Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Funds of China (31770968) und Tianjin-Programm der Anwendung Forschungsgemeinschaft und Advanced Technology (17JCZDJC33400).

1. Herstellung von Heparin aufgenommen Starpeg NanoCoatings
<ol><li>
Synthese von Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS)
	<ol>
<li>Von Heparin 0,69 g abwiegen und in 2,0 mL eiskaltes deionisiertes Wasser auflösen.</li>
		<li>NHS 0,23 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>EDC 0,77 g abwiegen und in 0,5 mL eiskaltes deionisiertes Wasser in einem Rundboden-Kolben auflösen.</li>
		<li>Mischen Sie die NHS und EDC-Lösungen in einem Rundboden-Kolben. Lassen Sie die gemischte Lösung auf der Bank bei Raumtemperatur für 30 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die EDC NHS Mischung 5.031 x g für 10 min bis zum Exzess EDC und NHS zu entfernen.</li>
		<li>Die Mischung Lösung und Zentrifuge bei 5.031 X g für 10 min 30 mL kaltem Ethanol hinzufügen.<ol>
<li>Zweimal wiederholen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der StarPEG-Heparin NanoCoatings
	<ol>
<li>Ein Rundboden-Flasche 1,0 mL der 10 % (w/V) StarPEG-(NH2)8 hinzufügen.</li>
		<li>Die gleichen Rundboden-Flasche 0,67 mL 10 % (w/V) Heparin-NHS hinzufügen.</li>
		<li>Legen Sie die gemischte Lösung StarPEG-(NH2)8 und Heparin-NHS in einem Inkubator bei 25 ° C für 20 min bis eine klare Lösung mit Viskosität zu erhalten. Hinweis: Für Experimente in denen eindringmittel beschrifteten Heparin (FAM-Heparin) erforderlich war, ist das Verfahren der Herstellung gleich außer dass deionisiertes Wasser ergänzt mit 5 Absatz 6 - Sterne - PEG-(NH2)8 aufgelöst wurde Carboxyfluorescein N- Succinimidyl Ester 0,1 % (Molverhältnis) StarPEG-(NH2)8. )</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Charakterisierung von Heparin-PEG NanoCoatings durch Fourier transformieren Infrarotspektroskopie (FT-IR)
	<ol>
<li>Spülen Sie bevor Sie beginnen das Achat Mörser und Pistill Pelletierung Gerät (kleine Scheiben mit Durchmesser von 13 mm ab) mit Aceton und deionisiertes Wasser. Trocknen Sie das Glas in einem Ofen vor Gebrauch.</li>
		<li>Mix ca. 0,1 – 1 % Heparin-PEG Probe mit 200 – 250 mg feine KBr-Pulver.</li>
		<li>Legen Sie die Heparin-PEG und KBr Mischung im Achat Mörser und fein pulverisieren in kleinen Pellets mit einem Durchmesser von 2 µm.</li>
		<li>Übertragen Sie die Mischung in ein Pelletierwerk Gerät. Gelten Sie hohe Druckkraft (8 T/cm2) in einem Vakuum für 1 – 2 min. transparent Pellets zu bilden.</li>
		<li>Ziehen Sie vorsichtig die Probe Pellets von dem Pelletierwerk Gerät fern. Achten Sie darauf, nicht zu schwer, Risse entstehen nicht zu ziehen.</li>
		<li>Übertragen Sie die Probe-Pellets sehr sorgfältig auf ein Fourier transformieren Infrarot Spektroskop, Probe chemische Struktur zu bestimmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der internen porösen Strukturen der Heparin-PEG NanoCoatings von gescannten Rasterelektronenmikroskopie (SEM)
	<ol>
<li>Bereiten Sie für die folgenden Verfahren standard 48-Well Kultur Zellplatte und Pipetten.</li>
		<li>Pipette die Heparin-PEG-Copolymer-Lösung in die Vertiefungen einer Kultur 48-Well-Platte.</li>
		<li>Frieren Sie die Platte bei-80 ° C für 24 h.</li>
		<li>Lypophilize der Proben bei-50 ° C im Vakuum (0,1 Pa) für 24 h.</li>
		<li>Die klebrige Oberfläche ein Aluminium-Stub Proben verteilt.</li>
		<li>Die Proben mit Gold zu beschichten und beobachten unter dem gescannten Elektronenmikroskop, interne poröse Strukturen zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Untersuchung der Heparin-PEG NanoCoatings Oberfläche durch Rasterkraftmikroskopie (AFM)
	<ol>
<li>Silica-Glas-Objektträger mit Piranha-Lösung reinigen (70 % H2SO4, 30 % H2O2) bei 80 ° C für 40 Minuten.</li>
		<li>Beschallen Sie die Folien in Methanol für 10 min und dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Trocknen Sie die Folien durch Vakuumtrocknung.</li>
		<li>Waschen Sie die Folien mit 3-Aminopropyl-Triethoxysilane Lösung (2 % in Toluol), schütteln Sie Sie leicht.</li>
		<li>Beschallen Sie Folien in Methanol für 10 min dann in Toluol für 10 min.</li>
		<li>Platz 100 µL 3 % Heparin-PEG-Lösung über die Oberfläche der Folien mit einer standard-Pipette.</li>
		<li>Untersuchen Sie die Oberfläche der Heparin-PEG unter einem Rasterkraftmikroskop (eine Resonanzfrequenz von 50 – 80 kHz, erzwingen ständige 0.350 N m 21, Spitze Radius von 600 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Maus Islet Oberflächentechnik mit Heparin-PEG NanoCoatings
<ol><li>
Maus Inselchen Oberflächenbeschichtung mit Heparin-PEG NanoCoatings
	<ol>
<li>Extrahieren Sie Maus Inselchen von Kollagenase Verdauung und Histopaque gradient Reinigung wie Jupiter19berichtet.</li>
		<li>200 Inseln unter einem Mikroskop Dissektion zu einer 1,5 mL-Tube aussuchen.</li>
		<li>Die Inseln und die Zentrifuge bei 503 X g für 1 min 500 µL PBS hinzufügen.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 250 µL der Heparin-PEG-Lösung hinzufügen und halten Sie die Mischung auf dem Eis für 10 min. Pipette rauf und runter, die Inseln mit den Heparin-PEG-Lösung gut mischen lassen.</li>
		<li>Zentrifuge bei 503 X g für 1 min.</li>
		<li>Entfernen des Überstands und 500 µL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>503 X g für 1 min zentrifugieren Sie und entfernen Sie den überstand zu und halten Sie die Inseln für die weitere Verwendung. Für die Prüfung der Maus Inselchen mit Heparin-PEG beschichtet diente FAM-Heparin-PEG Inselchen Beschichtung folgendermaßen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prüfung der Maus Inselchen mit dem FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 – 2 mL RPMI 1640 mit 10 % fötalen Rinderserum beschichtete Inselchen ergänzt und übertragen Sie diese Inseln in eine sterile Bakterienkultur nicht aufgeladen-Schale.</li>
		<li>Die Morphologie und Fluoreszenz Signale der FAM-Heparin-PEG NanoCoatings beschichtet Inseln unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu beobachten.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Funktion der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen im Vergleich zu unbeschichteten Inselchen
<ol><li>
Lebensfähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen
	<ol>
<li>Aussuchen Sie 20 der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen und legen Sie sie in einen Brunnen von einer 96-Well Zellplatte Kultur.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Aussuchen Sie 20 noncoated Kontrolle Inseln und legen Sie sie in einem Brunnen der gleichen 96-Well Kultur Zellplatte.</li>
		<li>Füllen Sie insgesamt 10 Bohrungen mit 20 noncoated Kontrolle Inselchen für jedes gut.</li>
		<li>Setzen Sie 200 µL RPMI 1640 ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum in jede Vertiefung der 96-Well-Platte, die kleinen Inseln enthält und für 14 Tage in Kultur pflegen.</li>
		<li>Alle 2 Tage Inselchen Nährmedien zu ersetzen.</li>
		<li>Behandeln Sie die Inseln mit einem lebenden/Toten Färbung Kit am Ende der 14 Tage in Kultur und unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop beobachtet.</li>
		<li>PI+ (rot) Zellen innerhalb jeder Insel unter einem invertierten Fluoreszenzmikroskop zu zählen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revaskularisation der Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen in vitro
	<ol>
<li>Alle experimentellen Kunststoffe einschließlich Kultur Platte Vorkühlen und Pipette Tipps mindestens 12 h vor Gebrauch.</li>
		<li>Legen Sie einen 24-Well-Ort auf ein Kühlkissen. Fügen Sie 250 µL Eis kalt Wachstumsfaktor reduziert Matrigel in jede Vertiefung eine Kultur 24 Wohlen Zellplatte. Ort der beschichteten 24-Well-Platte bei 4 ° C für mindestens 30 Minuten.</li>
		<li>Während die Matrixlösung im Kühlschrank untergeht, trypsinize der Maus pancreatic Islet Endothelzellen Mile Sven 1 (MS1).<ol>
<li>Entfernen Sie alle Nährmedien aus der Gewebekultur-Flasche. Spülen Sie das Fläschchen mit 5 mL PBS.</li>
			<li>Entfernen Sie die PBS und 3 mL Trypsin-EDTA. Inkubation bei 37 ° C für 3 min in ein standard-Inkubator.</li>
			<li>Tippen Sie die Unterseite des Kolbens zu lösen die Zellen und 5 mL Serum ergänzt Medien.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen in eine 15 mL Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 1.000 X g für 5 min.</li>
		<li>Ausziehen des Überstands und 5 mL PBS. Pipette rauf und runter, gut mischen.</li>
		<li>Bei 1.000 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand abnehmen.</li>
		<li>Hinzufügen von Serum ergänzt DMEM Medien in das Rohr und Samen 50.000 Zellen in jede Vertiefung der Matrix-Lösung beschichtet 24-Well-Platte.</li>
		<li>Fügen Sie 5 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in jede Vertiefung.</li>
		<li>Insgesamt 500 µL pro Bohrloch Serum ergänzt DMEM Medien in jede Vertiefung hinzufügen.</li>
		<li>Beobachten Sie Rohr-Bildung nach 4h und 24 h Inkubation unter einem Lichtmikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Glukose-stimulierten Insulinsekretion der Heparin-PEG beschichtet Inselchen Hinweis: Um festzustellen, ob NanoCoatings die Funktion der Maus Inselchen beeinträchtigt, wurde Glukose stimuliert Insulin-Sekretion von Heparin-PEG beschichtet und noncoated Inselchen bewertet.<ol>
<li>30 Heparin-PEG beschichtet Inselchen oder noncoated Kontrolle Inselchen in einem 1,5 mL Röhrchen aussuchen. Bereiten Sie insgesamt 10 Röhrchen für beschichtete Inselchen und noncoated Inseln.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL physiologischer Kochsalzlösung mit 2 Mmol/L Glucose20 ergänzt und Inkubation bei 37 ° C für 2 h. Hinweis: Für das Rezept der physiologischen Salzlösung, siehe Tabelle 1. Lassen Sie die Kappe der Rohre lose während der Inkubation im Brutschrank.</li>
		<li>Entfernen Sie so viel Lösung, wie möglich.</li>
		<li>Stimulieren Sie Inseln durch Zugabe von 600 µL einer physiologischen Salzlösung mit 20 Mmol/L Glucose bei 37 ° C für 30 min ergänzt.</li>
		<li>Sammeln Sie 200 µL des Überstandes aus jeder Tube für Insulin ELISA Quantifizierung mit einem kommerziellen Insulin ELISA kit.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Artikel zeigen wir "einfach zu erlassen" Ansatz für lebende Zelle Oberflächentechnik ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen den N- Hydroxysuccinimide die NanoCoatings und die Amin Gruppen des Pankreas Inselchen Oberfläche Membran. In der Tat die Aminogruppen in Zellmembranen sind hochreaktiv und infolgedessen frühere Studien haben berichtet, dass Wechselwirkungen zwischen primären Aminogruppen mit aktivierten N- Hydroxysuccinimidyl (NHS) Ester unter physiologischen Bedingungen14 ,16,21. Darüber hinaus hat umfangreiche Forschungen berichtet, dass Einbau von Heparin, ein höchst sulfatierte Glykosaminoglykan und wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix, während Inselchen Kapselung zu verbesserten Posttransplantationsperiode führen könnte Revaskularisation und reduzierte IBMIR22,23. In Anbetracht der Biokompatibilität von PEG und mehrwertige Eigenschaften des Heparins haben wir 8-armigen PEG für maximale Heparin während der Fertigung der NanoCoatings Laden verwendet. Heparin wurde mit -NHS, modifiziert, die anschließend mit der -NH2 Gruppen auf Insel Zellmembran reagieren würde. Aktivieren die kovalente Bindung-Bildung -NH2 (der Zellmembran) bis -NHS die Hep-PEG, die Inseln leicht "beschichtet werden würde" durch die PEG Heparin eingearbeitet, wodurch es ein Nano-Dünnschicht (NanoCoatings) auf der äußeren Oberfläche des der Bauchspeicheldrüse Inselchen.
Der bisherige Ansatz unterscheidet sich von zuvor veröffentlichten Methoden, die auch PEG als die großen Polymer für Inselchen Mikroverkapselung in diesem Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen -NHS (von NanoCoatings) und NH -2 von der inselzelle ausgewählt Membran diente. Wenn man bedenkt, dass die Stabilität der inselzelle/Beschichtung, vor allem in einem komplexen Umfeld wie das Plasma ist entscheidend für die Post-Transplantation Revaskularisation und überleben, die Bildung zwischen -NHS und -NH2 wäre stabiler im Vergleich zu hydrophobe Wechselwirkung zwischen PEG und Zellmembran24, elektrostatische Wechselwirkungen9,15,24,25,26 oder biologische Verbindung zwischen biotin Streptavidin-14.
Darüber hinaus erfordert Beschichtung Ansatz, der auch auf der LBL-Ansatz mit erweiterten Inselchen Umgang mit Zeit für multi-Layer Deposition14,16,25, der heutigen Technik beruht im Gegensatz zur kleinen Insel minimal Verarbeitung und sehr kurze Beschichtung Periode der isolierten Inseln. Diese beiden Faktoren sind nach Transplantation Inselchen überlebenswichtig, da Inselchen Lebensfähigkeit oft bereits kompromittierten folgenden Inselchen Isolation aufgrund von beschädigten ECM während der enzymatischen Verdauung ist. Eine Einschränkung des derzeitigen Konzepts ist jedoch, dass im Gegensatz zu LBL, über die Dicke der äußeren Beschichtung gesteuert werden könnte, durch eine Erhöhung oder Verringerung der Zahl der Abscheidung von Schichten, Dicke der Hep-PEG NanoCoatings vorerst zugeschnitten werden kann nicht.
Darüber hinaus aufgrund der milden Zustand wo chemische Reaktion zwischen -NHS und -NH2 stattfindet, der bisherige Ansatz für lebende Zelle gilt Oberflächentechnik nicht auf Pankreas Inseln, aber die meisten Zelltherapie beschränkt. Zusätzlich, wenn man bedenkt, dass Heparin bekannt ist, mit einer Reihe von Zytokinen und biologisch aktiven Molekülen interagieren, Hep-PEG NanoCoatings stellt auch eine offene Plattform, die das Potenzial zur Aufnahme von unbegrenzten biologische Mediatoren sowie Schnittstellen für komplexere Zelle Oberflächentechnik.

Die therapeutische Wirksamkeit von zellbasierten Therapien wird durch niedrige Zelle Retention und Armen überleben1,2begrenzt. Um das Ergebnis von Zelltherapien verbessern, Zell-Oberflächentechnik durch enzymatische Manipulation, wurde Peptid Konjugation, Bioorthogonal Chemie und physikalischen Kapselung mit Biomaterialien ausgebeuteten3,4, 5,6,7,8,9,10. Das aktuelle Protokoll strebt Oberflächentechnik von lebenden Zellen mit einer "leicht zu erlassen" Methode durch die Anwendung einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Heparin-PEG) NanoCoatings auf der Zelloberfläche. Oberflächentechnik von Pankreas Inseln präsentierte sich hier als Beispiel aufgrund der Heterogenität der Langerhans-Inseln und die abfällige Ergebnisse der aktuellen klinischen inselversetzung.
In der Tat, klinischen inselversetzung erfolgt derzeit durch direkte Injektion von isolierten Inseln in die hepatische portalader und dieses Verfahren ist nur für ausgewählte Patienten wegen der Knappheit an Spender Materialien und geringe therapeutische Wirksamkeit 11. konventionell, Alginat wurde die am häufigsten verwendeten Biomaterial für Inselchen Kapselung und Oberflächenmodifikation, obwohl es aufgrund der chemischen Instabilität der Alginat und Fibrose im Zusammenhang mit entzündlichen12, weniger als ideal ist 13. Darüber hinaus sind im Vergleich zu der natürlichen Größe der Inseln, die zwischen 100 bis 200 µm, die Alginat-Inselchen Mikrokapseln größer, zwischen 400 und 800 µm, die überschreiten der physiologische diffundierende Entfernung von Sauerstoff. Winkeltreue Inselchen Kapselung, dh., Verkapselung Inseln ohne wesentliche Änderung des Inselchen Volumen, dann entwickelt wurde. So, Ablagerung von Nanomembranes bestehend aus PEG, Tetrafluorethylen, silikonmembrane oder mehrschichtige NanoCoatings (auch bekannt als die "Schicht für Schicht" [LBL] Technik) wurde berichtet, was zu verbesserter in-vitro- Insel überleben14 ,15,16,17,18, obwohl die LBL nähern oft erfordert umfangreiche Inselchen Übergabe Periode zur Abscheidung von mehreren Schichten, welche Insel Lebensfähigkeit gefährden können . Instabilität des Nanomembranes, von die abhängt, elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen zwischen Biomembran Schichten oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Nanomembranes und der kleinen Insel Oberfläche wirft darüber hinaus auch Bedenken9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Ein weiterer begrenzender Faktor, der das therapeutische Ergebnis der intraportal inselversetzung überfüllt ist die sofortige Blut-vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR) verursacht durch direkten Kontakt der implantierten Inselchen mit Blut, wodurch die Thrombozytenaggregation, Koagulation und Immunsystem negativ oder unerwünschte zellulären Aktivierung9. Um diese Probleme zu beheben, wurde eine ultradünne NanoCoatings bestehend aus sternförmigen Polyethylenglykol (StarPEG) für seine etablierten Biokompatibilität und Vielseitigkeit als Gehäusematerial Insel vorbereitet. Heparin, eine höchst sulfatierte Glykosaminoglykan, wurde auch die StarPEG NanoCoatings für seine entzündungshemmende, Antigerinnungsmittel Eigenschaften und Fähigkeit, Vaskularisation zu erleichtern durch die Rekrutierung von Pro-angiogene Wachstumsfaktoren22enthalten, 23.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

Zelle Oberflächentechnik kann implantierte Zellen vor Gastgeber immun Angriffen schützen. Es kann auch Umformen, zelluläre Landschaft zur Verbesserung der Organfunktion und Überleben nach Transplantation. Dieses Protokoll zielt auf Oberflächentechnik der pankreatischen kleinen Inseln mit einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Hep-PEG) NanoCoatings. Um die Hep-PEG NanoCoatings für Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Oberflächentechnik zu generieren, Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS) wurde erstmals synthetisiert durch Änderung seiner carboxylat-Gruppen mit N-(3-dimethylamino propyl) -N'-Ethyl Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und N- Hydroxysuccinimide (NHS). Die Hep-PEG-Mischung wurde dann durch Vernetzung der amino Ende funktionalisiert achtarmigen StarPEG (StarPEG-(NH2)8) und Heparin-NHS gebildet. Zur Insel Oberflächenbeschichtung waren Maus Inselchen über Kollagenase Verdauung und gradient Reinigung mit Histopaque isoliert. Isolierte Inseln wurden dann mit Eis kalt Hep-PEG-Lösung für 10 min kovalente Bindung zwischen NHS und Amin Gruppen der Insel Zellmembran ermöglichen behandelt. NanoCoatings mit Hep-PEG verursacht minimale Änderung Inselchen Größe und Volumen und Heparinisierung der Inseln mit Hep-PEG können auch sofort Blut-vermittelte entzündliche Reaktion während der inselversetzung verringern. Dieser "einfach zu erlassen" Ansatz ist ohne Kompromisse bei der Zellviabilität mild genug für Oberflächentechnik lebender Zellen. Wenn man bedenkt, dass Heparin Bindungsaffinität zu mehreren Zytokinen gezeigt hat, die Hep-PEG NanoCoatings auch bietet eine offene Plattform, die Einbeziehung der unbegrenzten funktionale biologische Mediatoren und vielschichtige Flächen für Wohnen ermöglicht Zelloberfläche Bioengineering.

Die Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Konjugation von StarPEG-(NH2)8 und Heparin mit EDC und NHS als Kopplung Agenten (Abbildung 1) synthetisiert. Chemische Struktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde von FT-IR untersucht und wie in Abbildung 2dargestellt, zeichnete charakteristische Gipfel von Heparin bei 3.300 – 3.600 cm-1, entspricht die Hydroxylgruppen des Heparins (Abbildung 2 Rote). Die Abnahme der Amplitude des Peaks bei 3.300 – 3.600 cm-1 (Abbildung 2 blau) stellt Konjugation zwischen der StarPEG-(NH2)8 amidgruppen und Heparin Carbonylgruppe. Amplitude der Gipfel 1.650 cm-1 entspricht dem Amid Carbonyl stretching Vibration wurde ebenfalls reduziert, ausreichende Reaktion zwischen dem carboxylat-Gruppen von Heparin mit Succinimidyl Succinat und Amin StarPEG-(NH2) angibt 8. Oberflächenstruktur der Heparin-PEG NanoCoatings wurde durch Rasterkraftmikroskopie untersucht und nachgewiesen wird von Lou Et Al., die NanoCoatings war etwa 30 nm in der Höhe und 2 µm Breite mit kleinen porösen Features (dunkle Flecken) bis hin zwischen 100 bis 200 nm im Durchmesser10. Daten aus gescannten elektronische Mikroskopie bestätigen auch die stark vernetzte poröse Struktur von Heparin-PEG (Abbildung 3), was darauf hindeutet, dass es für Überleben der Zellen während der in-vivo Geburt geeignet sein könnte.
Oberflächenbeschichtung von isolierten Maus Inselchen wurde untersucht und wie in Abbildung 4dargestellt, dünne Schicht NanoCoatings, durch grüne Fluoreszenz gezeigt wurde gleichmäßig über die Oberfläche der beschichteten Inselchen ohne dass offensichtliche Änderungen auf Insel Volumegröße hinterlegt. Bei der Beschichtung empfiehlt es sich, die kleinen Inseln auf Eis, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten zu halten. In ähnlicher Weise wurde der Beschichtung Periode, 10 min in diesem Fall auch optimiert, um Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Inseln ermöglichen. Es ist erwähnenswert, dass für bessere Beobachtung der NanoCoatings, Elektronenmikroskopie, die die Querschnitte der beschichteten Inselchen als zuvor gemeldeten9,16 untersucht mehr angebracht wäre, obwohl die Daten generiert werden würden von den festen und embedded Inseln statt lebenden Inselchen in der Kultur.
Zu überleben und Funktion des beschichteten Inseln, Inselchen Revaskularisation und Funktionen in wurden bewertet in Vitro. In Anbetracht der positiven Eigenschaften des Heparins könnte Heparin Funktionalisierung auf die Oberfläche der Insel Insel Revaskularisation in Kultur und folglich das Überleben erleichtern. Wir haben beobachtet, dass die Heparin-PEG beschichtet Maus Inselchen robuste Inselchen Lebensfähigkeit in Kultur (Abbildung 5) ausgestellt. Wesentlich weiter fortgeschritten vaskulären Bildung wurde auch von Endothelzellen Inselzellen (MS1), die zusammen mit Heparin-PEG gezüchtet wurden offensichtlich Inselchen, angezeigt durch längliche kapilläre-ähnliche Strukturen und netzwerkartige vaskulären Strukturen (Abbildung 6 beschichtet ).
NanoCoatings Prozess entstehen keine Wirkung Glukose stimuliert Insulin sekretorischen Fähigkeit der Heparin-PEG beschichtet Inselchen. Niedrige Niveau der Insulin-Sekretion wurde in allen Behandlungsgruppen beobachtet, wenn Inselchen mit physiologischer Kochsalzlösung, ergänzt mit sub-stimulatory Niveau der Glukose (2 Mmol/L; durchblutet waren ( Abbildung 7). Wenn Inselchen mit einer supra-physiologischen Niveau der Glukose (20 Mmol/L Glucose) angeregt wurden, wurde die Erhöhung der Insulin-Sekretion in allen Behandlungsgruppen beobachtet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Chemische Struktur der Hep-PEG NanoCoatings für Oberflächentechnik pancreatic Islet. Insel-Beschichtung wurde durch kovalente Vernetzung zwischen den Heparin-NHS und primäre Amine innerhalb der Zellmembran und Sterne - PEG-(NH2)8erreicht. Jedes Molekül Heparin besitzt mehrere Carboxylgruppen, die verändert wurden, um eine NHS-Gruppe haben. Der NHS-aktivierten Carboxylgruppen reagiert mit primären Aminen des Proteins zu Form Amid Verbindungen, über die NanoCoatings von Hep-PEG und Inselchen stabilisiert wird. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> Abbildung 2 : Infrarot-Spektrum der Sterne - PEG-(NH2)8, Heparin und Hep-PEG NanoCoatings im getrockneten Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> Abbildung 3: Gescannte elektronische Mikroskopie Bilder von Hep-PEG in getrocknetem Zustand. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative Bilder von Heparin-PEG beschichtet Inselchen unter Fluoreszenzmikroskop. Heparin wurde bereits beschriftet mit FAM (grün dargestellt). Bilder sind repräsentativ für 100 Inseln. Maßstabsleiste = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> Abbildung 5: Heparin-PEG beschichtet Inselchen ausgestellt robuste Inselchen Lebensfähigkeit. (A) Daten als Mean± Standard-Fehler bedeutet, n = 50 Inseln pro Gruppe. (B) lebenden Zellen wurden in grün und tote Zellen in rot dargestellt. Maßstabsleiste = 100 µm. Bilder sind repräsentativ für 50 Inseln. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> Abbildung 6: Heparin-PEG NanoCoatings erleichtert Intra-Inselchen Revaskularisation. Matrigel Rohr Neubildung von MS1 Co kultiviert mit Heparin-PEG beschichtet, kleinen Inseln und Inselchen noncoated Kontrolle. Bilder wurden an 4 und 24 h. Skala Bar = 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> Abbildung 7: Heparin-PEG NanoCoatings verursacht keine Veränderung auf Insel Sekretion Insulinfunktion. Heparin-PEG beschichtete Inselchen und noncoated Kontrolle Inselchen (30) 2 Mmol/L (weißer Balken) ausgesetzt waren oder 20 Mmol/L (schwarze Balken) Glukose für 30 min. Insulin-Sekretion in Reaktion auf 20 Mmol/L Glucose war vergleichbar zwischen der beschichteten und Inselchen zu kontrollieren. Daten erscheinen als Mittelwert ± Standardfehler des Mittel, n = 10. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K Aufrufe.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N- Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.

Serie: Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

Färbeprotokollen for Human Pankreasinseln

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

Forschung

Medizin

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the pancreatic &#946;-cells. In addition, biomaterial particles, hydrogels, and scaffolds also provide a unique opportunity to administer sustained, controllable drug delivery to &#946;-cells in culture and in transplanted tissue models. These technologies allow the study of candidate &#946;-cell proliferation factors using intact islets and a translationally relevant system. Moreover, determining the effectiveness and feasibility of candidate factors for stimulating &#946;-cell proliferation in a culture system is critical before moving forward to in vivo models. Herein, we describe a method to co-culture intact mouse islets with biodegradable compound of interest (COI)-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres for the purpose of assessing the effects of sustained in situ release of mitogenic factors on &#946;-cell proliferation. This technique describes in detail how to generate PLGA microspheres containing a desired cargo using commercially available reagents. While the described technique uses recombinant human Connective tissue growth factor (rhCTGF) as an example, a wide variety of COI could readily be used. Additionally, this method utilizes 96-well plates to minimize the amount of reagents necessary to assess &#946;-cell proliferation. This protocol can be readily adapted to use alternative biomaterials and other endocrine cell characteristics such as cell survival and differentiation status.

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

Biotechnik

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

Ein murinen Pancreatic Islet Cell-basierte Screening für diabetogene Umweltchemikalien

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Immunologie und Infektion

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

Pankreasgewebe-abgeleitete extrazelluläre Matrix Bioink für den Druck 3D-Zell-Laden Pankreasgewebe Konstrukte

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

<meta charset="utf8"></head><body>Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix EZM

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Dezellularisierung der humanen Bauchspeicheldrüse ohne Detergenzienz zur Herstellung löslicher extrazellulärer Matrix (ECM)

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologie

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

Visualisierung von endogenen Mitophagie-Komplexen in Situ in menschlichen Pankreas-Betazellen unter Verwendung von Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Zusammenfassung

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