Diese Arbeit wurde vom NIH / NIGMS / MBRS (Zuschuss 58268), NIH / NCRR / RCMI (Zuschuss G12-RR03034), Georgia Research Alliance Finanzierung Zuschuss GRA.VAC08.W, NIH / NIAID / NRSA Zuschuss F31AI091484, Emory CFAR Zuschuss P30 unterstützt A1050409. Diese Untersuchung wurde in einer Anlage mit Unterstützung von Forschungseinrichtungen Improvement Grant # C06 RR18386 von NIH / NCRR konstruiert durchgeführt. Die Jurkat-Zellen, die Menge von 20 HIV-1 Nef Peptide sowie die Kaninchen-Anti-HIV-1 Nef Antiserum aus dem NIH AIDS Research &amp; Reference Reagent Program (Rockville, MD) erhalten.

I. Verwendung von kurzen Peptiden in biologischen Analyse I.1. Mapping biologisch funktionelle Motive unter Verwendung von Peptiden <ol><li> Die Behandlung von Zellen mit Nef Scannen Peptide <ol><li> Beschaffen eines Satzes von Peptiden, Abtasten des Bereichs von Interesse. Für unsere Experimente 20mer Peptide mit 10 Aminosäuren überlappen, überspannen die gesamte HIV-1 Nef-Protein (205 aa) wurden von der AIDS-Reagenz-Programm erhalten. Die Peptide werden einzeln wie folgt getestet: </li><li> In 10 ng / ml des Peptids zu dem Zellkulturmedium. </li><li> 10 ml Kulturmedium pro Platte auf Zellkulturen Jurkat. </li><li> Inkubieren Kulturen für 24 Stunden bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Klemme deoxynucleotidyltransferase-vermittelte dUTP Nick End Biotin Labeling (TUNEL)-Assay von Apoptose <ol><li> Waschen der Zellen mit PBS 1X und befestigen für 30 min bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd in 1 × PBS, pH 7,4. </li><li> Waschen mit 1 × PBS und Permeabilisierung mit 0,1% Triton X-100 für 10min bei Raumtemperatur. </li><li> Spülen Sie die Zellen zweimal mit 1 × PBS. </li><li> Graf gefärbten Zellen durch Epifluoreszenz auf einem Computer-gesteuerten System Mikroskopie. </li></ol></li></ol> I.2. Competitive Analysis Inhibition unter Verwendung von Peptiden <ol><li> Co-Transfektion von Peptiden mit Hilfe der Chariot Protein Lieferung Reagent Kit <ol><li> Per Transfektion Reaktionsmischung verdünnte 1 ug wtNef-GFP Plasmid-DNA und 100 ng entweder Wildtyp-Peptide aus der SMR-Domäne stammen, oder Peptide, die Alanin-Austausch einzelner Aminosäuren in der SMR-Motiv, mit einem Gesamtvolumen von 100 ul mit 1X PBS. </li><li> Verdünnen 6 ul einer 1/10 Verdünnung von Chariot Reagenz zu einem Endvolumen von 100 ul mit sterilem Wasser, und verbinden sich mit der verdünnten DNA-Peptid-Mix. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, um die Bildung des Wagens / DNA-Peptid-Komplex zu erlauben. </li><li> Pellet 3 x 10 5 Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 600 xg für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X und Resuspension in der Chariot / DNA-Peptid-Komplex. </li><li> In 400 ul serumfreiem RPMI 1640-Medium zu der Suspension und Inkubation der Zellen in Petrischalen bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> 1 ml frisches RPMI 1640-Medium mit 10% FBS zu jeder Platte, und Inkubieren der Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Ernten Sie die Zellen und bestimmen Transfektionseffizienz durch Fluoreszenz-Mikroskopie. </li></ol></li><li> Nef-GFP Sekretion fluoreszierenden Platte Leser-Test von Peptid-Hemmung <ol><li> Sammeln des zellfreien konditionierten Medien aus den geernteten Zellen und dann 100 ul in einzelne Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte schwarz. </li><li> Measure GFP-Fluoreszenz in den Medien auf einem Tecan GENEios Fluorimeters mit Anregungswellenlänge 485 nm und Emissionswellenlänge 515 nm in relativen Fluoreszenzeinheiten. </li><li> Stellen Sie das Niveau der GFP-Fluoreszenz in der Kontrollgruppe (Medien von Zellen mit Nef-GFP kotransfiziert und einen zerhackten Peptid) Bei 100%. </li><li> Man vergleiche dies mit der Ebene der GFP-Fluoreszenz in den Medien von Zellen mit verschiedenen Peptiden SMR cotransfiziert, um Änderungen in Nef-GFP-Sekretion bestimmen. </li></ol></li></ol> I.3. Isolieren Motif Binding Partner unter Verwendung von Peptiden als Köder <ol><li> Co-Immunpräzipitation mit SMR Peptide <ol><li> Wachsen Jurkat-Zellen in RPMI 1640-Medium mit 10% FBS bei 37 ° C in einem T-75 Zellkulturflasche und Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Bestimmen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie die Platte unter einem Fluoreszenzmikroskop, Bilder aufnehmen und anschließend zählen die insgesamt und markierten Zellen und bestimmen die Prozent markierten Zellen. </li><li> Zellpellet in 1 ml 1X PBS, und überträgt es auf einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. Microcentrifuge bei 1.000 xg für 1 min. Das Pellet in 1 ml α-FLAG Lysis Puffer durch vorsichtiges Pipettieren. Lysepuffer: Mix 50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM Natrium chlorid [NaCl], 1 mM EDTA und 1% Triton X-100, mit 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid [PMSF] und 10 ul / ml Protease Inhibitor Cocktail für die Verwendung mit Säugerzellen und Gewebeextrakten [PIC; Sigma]. Als unmittelbar vor dem Gebrauch. </li><li> Unterschiedlich Mikrozentrifugengefäß die Suspensionen bei 2.000 xg für 5 min, und bei 13.000 g für 10 min zur Pelletierung der Zelltrümmer und DNA sind. Die überstehende Flüssigkeit (im folgenden als &quot;Lysat&quot; bezeichnet). </li><li> 1 mg Lysat Eiweiß und 1 ug entweder der SMRwt oder SMRmut Peptid 20 ul anti-FLAG M2 Affinity Gel (im Folgenden als &quot;Harz&quot;; Sigma). Beachten Sie, dass sowohl SMRwt und SMRmut welche hier einen FLAG-Tag-Sequenz in den Peptide eingebettet haben. Bringen Sie die Mischung auf ein Gesamtvolumen von 1 ml in Co-IP-Puffer (α-FLAG Lysepuffer minus PMSF und PIC). Inkubieren der Mischung bei 4 ° C über Nacht mit end-over-end Drehung. Als negative Kontrolle inkubieren des Lysats mit dem Harz in Abwesenheit von entweder Peptid. </li><li> Pellet das Harz durch Mikrozentrifugation bei 5.000 - 8.000 × g für 30 sek. Erlauben Harz für 2 min vor dem Umgang mit der Probe absetzen und dann den Überstand aspirieren. Entfernen Sie den Überstand mit einer Schmalspurbahn Ende Pipettenspitze oder einer Hamilton-Spritze, man aufpassen, nicht jede Harz übertragen. Narrow-End-Pipettenspitzen können mit einer Pinzette, um die Eröffnung eines Kunststoffpipettenspitze kneifen, bis es teilweise geschlossen ist. Das Harz viermal mit 500 ul Waschpuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4 und 150 mM NaCl). Eluieren der gebundenen zellulären Proteinen mit 15 ug 3X FLAG-Peptid (Sigma) in 50 ul Waschpuffer und Inkubation für Ventildeckel / Schüttler für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Eluate durch Aceton Niederschlag, durch Kochen in Laemmli Probenpuffer (Bio-Rad) gefolgt. Trennen der Proteine ​​durch SDS-PAGE auf einem 4-20% Tris-HCl Kriterium vorgefertigte Gel (Bio-Rad). Färben Sie das Gel mit Coomassie Brilliant Blue R-250 (Bio-Rad). Hinweis: für die Massenspektrometrie Identifizierung Experimente ( <strong&gt; 4A), wobei jeder Zustand (Co-IP mit SMRwt, SMRmut oder ohne Peptid) wurde vierfach durchgeführt, und die Eluate aller vier Wiederholungen wurden vor Acetonfällung für insgesamt 4 mg Gesamtprotein Eingabe / gepoolten Bedingung). </li></ol></li><li> Co-Immunpräzipitation mit Nef-Protein GFP <ol><li> Mix 50 ul Dynabeads Protein G magnetischen Kügelchen (Invitrogen) mit 2 ug monoklonalen anti-GFP in 1 ml 1X PBS mit 0,02% Tween 20 (PBS-T). Inkubieren der Mischung mit end-over-end Drehung in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen für 1 Stunde bei 4 ° C. </li><li> Trennen Sie die Perlen aus dem Puffer, indem das Röhrchen auf einem 1,5-ml Magnasphere Technologie Magnetic Separation Stand (Promega Corp, Madison, WI) ermöglicht magnetischen Pulldown gefolgt von der Entfernung des Überstandes. Waschen Sie die anti-GFP beschichteten Beads mit 1 ml PBS-T mit sanften Pipettieren. </li><li> Lyse Nef-GFP transfizierten Jurkat-Zellen mit 1 ml RIPA + 1X Puffer durch vorsichtiges Pipettieren und Inkubation für 15 min auf Eis. RIPA Puffer +: 10X RIPA Lysis-Puffer, pH 7.4 [Millipore, Bedford, MA] 1:10 in sterilem Wasser, 0,02% Natriumazid [Sigma], und 0,1% Natriumdodecylsulfat [SDS], mit 1 mM PMSF und 10 ul / ml PIC hinzugefügt unmittelbar vor dem Gebrauch. </li><li> Pellet die Zelltrümmer durch Mikrozentrifugation bei 2.000 × g für 10 min. Die überstehende Flüssigkeit (im folgenden als &quot;Lysat&quot; bezeichnet). </li><li> 1 mg Lysat Protein zu den anti-GFP beschichteten Kügelchen, bringen das Endvolumen auf 1 ml mit 1X RIPA + Puffer und Inkubation der Mischung mit end-over-end Rotation für 1 Stunde bei 4 ° C. Hinweis: Für Peptid Wettbewerb Studien, 1 mg Lysate Protein kann mit 2 ug SMRwt oder SMRmut Peptid werden in 1 ml RIPA + 1X Puffer, bevor sie an den anti-GFP Kügelchen hinzugefügt vorinkubiert. </li><li> Waschen Sie die Perlen durch Resuspension in 1 ml Waschpuffer (50 mM Tris • HCl pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1% Tween 20). Inkubieren mit end-over-end Drehung für 5 min bei 4 ° C. Trennen Sie die Perlen from die Wäsche mit dem Magnetic Separation-Stand. Waschen Sie die Perlen ein zweites und drittes Mal mit Waschpuffer mit 250 mM und 300 mM NaCl, beziehungsweise. </li><li> Resuspendieren der Beads in 200 ul PBS, die Masse in ein sauberes Röhrchen, und trennen Sie die Perlen aus der Wäsche auf dem magnetischen Standfuß. Kochen Sie die Perlen in 50 ul Laemmli Probenpuffer 5 min bei 95 ° C, lassen Sie die Mischung für 10 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, und legen Sie dann die Mischung auf dem magnetische Halterung für die Trennung, und sammeln Sie die Überstände (&quot;Eluate&quot;) . </li><li> Trennen der Proteine ​​im Eluat mittels SDS-PAGE auf einem 8-16% Tris-HCl Kriterium vorgefertigte Gel. </li></ol></li><li> Massenspektrometrie <ol><li> Steuerverwaltung die Proteinbanden von Interesse aus Coomassie-gefärbten Gelen. </li><li> Reduzieren Sie die Proben in 10 mM 1,4-Dithiothreitol (DTT) für 45 min bei 37 ° C </li><li> ALKYLAT die Proben in 55 mM iodoacetamide für 45 min bei 25 ° C. </li><li> Verdauen die Proben über Nacht mit sequencing grade tryPSIN (Promega) bei 37 ° C. </li><li> Desalt die Probe Peptide mit C-18 ZipTip (Millipore). Mischen Sie die Probe Peptide mit alpha-CHC Matrix (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), und sie vor Ort auf eine MTP Zielframe III (Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA). </li><li> Führen Tandem Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionisation Zeit of-flight (MALDI-TOF/TOF)-Massenspektrometrie-Analyse unter Verwendung eines Bruker Daltonics ultraflex III TOF / TOF. </li><li> Vergleichen Sie die MS / MS-Daten der NCBI nicht-redundante und Swiss-Prot-Datenbanken mit der Mascot-Algorithmus ( <a href="http://www.matrixscience.com" target="_blank">www.matrixscience.com</a> ). </li></ol></li><li> Immunoblot-Analyse <ol><li> Abtrennung des Proteins Proben durch SDS-PAGE auf 4-20% oder 8-16% Tris-HCl Kriterium Fertiggelen (Bio-Rad). Übertragen der Bänder elektrophoretisch auf eine Nitrocellulose-Membran. </li><li> Waschen Sie die Membran in Tris Buffered Saline (TBS; Bio-Rad) für 5 min. Blockieren mit 5% Magermilch in TTBS (TBS mit 0,1% Tween 20) 1 h unter Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Verfahren der Membran Immunoblot mit einem spezifischen primären Antikörper in 5% fettfreier Milch unter Schütteln bei 4 ° C über Nacht. Waschen in TTBS für 20 min durch einen sekundären HRP konjugierten IgG (H + L)-Antikörper in 5% fettfreier Milch für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Waschen in TTBS für 30-60 min. </li><li> Erkennen die Proteinbanden durch Western Blot Luminol Reagenz (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Setzen Sie die Filter, um fotografischen Film. Anmerkung: In einigen Experimenten wurde eine Stripping-Reagenz wurde verwendet, um die Membran (Pierce, Rockford, IL) mit anschließender Hybridisierung mit einem anderen primären und sekundären Antikörper abzustreifen. </li><li> Scannen Sie die X-ray-Filme in Adobe Photoshop 5.0.2. Führen Densitometrie Analyse mit ImageJ Software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). </li></ol></li></ol> II. Verwendung von Antikörper Inhibition in Functional Analysis II.1. Co-Transfektion von Antiköries mit dem Chariot Protein Lieferung Reagent Kit <ol><li> Per Transfektion Reaktionsmischung verdünnte 1 ug wtNef-GFP Plasmid-DNA und 1 ug entweder anti-Mortalin Antikörper oder anti-α-Tubulin-Antikörper, auf ein Endvolumen von 100 ul mit 1X PBS. Anmerkung: Es wurde zuvor festgestellt, dass die Co-Transfektion der anti-α-Tubulin-Antikörper keine nachweisbare Wirkung auf die Sekretion exNef hat, und dient somit als eine effektive negative Kontrolle in diesen Experimenten. </li><li> Verdünnen 6 ul unverdünnt Chariot Reagenz zu einem Endvolumen von 100 ul mit sterilem Wasser, und verbinden sich mit der verdünnten DNA-Antikörper-Mix. </li><li> Inkubieren bei Raumtemperatur für 30 min, um die Bildung des Wagens / DNA-Antikörper-Komplexes erlauben. </li><li> Pellet 3 x 10 5 Jurkat Zellen durch Zentrifugation bei 600 xg für 5 min. </li><li> Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X und Resuspension in der Chariot / DNA-Antikörper-Komplex. </li><li> In 400 ul serumfreiem RPMI 1640-Medium zu der Suspension und Inkubation der cEllen in Petrischalen bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> 1 ml frisches RPMI 1640-Medium mit 10% FBS zu jeder Platte, und Inkubieren der Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C. </li></ol> II.2. Nef-GFP Sekretion Fluorescent Assay Plate Reader von Antikörper Inhibition <ol><li> Sammeln des zellfreien konditionierten Medien aus den geernteten Zellen und dann 100 ul in einzelne Vertiefungen einer 96-well Mikrotiterplatte schwarz. </li><li> Measure GFP-Fluoreszenz in den Medien auf einem Tecan GENEios Fluorimeters mit Anregungswellenlänge 485 nm und Emissionswellenlänge 515 nm in relativen Fluoreszenzeinheiten. </li><li> Stellen Sie das Niveau der GFP-Fluoreszenz in der Kontrollgruppe (Medien von Zellen mit Nef-GFP und anti-α-Tubulin-Antikörper co-transfiziert) bei 100%. </li><li> Man vergleiche dies mit der Ebene der GFP-Fluoreszenz in den Medien von Zellen, die mit anti-Mortalin-Antikörper cotransfiziert, um Änderungen in Nef-GFP-Sekretion bestimmen. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-Depletion und CIA, die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese. Mit diesem Ziel haben wir eine Reihe von neuartigen Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren und damit beginnen, die zelluläre Proteine ​​beteiligt zu bestimmen erlaubt. Dieser...

Mit dem Aufkommen der antiretroviralen Therapie, hat die AIDS-Epidemie in der westlichen Welt wurde verlangsamt, aber nicht eingeschränkt, und die Ausbreitung von HIV nach wie vor eine große gesundheitliche Belastung auf der ganzen Welt sein. Mit Ausnahme der geringfügig wirksam RV144 Thai-Studie, haben HIV-Impfstoffe bisher fehlende vor Infektionen zu schützen gezeigt. Somit ist die Erforschung zusätzlicher, potentielle therapeutische Targets noch gerechtfertigt. Zusammen mit CD4 T-Zell-Depletion ist anhaltenden generalisierten Aktivierung des Immunsystems ein Markenzeichen der HIV-Infektion. Diese chronische Aktivierung Immune (CIA) führt in die Zellerneuerung aktiviert und differenziert lymphatischer Subpopulationen zelluläre Seneszenz und Erschöpfung, und die Tötung von T-Zellen und B-Zellen über Aktivierungs-induzierte Zelltod (AICD) 1,2,3 erhöht, und es ist bekannt als einer der stärksten Prädiktoren der Krankheitsprogression 4,5,6,7,8,9,10,11,12 gegründet. Doch die Mechanismen zugrunde CIA und CD4T-Zell-Depletion bei HIV-Infektionen bleiben vollständig aufgeklärt werden. Evidence aus unserem Labor und andere führte uns zu einem Vorbild für Krankheitsprogression (Abbildung 1), wobei das HIV Protein Nef (Negative Regulatory Factor) induziert die Sekretion in Exosomen von HIV-1-infizierten Zellen 13,14. Diese Nef enthaltenden Exosomen (exNef) Apoptose in einer Anzahl von Zelllinien, einschließlich nicht-infizierten CD4 T-Zellen 15,16. Alternativ kann in Monozyten / Makrophagen exNef ändert Genexpressionsmuster, zB Cytokin-Expression und scheint einen Zustand der Zeitplan Aktivierung des Immunsystems zu induzieren. Dieser Körper des Beweises schlägt eine wichtige Rolle für exNef in CIA und CD4 T-Zell-Depletion. Das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen Nef die Fähigkeit zu manipulieren die exosomalen Menschenhandel Weg wird in der Technik neuartige Inhibitoren der exNef Sekretion nützlich. Hemmung der Sekretion exNef sollte vermindern die CD4 T-Zell-DepletionCIA und die Fahrt HIV / AIDS Pathogenese. Um die Beweise dafür, dass unser Modell für HIV / AIDS Krankheitsverlauf und die nachfolgenden Daten, die auf diesem Modell zu bauen, führte zu sammeln, haben wir eine Reihe neuer Reagenzien und Methoden, die uns die Genetik der exNef Sekretion analysieren erlaubt, und fangen an, die bestimmen, zelluläre Proteine ​​beteiligt. In der ersten Arbeit, fanden wir, dass Nef-Protein Apoptose in Bystander-Zellen induziert und extrazellulär von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen freigesetzt 15. Peptide, die von SDF-1α (Stromazellen abgeleiteten Faktor-1, zu alternativem Spleißen alpha) abgeleitet wurde zuvor gezeigt, dass viel von der Bindung und Signalisierung Aktivität des Volllängenmolekül 17 beizubehalten. Wir spekuliert, dass Peptide Nef könnten einige der apoptotischen Aktivität des vollständigen Proteins, und dass diese Peptide zwangsläufig enthalten Nef apoptotischen Domäne (n) zu halten. Um diese Peptide zu identifizieren und damit das Nefapoptotischen Domain (s), erhalten wir eine Reihe von 20 HIV-1 Nef Scannen Peptide aus dem NIH AIDS Forschung und Reference Reagent Programm. Diese 20-aa Peptide, jeweils überlappenden 10 Aminosäuren von seinem Nachbarn, durch die Anzahl ihrer letzten Aminosäure, dh N20 Spannweiten Nef Aminosäuren 1-20, N30 Spannweiten Nef Aminosäuren 11-30, etc 16 benannt. Wir fanden, dass T-Zellen Aussetzen extrazellulär um spezifische Peptide überlappenden zwei verschiedene 10-aa-Domänen in der full-length Nef-Protein induziert Apoptose in diesen Zellen. Eine anschließende Analyse dieser Nef-abgeleiteten Peptide zeigten apoptotische ihre Fähigkeit, physisch mit den Chemokinrezeptor CXCR4 auf der Oberfläche von T-Zellen, mit Bindungskinetik, dass diese Peptide kompetitiv hemmen zwischen CXCR4 und ihre natürlichen Liganden SDF-1α-Bindung erlaubt interagieren. Schließlich wurde das Nef-abgeleiteten Peptide apoptotischen &#39;Interaktion mit CXCR4 gefunden, um eine Stress-Reaktion in dieser T-Zellen führt zu Apoptose zu induzieren. Diese Beweise konnten wir quickly Karte Nef die funktionellen Domänen, ein Prozess, der viel länger gedauert haben, mit Standard-DNA-Techniken wie erbgutverändernd Alanin-Scanning-Mutagenese. Es zeigte auch, dass diese kurze Nef-abgeleitete Peptide die biologische Funktion der apoptotischen Domänen in dem Protein voller Länge erhalten. Nach der Identifizierung eine Rolle für extrazelluläre Nef, dh Apoptose von T-Zellen, suchten wir ein besseres Verständnis davon, wie Nef wurde aus Zellen abgesondert. Mittels einer Reihe von mutierten Konstrukte Nef, wir abgebildet hochkonservierten Nef-Protein Motive in den N-terminalen Regionen von sowohl HIV Nef und seine Rhesusaffen entspricht SIV Mac ​​(Simian Immunodeficiency Virus) Nef, die kritisch für exNef Sekretion 13 sind. Eines dieser Motive, die Sekretion Modification Region (SMR; 66VGFPV70), war besonders kritisch, da Alanin Ersatz eines seiner fünf Aminosäuren entweder stark reduziert oder abgeschafft exNef Sekretion. Wenn die Zellen über Active Motif der C geliefertHariot Protein Lieferung Reagenz, ein Peptid, das die SMR an einem FLAG-Peptid-Sequenz (SMRwt) wurde festgestellt, dass exNef Sekretion sowohl von Nef-transfizierten und HIV-infizierten Zellen 18 hemmen. Basierend auf unseren bisherigen Erfahrungen mit Peptiden, beschlossen wir, dieses Peptid zu verwenden, um die Moleküle und Mechanismen der Nef SMR Rolle in exNef Sekretion aufzuklären. Mit dem SMRwt Peptid als unsere &quot;Köder-Protein&quot;, wir co-immunpräzipitiert zellulären Bindungspartner des SMR von infizierten T-Zell-Lysaten 18. Die FLAG-Peptid-Sequenz bot eine bequeme Handhabe für die Erfassung der SMRwt Peptid mit anti-FLAG Affinitätsharz. Unsere bisherigen Feststellung, dass eine einzige Mutation Valin im SMRwt Peptid Alanin ausreichend für die Abschaffung ihrer Hemmung der Sekretion exNef identifiziert eine komfortable, sehr spezifische Kontrolle Peptid (SMRmut), die wir verwendet, um auszuschließen, Co-immunpräzipitierten Proteine ​​nicht spezifisch für die SMR. Verwendung eines Peptids mit der specific Domäne von Interesse anstatt der Volllängenprotein erlaubt uns, das Screening von Dutzenden von zellulären Faktoren, die zu anderen Domänen in Nef 19 binden zu umgehen. Sobald wir identifizierten die SMR-Bindungspartner, ein logischer nächster Schritt war es zu zeigen, dass die identifizierten zellulären Bindungspartner wichtig sind für die biologische Funktion 18. Das Standardverfahren dies zu tun ist, um Knockdown Protein-Ebene mit Zielprotein-spezifische miRNA oder siRNA, und anschließend Assay die Auswirkungen auf die biologische Funktion. Wir führten miRNA Knockdown, die Übersetzung der Ziel-mRNA inhibiert, Senkung der Produktionskosten des Ziels, in diesem Fall ein SMR-bindendes Protein. Diese Verringerung des Zielproteins ist eine indirekte Wirkung und gegebenenfalls eine verzögerte Wirkung auf die biologische Funktion des Zielproteins eine Rolle spielt in. Folglich haben wir auch die weniger häufig Antikörper Hemmung Technik eingesetzt werden, um festzustellen, ob direkt durch Stören der Aktivitätdas Zielprotein verringert oder beseitigt die biologische Funktion. In diesem Verfahren erhöht Antikörper gegen das Zielprotein in der Zelle unter Verwendung Chariot Reagenz transfiziert und interagieren direkt mit dem Zielprotein entweder Maskierungsmittel es von seinem Ort der Funktion oder Sperrung der entsprechenden bindenden Domäne. Die Hemmung des Zielproteins durch dieses Verfahren direkt stört ihre Funktion und kann RNA Knockdown Verfahren durch weitere Bestätigung der Bedeutung des Zielproteins an das biologische Funktion ergänzen. Während Chariot Reagenz ist wirksam bei der Bereitstellung von Peptiden und Proteinen in Zellen, das Verfahren ist zeitraubend und begrenzt die Arten von Experimenten, z. B. längere oder wiederholte Aufnahmen und in vivo Tierversuchen, die durchgeführt werden können. Folglich haben wir einen zellpenetrierendes Peptid (CPP)-Sequenz des Peptids SMRwt (SMRwt-CPP) 18, ein Peptid, das von Zellen aufgenommen könnten passiv zu generierenaus dem Kulturmedium. Diese Version war ebenso wirksam wie bei der Hemmung der ehemaligen exNef Sekretion. Die Erkenntnisse aus dieser veröffentlichten Versuche demonstriert die Fähigkeit von kleinen Peptiden, die spezifische funktionelle Motive, um die Funktion des Proteins vollständiger Länge durch kompetitive Hemmung antagonisieren, und die Proteine, die diese Motive binden isolieren. Man würde erwarten, dass diese Techniken sollten in vielen experimentellen Protokolle nützlich. Sie sollten auch wirksam in der Technik neue Peptid-Inhibitoren vieler zellulärer Prozesse, eine Funktion, die weiter verbessert werden durch Bindung an CPP-Sequenzen.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent </td>
 <td>Company </td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20mer peptide set with 10 amino acid overlap</td>
 <td>NIH AIDS Research and Reference Reagent Program</td>
 <td>4641</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TUNEL Assay</td>
 <td>Roche</td>
 <td>11 684 809 910</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Chariot Protein Delivery Reagent</td>
 <td>Active Motif</td>
 <td>30100</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan GENEios fluorimeter</td>
 <td> (Tecan Group, Switzerland)</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96-well black microtiter plate</td>
 <td>Corning</td>
 <td>3792</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>anti-FLAG M2 Affinity Gel</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>A2220</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dynabeads Protein G magnetic beads </td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>100.03D</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MagnaSphere Technology Magnetic Separation Stand (two position)</td>
 <td>Promega Corp., Madison, WI</td>
 <td>Z5332</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>C-18 ZipTip </td>
 <td>Millipore</td>
 <td>ZTC18S096</td>
 <td>C18 Resin (0.6 &mu;l or 0.2 &mu;l bed volumes). Oligonucleotides or small (&lt;50 kDa) proteins/ peptides in aqueous solution</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MALDI TOF/TOF</td>
 <td>Bruker Daltonics ultraflex III TOF/TOF</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

peptide-based identification of functional motifs and their binding partners

Spezifische kurze Peptide von Motiven in vollständigen Proteine ​​gefunden, in unserem Fall HIV-1 Nef abgeleitet behalten nicht nur ihre biologische Funktion, kann aber auch kompetitiv hemmen die Funktion des Proteins vollständiger Länge. Ein Satz von 20 Nef Abtastung Peptide, 20 Aminosäuren lang mit jeweils überlappenden 10 Aminosäuren seines Nachbarn, wurden verwendet, um Motive in Nef verantwortlich für die Induktion der Apoptose zu identifizieren. Peptide, die diese apoptotischen Motive induziert Apoptose in Mengen vergleichbar mit der Volllängen-Nef-Protein. Ein zweites Peptid, aus dem Sekret Modification Region (SMR) von Nef abgeleitet behielten die Fähigkeit, mit zellulären Proteinen in Nef-Sekretionssystem in exosomes (exNef) beteiligt interagieren. Diese SMRwt Peptid wurde als &quot;Köder&quot;-Protein in Co-Immunopräzipitation Experimenten an zelluläre Proteine, die spezifisch an das Nef SMR Motiv zu isolieren. Protein-und Antikörper-Transfektion Hemmung wurde verwendet, um physisch stören die Interaktion Wetteschen Nef und Mortalin, einer der isolierten SMR-bindende Proteine, und der Effekt wurde mit einem Fluoreszenz-basierte exNef Sekretion-Assay gemessen. Die SMRwt Peptid die Fähigkeit, in voller Länge Nef für zelluläre Proteine, die die SMR Motiv binden outcompete, treffen es die erste Inhibitor des exNef Sekretion. Somit kann durch Verwendung der hier beschriebenen Techniken, die die einzigartigen Eigenschaften von bestimmten kurze Peptide von Motiven in voller Länge Proteinen abgeleitet nutzen, kann eine Beschleunigung der Identifizierung funktioneller Motive in Proteinen und die Entwicklung von Peptid-basierten Inhibitoren von pathogenen Funktionen.

Mapping biologisch funktionelle Motive unter Verwendung von Peptiden. Beiden Regionen wurden auf Nef Proteine, die Apoptose zu induzieren identifiziert. Peptid-driven Apoptose wurde (Abbildung 2) zu Beginn mit Peptid N50 (aa30-50) beobachtet, Höchststand bei N60 (AA40-60) und N70 (AA50-70), und der Abnahme in den Hintergrund Ebenen, auf Peptid N100 (aa80-100). Der große Motif 1 (M1) Spitze ausgerichtet auf AA50-60 induziert&gt; 80% der Apoptoserate von der vollen Länge Nef-Protein. E...

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Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners | Immunology and Infection | Video

Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Techniken, um die Mechanismen der Sekretion von HIV-1 Nef in exosomes zerlegen beschrieben. Spezifische kurze Peptide von Nef-Protein und Transfektion abgeleitet wurden genutzt, um die Struktur, Funktion und Bindungspartner von Nef die Sekretion Modification Region bestimmen. Diese Verfahren haben allgemeine Bedeutung in vielen mechanistischen Studien.

Peptid-basierte Identifizierung von Functional Motive und ihre Bindungspartner

Specific short  peptides derived from motifs found in full-length proteins, in our case HIV-1  Nef, not only retain their biological function, but can ...

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12.3K Aufrufe.  Morehouse School of Medicine. Techniken, um die Mechanismen der Sekretion von HIV-1 Nef in exosomes zerlegen beschrieben. Spezifische kurze Peptide von Nef-Protein und Transfektion abgeleitet wurden genutzt, um die Struktur, Funktion und Bindungspartner von Nef die Sekretion Modification Region bestimmen. Diese Verfahren haben allgemeine Bedeutung in vielen mechanistischen Studien.

Serie: Peptide-based Identification of Functional Motifs and their Binding Partners

Particle Agglutination Method for Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute flaccid paralysis (AFP) cases. In the World Health Organization (WHO) Global Polio Laboratory Network, PV isolation and identification are currently being performed by using cell culture system and real-time RT-PCR, respectively. In the post-eradication era of PV, simple and rapid identification procedures would be helpful for rapid confirmation of polio cases at the national laboratories. In the present study, we will show the procedure of novel PA assay developed for PV identification. This PA assay utilizes interaction of PV receptor (PVR) molecule and virion that is specific and uniform affinity to all the serotypes of PV. The procedure is simple (one step procedure in reaction plates) and rapid (results can be obtained within 2 h of reaction), and the result is visually observed (observation of agglutination of gelatin particles).

A recently developed novel particle agglutination (PA) assay utilizing virus receptor molecule allowed a rapid and easy identification of poliovirus (PV). In this article, we will show the procedure for the PA assay for PV identification.

Partikelagglutinations Methode für Poliovirus Identification

In the Global Polio Eradication Initiative, laboratory diagnosis plays a critical role by isolating and identifying PV from the stool samples of acute ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5 These immune cells, which include mast cells, T-cells and macrophages; store and release a variety of biologically active mediators including cytokines and proteases such as tryptase.6-8 These mediators have been shown to be key players in extracellular matrix metabolism by activating matrix metalloproteinases or causing collagen accumulation by modulating the cardiac fibroblasts' function.9-11 However, available techniques for isolating cardiac immune cells have been problematic because they use bacterial collagenase to digest the myocardial tissue. This technique causes activation of the immune cells and thus a loss of function. For example, cardiac mast cells become significantly less responsive to compounds that cause degranulation.12 Therefore, we developed a technique that allows for the isolation of functional cardiac immune cells which would lead to a better understanding of the role of these cells in cardiac disease.13, 14
This method requires a familiarity with the anatomical location of the rat's xiphoid process, axilla and falciform ligament, and pericardium of the heart. These landmarks are important to increase success of the procedure and to ensure a higher yield of cardiac immune cells. These isolated cardiac immune cells can then be used for characterization of functionality, phenotype, maturity, and co-culture experiments with other cardiac cells to gain a better understanding of their interactions.

This method for isolating functional immune cells from the heart provides an alternative to the conventional methods of collagenase digestion, which causes unwanted immune cell activation, resulting in a decreased responsiveness of these cells. Our method of isolation yields functional cardiac immune cells by avoiding problems associated with enzymatic digestion.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

Following in Real Time the Impact of Pneumococcal Virulence Factors in an Acute Mouse Pneumonia Model Using Bioluminescent Bacteria

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. Despite advances in knowledge of this illness, the availability of intensive care units (ICU), and the use of potent antimicrobial agents and effective vaccines, the mortality rates remain high1. Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen of community-acquired pneumonia (CAP) and one of the most common causes of bacteremia in humans. This pathogen is equipped with an armamentarium of surface-exposed adhesins and virulence factors contributing to pneumonia and invasive pneumococcal disease (IPD). The assessment of the in vivo role of bacterial fitness or virulence factors is of utmost importance to unravel S. pneumoniae pathogenicity mechanisms. Murine models of pneumonia, bacteremia, and meningitis are being used to determine the impact of pneumococcal factors at different stages of the infection. Here we describe a protocol to monitor in real-time pneumococcal dissemination in mice after intranasal or intraperitoneal infections with bioluminescent bacteria. The results show the multiplication and dissemination of pneumococci in the lower respiratory tract and blood, which can be visualized and evaluated using an imaging system and the accompanying analysis software.

Streptococcus pneumoniae is the leading pathogen causing severe community-acquired pneumonia and responsible for over 2&#160;million deaths worldwide. The impact of bacterial factors implicated in fitness or virulence can be monitored in real-time in an acute mouse pneumonia or bacteremia model using bioluminescent bacteria.

Nach der in Echtzeit die Auswirkungen der Pneumokokken-Virulenzfaktoren in einer akuten Lungenentzündung Maus-Modells mit Biolumineszenz-Bakterien

Pneumonia is one of the major health care problems in developing and industrialized countries and is associated with considerable morbidity and mortality. ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Echtzeit-Imaging von myeloischen Zellen in Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Darmtumoren durch Spinning-Disk-konfokale Mikroskopie

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.

Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an essential step for virus particle formation, since a defect in Gag membrane binding results in severe impairment of viral particle production. To gain mechanistic details of Gag-lipid membrane interactions, in vitro methods based on NMR, protein footprinting, surface plasmon resonance, liposome flotation centrifugation, or fluorescence lipid bead binding have been developed thus far. However, each of these in vitro methods has its limitations. To overcome some of these limitations and provide a complementary approach to the previously established methods, we developed an in vitro assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes take place in a &#34;cell-like&#34; environment. In this assay, Gag binding to lipid membranes is visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique. Here we describe the background and the protocols to obtain myristoylated full-length Gag proteins and GUV membranes necessary for the assay and to detect Gag-GUV binding by microscopy.

Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle GUV Membranes

We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

The structural protein of HIV-1, Pr55Gag (or Gag), binds to the plasma membrane in cells during the virus assembly process. Membrane binding of Gag is an ...

Unravelling the Function of a Bacterial Effector from a Non-cultivable Plant Pathogen Using a Yeast Two-hybrid Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria have evolved different strategies to manipulate their host metabolism for their own benefit. This bacterial manipulation is often coupled with severe symptom development or the death of the affected plants. Determining the specific bacterial molecules responsible for the host manipulation has become an important field in microbiological research. After the identification of these bacterial molecules, called &#34;effectors,&#34; it is important to elucidate their function. A straightforward approach to determine the function of an effector is to identify its proteinaceous binding partner in its natural host via a yeast two-hybrid (Y2H) screen. Normally the host harbors numerous potential binding partners that cannot be predicted sufficiently by any in silico algorithm. It is thus the best choice to perform a screen with the hypothetical effector against a whole library of expressed host proteins. It is especially challenging if the causative agent is uncultivable like phytoplasma. This protocol provides step-by-step instructions for DNA purification from a phytoplasma-infected woody host plant, the amplification of the potential effector, and the subsequent identification of the plant&#39;s molecular interaction partner with a Y2H screen. Even though Y2H screens are commonly used, there is a trend to outsource this technique to biotech companies that offer the Y2H service at a cost. This protocol provides instructions on how to perform a Y2H in any decently equipped molecular biology laboratory using standard lab techniques.

Bacterial effector proteins are important for establishing successful infections. This protocol describes the experimental identification of proteinaceous binding partners of a bacterial effector protein in its natural plant host. Identifying these effector interactions via yeast two-hybrid screens has become an important tool in unravelling molecular pathogenicity strategies.

Die Entwirrung der Funktion eines bakteriellen Effektor aus einem nicht-kultivierter Pflanzenschädling eine Hefe mit Zwei-Hybrid-Screen

Unravelling the molecular mechanisms of disease manifestations is important to understand pathologies and symptom development in plant science. Bacteria ...

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. Whereas Pd transport of small molecules, such as ions and water, is presumed to occur passively, cell-to-cell transport of biological macromolecules, such proteins, most likely occurs via an active mechanism that involves specific targeting signals on the transported molecule. The scarcity of identified plasmodesmata (Pd) localization signals (PLSs) has severely restricted the understanding of protein-sorting pathways involved in plant cell-to-cell macromolecular transport and communication. From a wealth of plant endogenous and viral proteins known to traffic through Pd, only three PLSs have been reported to date, all of them from endogenous plant proteins. Thus, it is important to develop a reliable and systematic experimental strategy to identify a functional PLS sequence, that is both necessary and sufficient for Pd targeting, directly in the living plant cells. Here, we describe one such strategy using as a paradigm the cell-to-cell movement protein (MP) of the Tobacco mosaic virus (TMV). These experiments, that identified and characterized the first plant viral PLS, can be adapted for discovery of PLS sequences in most Pd-targeted proteins.

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plant intercellular connections, the plasmodesmata (Pd), play central roles in plant physiology and plant-virus interactions. Critical to Pd transport are sorting signals that direct proteins to Pd. However, our knowledge about these sequences is still in its infancy. We describe a strategy to identify Pd localization signals in Pd-targeted proteins.

Identifizierung von Plasmodesmal Lokalisierung Sequenzen in Proteine In Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic immune response. The activation of MCs via the cross-linking of surface IgE bound to high affinity IgE receptor (Fc&#949;RI), as well as through the stimulation of several other receptors, initiates the rise of the free intracellular Ca2+ level ([Ca2+]i) that promotes the release of inflammatory and allergic mediators. The identification of molecular constituents involved in these signaling pathways is crucial for understanding the regulation of MC function. In this article, we describe a protocol for the isolation of murine connective tissue type MCs by peritoneal lavage and cultivation of peritoneal MCs (PMCs). Cultures of MCs from various knockout mouse models by this methodology represent a useful approach to the identification of proteins involved in MC signaling pathways. In addition, we also describe a protocol for single cell Fura-2 imaging as an important technique for the quantification of Ca2+ signaling in MCs. Fluorescence-based monitoring of [Ca2+]i is a reliable and commonly used approach to study Ca2+ signaling events, including store-operated calcium entry, which is of utmost importance for MC activation. For the analysis of MC degranulation, we describe a &#946;-hexosaminidase release assay. The amount of &#946;-hexosaminidase released into the culture medium is considered as a degranulation marker for all three different secretory subsets described in MCs. &#946;-hexosaminidase can easily be quantified by its reaction with a colorigenic substrate in a microtiter plate colorimetric assay. This highly reproducible technique is cost-effective and requires no specialized equipment. Overall, the provided protocol demonstrates a high yield of MCs expressing typical MC surface markers, displaying typical morphological and phenotypic features of MCs, and demonstrating highly reproducible responses to secretagogues in Ca2+-imaging and degranulation assays.

Isolation of Peritoneum-derived Mast Cells and Their Functional Characterization with Ca2+-imaging and Degranulation Assays

Here, we present a protocol to isolate and cultivate murine peritoneal mast cells. We also describe two protocols for their functional characterization: a fluorescent imaging of intracellular free Ca2+ concentration and a degranulation assay based on colorimetric quantification of the released &#946;-hexosaminidase.

Isolierung von Mastzellen Bauchfell abgeleitet und deren funktionelle Charakterisierung mit Ca2 +-imaging und Degranulation Assays

Mast cells (MCs), as a part of the immune system, play a key role in defending the host against several pathogens and in the initiation of the allergic ...

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known as quasispecies, owing to their high mutation rate. Here, we describe how to measure the specific growth rate and the cell-binding ability of rotavirus as its phenotypes. Rotavirus is treated with trypsin to recognize the cell receptor and then inoculated into MA104 cell culture. The supernatant, including viral progenies, is collected intermittently. The plaque assay is used to confirm the virus titer (plaque-forming unit: pfu) of each collected supernatant. The specific growth rate is estimated by fitting time-course data of pfu/mL to the modified Gompertz model. In the assay of cell-binding, MA104 cells in a 24-well plate are infected with rotavirus and incubated for 90 min at 4 &#176;C for rotavirus adsorption to cell receptors. A low temperature restrains rotavirus from invading the host cell. After washing to remove unbound virions, RNA is extracted from virions attached to cell receptors followed by cDNA synthesis and reverse-transcription quantitative PCR (RT-qPCR). These protocols can be applied for investigating the phenotypic differences among viral strains.

Here we present two protocols, one for measuring the specific growth rate and the other for the cell-binding ability of rotavirus using the plaque assay and RT-qPCR. These protocols are available for confirming the differences in phenotypes between rotavirus strains.

Assays für die spezifischen Wachstumsrate und Zelle-Bindungsfähigkeit Rotavirus

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...