Name: sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
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Diese Arbeit wurde von der Singapore Ministry of Education (MOE) Stufe 1 (RGT3/13 und RG42/15, g.c.) und MOE Tier 2 (MOE2013-T2-2-024 und MOE2015-T2-1-028, g.c.) unterstützt.

Eine Patentanmeldung (PAT/179/14/15/PCT) basiert auf der Arbeit hier berichtet wurde eingereicht.

RNA Duplex-Bindung PNA Oligomere (z.B. 10-Mers) sind Moleküle, die mittlere und somit können zeigen elektrophoretische Mobilität Verschiebung auf verbindliche RNAs mit einer vergleichbar oder etwas größeren Größe (z. B., 50-Mer oder kleiner). Wenn eine RNA deutlich größer als die PNA ist, Titration von PNA in RNA funktioniert möglicherweise nicht aufgrund einer begrenzten Gel-Mobilität-Verschiebung. So kann die großen RNA für die nicht-Denaturierung Seite Assays abgeschnitten werden. Titration von eine große RNA in einem Fluorophore beschriftet PNA ermöglicht die Überwachung der triplex Bildung durch ein nicht denaturierenden Agarosegel mit der Probe in der Mitte der Gel40geladen.
Für eine Titration Experiment nicht Denaturierung seitenweise mit konstanter Gesamtkonzentration von RNS verwenden wir in der Regel eine unbeschriftete RNA-Konzentration von 1 µM für effiziente Post Färbung freie RNA und triplex Bands durch Interkalation Bromid. Eine RNA-Konzentration so niedrig wie 0,2 µM kann auch abhängig von der RNA Konstrukt31ausreichen. Die Konzentration der unbeschrifteten RNA (0,2 µM) bestimmt, dass die K-d -Werte, die genau gemessen werden können über 0,2 µM oder größer sein sollte. Andere Färbung Farbstoffe können verwendet werden, um die Färbung Effizienz zu erhöhen. Alternativ zufolge unsere unveröffentlichten Daten Cy3 Farbstoff-markierten RNAs in nicht Denaturierung Seite Experimente verwendet werden können, um die feste Bindung Ereignisse zu messen.
Die 2-Aminopurine nur mäßig Leuchtstoff ist, ist 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration auch beschränkt sich auf die Messung der Bindung mit K-d -Werte nahe oder über 0,2 µM31. Die RNA oder PNA kann mit einem relativ hellen Farbstoff zur Quantifizierung eine relativ enge Bindung in Lösung durch Fluoreszenz Titration, wenn die Bindung ergibt sich Änderungen in der Fluoreszenz Signale53,54, beschriftet werden 55.
Die Strategie des Zielens RNA-Strukturen durch DsRNA-Bindung PNAs wurde für eine begrenzte Anzahl von RNAs getestet. Es ist wahrscheinlich, dass bindende Eigenschaften für DsRNAs mit verschiedenen Sequenzen und Basenpaar Kompositionen variieren kann. Man kann immer die Purin-reiche Strang eines Duplex für die Gestaltung der TFPNAs wählen. Es ist wichtig zu verstehen, wie in Folge an C-G-Tripel können die Stabilität der ein Triplex beeinträchtigen. Umfangreichere Studien der reihenfolgeabhängigen sind klar zu verstehen, die reihenfolgeabhängigen Bindungseigenschaften des TFPNAs erforderlich.
Die Bindungsaffinität des TFPNAs kann durch Erhöhung der Länge und/oder weitere Basen und Backbones56,57 des TFPNAs ändern weiter gesteigert werden. Allerdings kann eine kontinuierliche duplex Region nicht oft von mehr als 10 aufeinanderfolgenden Basenpaaren ohne Störung durch nicht-Watson-Crick-Strukturen bestehen. Man kann TFPNAs mit kleinen Molekülen für die Anerkennung von nicht-Watson-Crick-Strukturen an DsRNA Regionen angrenzenden konjugieren. Im Prinzip soll ein TFPNA kleines Molekül Konjugat Bindungsaffinität und Spezifität im Vergleich zu einer TFPNA oder kleines Molekül allein verbessert haben. Jedoch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Linkers für die Konjugation58,59,60,61,62,63,64 muss optimiert werden.
Die Tatsache, dass TFPNAs selektiv, um DsRNAs über SsRNAs binden können und DsDNAs deutet darauf hin, dass es möglich ist, TFPNAs zu entwickeln, als sehr nützlich chemische Sonden und mögliche therapeutische Liganden durch die Regulierung der RNA Strukturdynamik und Interaktionen mit Proteinen und Metaboliten. Zelluläre Aufnahme von TFPNAs kann erleichtert werden, durch die Konjugation mit Zelle eindringen Moieties wie kleinen Molekülen, Peptiden, und Nanopartikel oder Komplexierung mit supramolekularen Strukturen wie Liposomen5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Weiter kann Funktionalisierung von TFPNAs mit Bioimaging Tags wie Fluorophore und Radioisotopen die Erkennung, imaging und Ausrichtung der funktionalen RNA-Strukturen in lebenden Organismen erleichtern.

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele, durch die jüngsten Fortschritte in der Entdeckungen der RNAs Rollen in der Verordnung und Katalyse von diversen biologischen Prozessen1,2,3. Traditionell wurden antisense Stränge zur Bindung an SsRNAs durch Watson-Crick duplex Bildung3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. vor kurzem Triplex-bildende Peptid-Nukleinsäuren (TFPNAs) wurden entwickelt, um DsRNAs über Hoogsteen Wasserstoffbindung (Abbildung 1)3,28,29binden. DsRNA Regionen befinden sich in den meisten der traditionellen Antisense-gezielte RNAs, einschließlich Pre-mRNAs und mRNAs, Pre oder Pri-MiRNAs3und viele andere nicht-kodierende RNAs1,26,27. DsRNAs durch Dreifachhelix Bildung mit TFPNAs Targeting kann aufgrund seiner Struktur Besonderheit vorteilhaft sein und ist mit großem Potenzial für den Einsatz bei der Wiederherstellung der normalen Funktionen der RNAs, die Dysregulated in Krankheiten, zum Beispiel.
Die kürzlich veröffentlichten Arbeiten von Rozners Et Al., und uns3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, berichtet die Bemühungen zur Verbesserung der die selektive Bindung von modifizierten TFPNAs in Richtung DsRNAs mit verstärkten Affinität. Wir haben Synthesemethoden für rational gestalteten PNA Monomere (Abbildung 2) einschließlich Thio-Pseudoisocytosine (L) Monomer30 und Guanidin-modifizierten 5-Methyl Cytosin (Q) Monomer31entwickelt. Durch verschiedene biochemische und biophysikalische Charakterisierungsmethoden haben wir gezeigt, dass relativ kurzen PNAs (6-10 Rückstände) Einbeziehung L und Q Rückstände verbesserte Erkennung von Watson-Crick-G-C- und C-G Basenpaaren, bzw. in DsRNAs zeigen. Darüber hinaus zeigen im Vergleich zu unveränderten PNAs, PNAs, die L und Q Rückstände enthalten mehr selektive Bindung in Richtung DsRNA SsRNA und DsDNA. Die Guanidin-Funktionalität-42 in der Q-Base ermöglicht PNAs HeLa Zellen31eingeben.
In unserem Labor zu synthetisieren wir PNAs durch manuellen Boc-Chemie (Boc oder t- Boc steht für Tert-Butyloxycarbony (siehe Abbildung 2) Festphasen-Peptid-Synthese Methode4. Die Synthese von PNA Monomer mit Boc als das Amin Gruppe zu schützen ist praktisch, da die Boc Group sterisch weniger sperrig im Vergleich zu Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) Amin Schutz-Gruppe, die während der Kopplung ist auf PNA-Monomer kann vorteilhaft sein die solide Unterstützung. Die Boc Group ist Säure-labil und kann leicht auf die solide Unterstützung von 20-50 % Trifluoroacetic Säure (TFA) in Dichlormethan (DCM) während der PNA Synthese entfernt. Ein automatisierte Peptid-Synthesizer einsetzbar, PNA Oligomere zu synthetisieren; Allerdings braucht man 3-5-fach Übermaß an PNA Monomer für eine automatisierte Peptid-Synthesizer. Manuelle Synthese erfordert deutlich weniger PNA Monomer (2-3-Fach Selbstbehalt), mit jede Kupplung leicht von der Kaiser-Test43überwacht. Darüber hinaus sind viele automatisierte Synthesizer während der Boc-Schritt Entfernung nicht kompatibel mit der Boc-Strategie-Synthese durch den Einsatz von ätzenden TFA.
Die PNA-Oligomere können durch Reverse-Phase Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC) gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von MALDI-TOF gereinigt werden (Abbildungen 3 und 4)30, 31. beschäftigen wir nicht Denaturierung Seite triplex Bildung zu überwachen, dass freie RNA-Duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration Rate (Abbildung 5)30,31 . Keine Kennzeichnung ist erforderlich, wenn Post-effiziente Färbung für beide RNA duplex und PNA· erreicht werden kann RNS2 triplex Bands. Eine relativ kleine Menge der Probe ist für nicht-Denaturierung Seite Experimente erforderlich. Jedoch die Belastung (Inkubation) Puffer und die laufenden Puffer (pH 8,3) dasselbe, was in den Messungen wird beschränkt auf die kinetisch stabilen Triplexen, weil ein relativ hoher pH-Wert von 8,3 deutlich ein Triplex destabilisieren kann möglicherweise nicht.
2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); der 2-Aminopurine Fluoreszenzintensität (mit einer Emission Peak bei etwa 370 nm) ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung, und ist geeignet für die Überwachung der triplex Formation mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA Website (verbindlich aufgenommen Abbildung 6) 31. im Gegensatz zu vielen anderen Farbstoffen, die Fluoreszenzemission im sichtbaren Bereich zeigen, 2 Aminopurine beschriftet RNA kann ausgesetzt werden Raumlicht ohne Foto bleichen. Im Gegensatz zu Seite Experiment, in dem ein laufende Puffer pH 8,3 ist oft notwendig, 2-Aminopurine basierte Fluoreszenz Titration ermöglicht die Messung der Bindung in einer Lösung bei einem bestimmten pH-Wert, und so gestatten die Messung und Erfassung von relativ schwach und kinetisch instabil Bindung im Gleichgewicht.
UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität von Maisonetten (Abbildung 7)31 und triplexe30,32,44,45. Je nach Länge und Sequenz das Schmelzen des Triplexen kann oder kann nicht zeigen einen deutlichen Übergang. Thermodynamischen Parameter können erhalten werden, wenn die Heiz- und Kurven überlappen. Exakte thermodynamische Parameter erhalten Sie durch isothermen Titration Kalorimetrie (ITC)32; relativ große Mengen an Proben sind jedoch in der Regel erforderlich für ITC.

<table><tbody><tr><td>Molecular sieves, 4A, 1-2 mm diameter pellets&amp;nbsp;</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Methylbenzhydrylamine hydrochloride (MBHA&lt;span class=&quot;font6&quot;&gt;&amp;Yuml;&lt;/span&gt;&lt;span class=&quot;font0&quot;&gt;HCl)&lt;/span&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhyride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Unmodified PNA monomers</td><td>ASM Research Chemicals GmbH</td><td>5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoromethanesulfonic acid</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&amp;reg; 100 RP-18 endcapped (5 &amp;micro;m) LiChroCART&amp;reg; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>RNA Oligos&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Customized&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N&#039;-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>146072</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Buffer, pH 8.3</td><td>1st Base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol&amp;nbsp;</td><td>Promega&amp;nbsp;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&amp;nbsp;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&amp;nbsp;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

sequence-specific and selective recognition of double-stranded rnas over single-stranded rnas by chemically modified peptide nucleic acids

RNAs entstehen als wichtiger Biomarker und therapeutische Ziele. So gibt es großes Potenzial bei der Entwicklung von chemischen Sonden und therapeutische Liganden für die Anerkennung der RNA-Sequenz und Struktur. Chemisch verändert Peptide Nucleic Acid (PNA) Oligomere vor kurzem entwickelt worden sind, die RNA-Maisonetten in einer Sequenz-spezifische Weise erkennen können. PNAs sind chemisch stabil mit einem neutralen Peptid-ähnliche-Backbone. PNAs können relativ leicht durch das manuelle Boc-Chemie Festphasen-Peptid-Synthese-Verfahren synthetisiert werden. PNAs sind durch Reverse-Phase-HPLC, gefolgt von Molekulargewicht Charakterisierung von Matrix-unterstützte Laser Desorption/Ionisierung-Zeit des Fluges (MALDI-TOF) gereinigt. Non-denaturierenden Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (PAGE) Technik erleichtert die Bildgebung der triplex-Formation, da sorgfältig entworfen, freie RNA duplex konstruiert und PNA Triplexen oft gebunden zeigen unterschiedliche Migration raten. Non-Denaturierung Seite mit Interkalation Bromid Post Färbung ist oft eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. In der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen lässt sich PNA Bindeeigenschaften wie verbindliche Affinitäten und Besonderheiten charakterisieren. 2-Aminopurine ist ein Isomer von Adenin (6-Aminopurine); die 2-Aminopurine Fluoreszenz-Intensität ist empfindlich gegen strukturelle Umgebung und eignet sich für die Überwachung der triplex Bildung mit der 2-Aminopurine Rückstand in der Nähe der PNA-Bindungsstelle aufgenommen. 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration kann auch verwendet werden, um die verbindliche Selektivität der modifizierten PNAs zur gezielten doppelsträngigen RNAs (DsRNAs) über einzelsträngigen RNAs (SsRNAs) zu bestätigen. UV-Absorption-erkannt thermische schmelzende Experimente ermöglichen die Messung der thermischen Stabilität des PNA-RNA Maisonetten und PNA· RNA-2 -Triplexen. Hier beschreiben wir die Synthese und Reinigung von PNA Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände und biochemische und biophysikalische Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs beschreiben.

Reverse-Phase-HPLC ermöglicht die Reinigung von PNA Oligomere. Wir erhalten reine PNA Oligomere mit zwei Runden der HPLC-Reinigung (Abbildung 3). Die Identität des PNAs kann durch MALDI-TOF-Analyse (Abbildung 4) bestätigt werden.
Non-Denaturierung Seite ist eine einfache und informative Technik zur Charakterisierung der verbindlichen Affinitäten und Besonderheiten der PNA Oligomere. Wir verwenden in der Regel mehrere RNA Haarnadeln oder Maisonetten mit einzigen Basenpaar Mutationen Bindeeigenschaften (Abbildung 5) zu charakterisieren. Die nicht Denaturierung Seitendaten in Abbildung 5 dargestellten vorschlagen deutlich, dass die Q - und L-modifizierte PNA eine DsRNA-Region mit einem C-G-paar (Abbildung 5B, Bodenplatte) erkennen kann aber keiner ohne ein C-G-paar (Abbildung 5B, top Panel). Diese besondere und verbesserte Anerkennung ist durch die T· A-U, L· G-C und an C-G PNA· RNS2 base Triple (Abbildung 1A, C, D) Bildung. Verschiedene PNAs mit einzelnen oder mehreren Mutationen können auch verwendet werden, die verbesserten Bindungseigenschaften von einem modifizierten PNA zu demonstrieren. Wir haben gezeigt, dass 2 mM Mg2 + in der Inkubation Puffer hinzufügen die Bindung nicht beeinflusst erheblich31.
Wir haben 2-Aminopurine Fluoreszenz Titration zeigen, die eine Q und L geändert PNA an eine gezielte DsRNA Region (Abbildung 6A, 6 C, 6D) aber nicht SsRNA (Abbildung 6B, 6E, 6F bindet). PNA P3 bindet an die 2-Aminopurine-Label DsRNA mit einem K-d -Wert von 0,8 ± 0,1 µM. Die Fluoreszenzintensität auf 370 nm für die 2-Aminopurine-Label SsRNA bleibt relativ konstant mit abwechslungsreichen P3-Konzentration, zeigt den Mangel an Bindung von PNA P3 an der SsRNA.
PNAs mit Q Rückstände (P2 und P3) zeigen keine thermische Übergänge (Abbildung 7), schlägt keine Bindung an die SsRNA schmelzen. Dies ist aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie Q-G paar vorhanden. Im Vergleich zu unveränderten PNA P1, PNAs P4 und P5 mit geändert L Rückstände aber keine Q-Rückstände, Show sank Schmelztemperaturen für die entsprechenden RNA-PNA-Maisonetten aufgrund der sterischen Zusammenstoß in Watson-Crick wie L-G paar vorhanden. Die UV-Absorption-erkannt schmelzenden Temperaturdaten sind konsistent mit den 2-Aminopurine Fluoreszenz-Titration-Daten, die auch zeigen, dass ein PNA mit Q und L Rückstände nicht merklich zu SsRNA bindet (Abbildung 6B, 6E, 6F). Einbindung der Q-Base ist mehr als eine L-Basis, destabilisierenden, wie eine Q-Base einen bedeutenderen sterischen Zusammenstoß bei der Bildung der Watson-Crick-wie Q-G zwei (Abbildung 1F hat) im Vergleich zu ein paar Watson-Crick-wie L-G (Abbildung 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Abbildung 1 : Chemische Strukturen der stabilen Basis Dreibett- und instabilen Basenpaar Strukturen. (A-D) Major-Nut PNA· RNS2 base verdreifacht sich der T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) und an C-G (D). (E, F) Instabile Watson-Crick wie PNA-RNA Basenpaare des L-G (E) und Q-G (F). Der Buchstabe R steht das Zucker-Phosphat-Rückgrat der RNA. Wasserstoffbrücken sind durch schwarz gestrichelte Linien angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31abgebildet. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Abbildung 2 : Chemische Strukturen von PNA Monomere. Vier PNA Monomere (T, C, L und Q) werden angezeigt. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Abbildung 3 : Chemische Struktur von einem PNA Oligomer und Reinigung mittels RP-HPLC. (A) chemische Struktur der PNA Sequenz P3. (B, C) RP-HPLC-Daten von Rohöl PNA P3 (B) und wieder gereinigt PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Abbildung 4 : MALDI-TOF-Spektrum der gereinigten PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Abbildung 5 : RNA-Haarnadel und PNA-Sequenzen und verbindliche Charakterisierung nicht Denaturierung seitenweise. (A) RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2), PNA P3 und eine PNA· RNS2 triplex zwischen PNA P3 und rHP2 gebildet. (B) nicht-Denaturierung Seite (12 %) ergibt sich für rHP1 und rHP2 Bindung an PNA P3. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Die geladenen RNA Haarnadeln (rHP1 und rHP2) sind bei 1 µM in 20 µL. Die PNA-Konzentrationen in Bahnen von links nach rechts sind 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, und 50 µM. PNA P3 bindet nicht an rHP1 (Oberseite) aber bindet an rHP2 (Bodenplatte). (C) Kd Bestimmung für P3 Bindung an rHP2. Der Anteil der triplex Bildung (Y) war gegen die PNA-Konzentration aufgetragen. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Abbildung 6 : Fluoreszenz Titration Studie der PNA P3 Bindungzu 2 Aminopurine beschriftet RNAs. Der 2-Aminopurine Rückstand wird als "2" in der RNA-Sequenz bezeichnet. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) eine PNA· RNS2 triplex zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-Label DsRNA (dsRNA2-2AP) gebildet. (B) ein hypothetisches PNA-RNA Maisonette zwischen P3 und eine 2-Aminopurine-mit der Bezeichnung SsRNA (ssRNA2-2AP) gebildet. (C, E) Fluoreszenz-Emissionsspektren für die 2-Aminopurine-Label RNA duplex (1 µM) und SsRNA (1 µM), abwechslungsreich, bzw. mit P3-Konzentration bei pH 7,5. Der Peak bei etwa 475 nm ist durch die schwache Fluoreszenzemission von der L-Basis in der PNA. (D, F) K d Bestimmung basiert auf den Grundstücken der Fluoreszenzintensität 2-Aminopurine (370 nm) des RNA-Duplex und SsRNA, bzw. im Vergleich zu PNA P3 Konzentration. Die Figur ist aus Referenz31angepasst. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Abbildung 7 : Thermische schmelzen Ergebnisse für RNA-PNA Maisonetten. Die Inkubation Puffer ist 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Alle Proben enthalten 5 µM einsträngige RNA (ssRNA1) und PNA in 130 µL. (A) Single-Stranded RNA (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 und P5) und eine hypothetische PNA-RNA-Maisonette zwischen PNA P3 und ssRNA1 in einer parallelen Ausrichtung gebildet. Die sterische Zusammenstoß ist für die Watson-Crick wie Q-G und L-G-Paare angegeben. (B) Melting Kurven für verschiedene PNAs Bindung an ssRNA1. Die Schmelztemperaturen werden für die Kurven mit schmelzender Übergänge angezeigt. Die Figur ist aus Referenz31angepasst.

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Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

9.4K Aufrufe.  Nanyang Technological University. Wir berichten über die Protokolle für die Synthese und Reinigung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Oligomere Einbeziehung geändert Rückstände. Die biochemischen und biophysikalischen Methoden zur Charakterisierung der Anerkennung von RNA Maisonetten durch die modifizierte PNAs werden beschrieben.

Serie: Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

Isolation of Cognate RNA-protein Complexes from Cells Using Oligonucleotide-directed Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. They are composed of position-dependent, cis-acting RNA elements and unique combinations of RNA binding proteins. Defining the composition of a specific RNP is essential to achieving a fundamental understanding of gene regulation. The isolation of a select RNP is akin to finding a needle in a haystack. Here, we demonstrate an approach to isolate RNPs associated at the 5' untranslated region of a select mRNA in asynchronous, transfected cells. This cognate RNP has been demonstrated to be necessary for the translation of select viruses and cellular stress-response genes.
The demonstrated RNA-protein co-precipitation protocol is suitable for the downstream analysis of protein components through proteomic analyses, immunoblots, or suitable biochemical identification assays. This experimental protocol demonstrates that DHX9/RNA helicase A is enriched at the 5' terminus of cognate retroviral RNA and provides preliminary information for the identification of its association with cell stress-associated huR and junD cognate mRNAs.

This manuscript describes an approach to isolate select cognate RNPs formed in eukaryotic cells via a specific oligonucleotide-directed enrichment. We demonstrate the applicability of this approach by isolating a cognate RNP bound to the retroviral 5' untranslated region that is composed of DHX9/RNA helicase A.

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Ribonucleoprotein particles direct the biogenesis and post-transcriptional regulation of all mRNAs through distinct combinations of RNA binding proteins. ...

Forschung

Biochemie

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Neuartige RNA-bindende Proteine ​​Isolation durch die rasche Methodik

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Nucleoside Triphosphates - From Synthesis to Biochemical Characterization

The traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the use of solid-phase synthesis by appending suitably modified phosphoramidite precursors to the nascent chain. However, the conditions used during the synthesis and the restriction to rather short sequences hamper the applicability of this methodology. On the other hand, modified nucleoside triphosphates are activated building blocks that have been employed for the mild introduction of numerous functional groups into nucleic acids, a strategy that paves the way for the use of modified nucleic acids in a wide-ranging palette of practical applications such as functional tagging and generation of ribozymes and DNAzymes. One of the major challenges resides in the intricacy of the methodology leading to the isolation and characterization of these nucleoside analogues.
	
	In this video article, we present a detailed protocol for the synthesis of these modified analogues using phosphorous(III)-based reagents. In addition, the procedure for their biochemical characterization is divulged, with a special emphasis on primer extension reactions and TdT tailing polymerization. This detailed protocol will be of use for the crafting of modified dNTPs and their further use in chemical biology.

The protocol described herein aims to explain and abridge the numerous obstacles in the way of the intricate route leading to modified nucleoside triphosphates. Consequently, this protocol facilitates both the synthesis of these activated building-blocks and their availability for practical applications.

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

The  traditional strategy for the introduction of chemical functionalities is the  use of solid-phase synthesis by appending suitably modified ...

Chemie

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to control gene expression. These regulatory proteins control gene expression either at the level of DNA (transcription) or at the level of RNA (pre-mRNA splicing, polyadenylation, mRNA transport, decay, and translation). Identification of regulatory sequences helps understand not only how a gene is switched on or off, but also which downstream genes are regulated by a particular regulatory protein. Here, we describe a one-step approach that allows saturation mutagenesis of a protein binding site in RNA. It involves doping DNA template with non-wild-type nucleotides within the binding site, synthesis of separate RNAs with each phosphorothioate nucleotide, and isolation of the bound fraction following incubation with protein. Interference from non-wild-type nucleotides results in their preferential exclusion from the protein-bound fraction. This is monitored by gel electrophoresis following selective chemical cleavage with iodine of phosphodiester bonds containing phosphorothioates (phosphorothioate mutagenesis or PTM). This single-step saturation mutagenesis approach is applicable to the characterization of any protein binding site in RNA.

Proteins that bind specific RNA sequences play critical roles in gene expression. Detailed characterization of these binding sites is crucial for our understanding of gene regulation. Here, a single-step approach for saturation mutagenesis of protein-binding sites in RNA is described. This approach is relevant for all protein-binding sites in RNA.

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1 Nef, not only retain their biological function, but can also competitively inhibit the function of the full-length protein. A set of 20 Nef scanning peptides, 20 amino acids in length with each overlapping 10 amino acids of its neighbor, were used to identify motifs in Nef responsible for its induction of apoptosis. Peptides containing these apoptotic motifs induced apoptosis at levels comparable to the full-length Nef protein. A second peptide, derived from the Secretion Modification Region (SMR) of Nef, retained the ability to interact with cellular proteins involved in Nef's secretion in exosomes (exNef). This SMRwt peptide was used as the "bait" protein in co-immunoprecipitation experiments to isolate cellular proteins that bind specifically to Nef's SMR motif. Protein transfection and antibody inhibition was used to physically disrupt the interaction between Nef and mortalin, one of the isolated SMR-binding proteins, and the effect was measured with a fluorescent-based exNef secretion assay. The SMRwt peptide's ability to outcompete full-length Nef for cellular proteins that bind the SMR motif, make it the first inhibitor of exNef secretion. Thus, by employing the techniques described here, which utilize the unique properties of specific short peptides derived from motifs found in full-length proteins, one may accelerate the identification of functional motifs in proteins and the development of peptide-based inhibitors of pathogenic functions.

Techniques to dissect the mechanisms underlying the secretion of HIV-1 Nef in exosomes are described. Specific short peptides derived from Nef and protein transfection were exploited to determine the structure, function, and binding partners of Nef&#x2019;s Secretion Modification Region. These procedures have general relevance in many mechanistic studies.

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

Immunologie und Infektion

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome by identifying their molecular partners, DNA, proteins and/or RNAs. The latter can interact with lncRNA through networks involving proteins, but they can also be engaged in direct RNA/RNA interactions. We, therefore, developed an easy-to-use RNA pull-down procedure that allowed identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a lncRNA using psoralen, a molecule that cross-links only RNA/RNA interactions. Bioinformatics modeling of the lncRNA secondary structure allowed the selection of several specific antisense DNA oligonucleotide probes with a strong affinity for regions displaying a low probability of internal base pairing. Since the specific probes that were designed targeted accessible regions throughout the length of the lncRNA, the RNA-interaction zones could be delineated in the sequence of the lncRNA. When coupled with a high throughput RNA sequencing, this protocol can be used for the whole direct RNA interactome studies of a lncRNA of interest.

An easy-to-use RNA pull-down protocol is designed for the identification of RNAs engaged in direct RNA/RNA interaction with a long non-coding RNA. The protocol uses psoralen as a fixative to cross-link only RNA/RNA interactions and provides the whole direct RNA interactome of a long non-coding RNA when coupled with RNA sequencing.

The growing role attributed nowadays to long non-coding RNAs (lncRNA) in physiology and pathophysiology makes it crucial to characterize their interactome ...

Identification of RNA Fragments Resulting from Enzymatic Degradation using MALDI-TOF Mass Spectrometry

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, and free radicals, are ubiquitous. As a result, RNA undergoes various reactions that include its cleavage, degradation, or modification, leading to biologically relevant species with distinct functions and implications. One example is the oxidation of guanine to 7,8-dihydro-8-oxoguanine (8-oxoG), which may occur in the presence of reactive oxygen species (ROS). Overall, procedures that characterize such products and transformations are largely valuable to the scientific community. To this end, matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry is a widely used method. The present protocol describes how to characterize RNA fragments formed after enzymatic treatment. The chosen model uses a reaction between RNA and the exoribonuclease Xrn-1, where enzymatic digestion is halted at oxidized sites. Two 20-nucleotide long RNA sequences [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)G CUA AAA GU] and [5&#39;-CAU GAA ACA A(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU] were obtained via solid-phase synthesis, quantified by UV-vis spectroscopy, and characterized via MALDI-TOF. The obtained strands were then (1) 5&#39;-phosphorylated and characterized via MALDI-TOF; (2) treated with Xrn-1; (3) filtered and desalted; (4) analyzed via MALDI-TOF. This experimental setup led to the unequivocal identification of the fragments associated with the stalling of Xrn-1: [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)G CUA AAA GU], [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG)(8-oxoG) CUA AAA GU], and [5&#39;-H2PO4-(8-oxoG) CUA AAA GU]. The described experiments were carried out with 200 picomols of RNA (20 pmol used for MALDI analyses); however, lower amounts may result in detectable peaks with spectrometers using laser sources with more power than the one used in this work. Importantly, the described methodology can be generalized and potentially extended to product identification for other processes involving RNA and DNA, and may aid in the characterization/elucidation of other biochemical pathways.

MALDI-TOF was used to characterize fragments obtained from the reactivity between oxidized RNA and the exoribonuclease Xrn-1. The present protocol describes a methodology that can be applied to other processes involving RNA and/or DNA.

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

RNA is a biopolymer present in all domains of life, and its interactions with other molecules and/or reactive species, e.g., DNA, proteins, ions, drugs, ...

<meta charset="utf8"></head><body>Präzisions-DNAzyme-Nanomaschinen für die diskriminative RNA- und DNA-Analyse

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei DNA-Nanosensoren – Bewältigung der Herausforderungen bei Empfindlichkeit und Selektivität beim molekularen Nachweis

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Isolierung von Cognate RNA-Protein-Komplexe von Zellen unter Verwendung von Oligonukleotid-gerichtete Elution

Neuartige RNA-bindende Proteine Isolation durch die rasche Methodik

Nucleosidtriphosphaten - von der Synthese zur biochemischen Charakterisierung

Ein neuartiger Sättigung Mutagenese Ansatz: Einzelschritt Charakterisierung der regulatorischen Protein Bindungsstellen im RNA mit Phosphorthioate

Erkundung des Sequenzraums zur Identifizierung von Bindungsstellen für regulatorische RNA-bindende Proteine

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Identification of RNAs Engaged in Direct RNA-RNA Interaction with a Long Non-Coding RNA

Identifizierung von RNA-Fragmenten aus dem enzymatischen Abbau mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Sequenz-spezifische und gezielte Anerkennung der Doppelstrang-RNA über Single-Stranded RNA durch chemisch modifiziert Peptid-Nukleinsäuren

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