus) of virtually any protein.

Mit SECM Arrest Sequenz als Werkzeug zum Ribosom gebunden Polypeptide isolieren

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.