The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Vanderbilt Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt und durchgeführt. 1. Labeling COI mit Fluorophore (Optional) <ol><li> Wähle einen fluoreszierenden Farbstoff, der mit einer freien primären Amin (beispielsweise auf einem Protein), wie beispielsweise Succinimidylester oder Fluorescein - Derivate reagieren, Mikrokügelchen Ladung zu visualisieren. Auflösen 8x molarer Überschuß (bezogen auf Mol COI) von Fluorophor in 200 ul Dimethylsulfoxid (DMSO). </li><li> Resuspendieren von 50 mg COI bis zu einem Endvolumen von 800 ul in einem Fahrzeug-Lösung (Endkonzentration von 62,5 ng / ul). Die Trägerlösung wird in Abhängigkeit von der Quelle des COI variieren. HINWEIS: Typische Fahrzeuglösungen umfassen Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) oder DMSO. </li><li> Fügen Sie alle Fluorophor / DMSO-Lösung aus Schritt 1.1 und resuspendieren COI. Vortex über Nacht bei 4 ° C. Alternativ vortexen der Reaktionsmischung bei Raumtemperatur(RT) für 4 Stunden. </li><li> Im Anschluss an die Markierungsreaktion überschüssiges Fluorophor eine Entsalzungs Spalte. <ol><li> Drain-Speicherpuffer von Entsalzungssäule und spüle mit 16 ml deionisiertem Wasser hergestellt. Entsorgen Sie durch alle fließen. </li><li> Fügen Sie die fluoreszenzmarkierten COI an die Entsalzungssäule. Eluieren mit 1,2 ml VE-Wasser und sammeln durch den Fluss. </li><li> Wiederholen Sie Elutionsschritt zusätzlich viermal, das Hinzufügen jedes Mal 1,2 ml VE-Wasser und die Strömung durch als getrennte Probe zu sammeln. </li><li> Gefriert alle gesammelten Strömung durch Proben bei -80 ° C lyophilisieren und gemäß den Anweisungen des Herstellers für 24 Std. </li></ol></li></ol> 2. COI belasteten Microsphere Herstellung über die Wasser-in-Öl-in-Wasser - Emulsion Solvent Evaporation Method <ol><li> 1 mg des fluoreszenzmarkierten COI zu 100 ul entionisiertem Wasser die erste Wasserphase (W1) zu bilden. </li><li> Man löst 65 mg Poly (milch-co-glykol acid) (50:50 Lactid: Glycolid, Molekulargewicht 54.000 - 69.000) in 750 &amp; mgr; l Dichlormethan in einem Reaktionsgefäß. Ultrasonicate für 10 bis 30 s (bei 160 W), um vollständig den PLGA aufzulösen. Dies bildet die Ölphase (O). </li><li> In allen der W1-Phase erzeugt in Schritt 2.1 auf die O-Phase in einer tropfenweise Art und Weise. Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm für 30 sec Emulgieren der W1 / O-Phase zu bilden. </li><li> Fügen alle der W1 / O-Phase in eine tropfenweise Art und Weise zu 15 ml einer 1% (Gewicht / Volumen) wässrigen Poly (vinylalkohol) (PVA) -Lösung und Emulgieren für 30 sec unter Verwendung eines handgehaltenen Homogenisator bei 20.000 rpm . </li><li> Übertragen die Emulsion erzeugt in Schritt 2.4 in einen 200-ml-Rundkolben und unterliegen einer 635 mm Hg Vakuum am Rotationsverdampfer für 1 Stunde unter Verwendung des Lösungsmittels und erzeugen die wässrige Phase zu entfernen. </li><li> Aliquot 1 ml der wässrigen Phase erzeugt, in Schritt 2,5 bis vierzehn Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren der wässrigen Lösung in die Mikrozentrifugenröhrchen bei 7.500xg für 8 min. HINWEIS: Bei diesem Schritt werden die Mikrokügelchen in der verbleibenden wäßrigen Lösung und sind mit dem Boden des Mikrozentrifugenröhrchens eingeengt. </li><li> Vorsichtig 900 ul der wässrigen Lösung aus den mit einer Mikropipette Mikrozentrifugenröhrchen zu entfernen, Pipettieren, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören. <ol><li> Waschen Sie die Mikrokügelchen von überschüssigem PVA durch Zugabe von 1 ml Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen entionisiert. Zentrifuge bei 7.500 × g für 8 min und wieder vorsichtig 900 ul einer wässrigen Lösung von den Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Mikropipette, Pipettieren zu entfernen, um nicht die Mikrokugeln am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu stören. ANMERKUNG: Die restlichen 100 &amp; mgr; l wässrige Lösung enthält, die erzeugten Mikrokugeln. </li></ol></li><li> Fixieren Sie die wässrigen Mikrokügelchen Lösung erzeugt in Schritt 2.7 bei -80 ° C. </li><li> Lyophilisieren Mikrokugeln mit einem Lyophilisator Verwendung nach HerstellerAnweisungen und bei -20 ° C. HINWEIS: Messen Beladungseffizienz des COI durch vollständiges Auflösen von PLGA - Mikrokügelchen und die Proteinkonzentration relativ zu einer Standardkurve des freien Proteins 7 zu bestimmen. </li><li> Als negative Kontrolle, eine Charge von &quot;leeren&quot; Mikrokugeln erzeugen (im Folgenden als Steuermikrokugeln bezeichnet). HINWEIS: Die Erzeugung von Steuermikrokugeln ist identisch zu der Erzeugung von hydrophilen COI-beladenen Mikrosphären, ohne COI zusätzlich zu 800 ul der Trägerlösung in Schritt 1.2. Spiel Steuer Partikel in Massenkonzentration von PLGA in Bezug auf COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen für β-Zellen-Mitogen-Assay. </li></ol> 3. Herstellung von Islet Kultur, Medien und Pre-Test Medien <ol><li> Bereiten 200 ml Medium für die Kultur von intakten Maus Inselchen: RPMI 1640 Medium mit 11 mM Glukose supplementiert, 10% Pferdeserum, 100 U / ml Penicillin G und 100 ug / ml Streptomycin (nachstehend als istlassen Kulturmedien). Anmerkung 1: Im Gegensatz zu fötalem Rinderserum (FBS), Pferdeserum fehlt Plazentalaktogen, ein Induktor von β-Zellproliferation, die Analyse in dem Proliferationsassay confounds. ANMERKUNG 2: Wenn die PLGA-Mikrokugeln nicht sterilisiert werden vor der Verwendung, die Zugabe von Antibiotika zu den Kulturmedien von entscheidender Bedeutung mikrobiologische Verunreinigungen zu vermeiden. </li><li> Entfernen 25 ml islet Kulturmedien mit einer elektronischen Pipettiervorrichtung und in einem 50 ml konischen Röhrchen. Ergänzen die 25 ml islet Kulturmedien in der 50 ml konischen Röhrchen mit einer Endkonzentration von 0,2 mM EGTA die Vorassay-Medien zu erzeugen. HINWEIS: Die Zugabe von EGTA leicht lockert Zell-Zell-Kontakte in den kleinen Inseln ohne Inselarchitektur zu verändern. Dies hilft, die COI sicherstellen können, die inneren Zellen der Insel zu erreichen und hilft Nekrose der zentralen Insel zu verhindern. </li></ol> 4. Die Anzucht von Intact Maus Inselchen <ol><li> Isolieren intakter Inseln aus einem vorher ausgewählten Stamm, Geschlecht, age und Genotyp der Mäuse nach einer Routine Kollagenaseverdau des Pankreas 8,9. Pool zusammen Inseln aus wie Proben. </li><li> Aliquot 40 Inselchen in eine Vertiefung einer 96-Well-Gewebekulturplatte in 200 ul islet Kulturmedien. Optisch Größe-Spiel Inseln pro Vertiefung (eine genaue Beurteilung der Insel equivalency (IEQ) zwischen den Proben ist nicht erforderlich). Füllen Sie leere Brunnen unmittelbar neben Brunnen mit kleinen Inseln mit 200 &amp; mgr; l sterilem Wasser eine Verdampfungspuffer zur Verfügung zu stellen. Kultur Inselchen in Medien über Nacht bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2. </li></ol> 5. Wieder Suspension von COI-geladen und die Kontrolle von PLGA Microspheres <ol><li> Nachdem über Nacht islet Erholung resuspendieren Mikrokügelchen durch Zugabe Vorassay-Medien zu einem Aliquot von lyophilisiertem COI belasteten PLGA-Mikrokügelchen, so dass die Endkonzentration von COI in dem Reaktionsgefäß beträgt 10 ng / &amp; mgr; l (die Menge des COI in einer gegebenen Menge an die erzeugten microssphäre wurde in Schritt 2.9) bestimmt. Beschallen die resuspendierten COI-beladenen Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Steuer PLGA-Mikrokugeln durch Zugabe des gleichen Volumens Vorassay-Medien zu einer gleichen Masse von lyophilisierten Kontroll PLGA-Mikrokügelchen. Beschallen die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen in einem Eiswasserbad für 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C. </li><li> Optisch bestätigen Mikrokugeln durch Pipettieren von 2 ul resuspendiert Mikrokugeln zwischen zwei Glasplättchen verteilt sind. Visualisieren Mikrokugeln mit einem 40X-Objektiv auf einem Epifluoreszenz oder Hellfeldmikroskop verwendet wird. </li><li> Wenn eine nennenswerte Aggregation von Mikrosphären ist noch sichtbar, beschallen in einem Eiswasserbad für weitere 10 min bei 160 W mit 10 sec langen Pulsen bei 4 ° C und repeat Visualisierung resuspendiertes Mikrokugeln. </li></ol> 6. Behandlung von Inselchen mit COI-geladen oder Steuer PLGA Microspheres &lt;/ P&gt; <ol><li> Für jede Vertiefung mit COI-beladenen Mikrosphären behandelt werden, Assaymedium herzustellen, indem man die 10 ng / &amp; mgr; l der resuspendierten COI-Mikrokügelchen mit bereits Testmedium auf ein Endvolumen von 100 &amp; mgr; l und einer vorbestimmten Endkonzentration verdünnt wird. HINWEIS: Die optimale Endkonzentration des Proteins wird für jeden COI für diesen Assay verwendet, variieren. Idealerweise werden eine Reihe von Endkonzentrationen getestet. </li><li> Für jede Vertiefung als Kontrolle verwendet werden, Steuerassaymedium herzustellen, indem die resuspendierten Steuer PLGA-Mikrokügelchen Verdünnung in Schritt 5.2 mit dem gleichen Verdünnungsvolumen erzeugten verwendet 6.1 Die COI-beladenen Mikrosphären in Schritt zu verdünnen. HINWEIS: Islets behandelt mit Kontrollassaymedium wird als negative Kontrolle dienen Erfassung irgendeiner Wirkung zu ermöglichen, die leere Mikrokugeln auf die experimentellen Ergebnisse haben können. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig 100 ul der Inselkulturmedien aus jeder Vertiefung mit einer Mikropipette, so dass keine kleinen Inseln aus den Vertiefungen verdrängt werden. fügen Sie vorsichtig 100 μl Assaymedium oder 100 &amp; mgr; l Kontrollassaymedium zu jeder Vertiefung. </li><li> Inkubieren Inselchen bei 37 ° C unter einer Atmosphäre von 95% Luft und 5% CO 2 für drei Tage. </li></ol> 7. Dispergierwerkzeuge Intact Inselchen auf Objektträger <ol><li> Nach drei Tagen mit einer Mikro verwenden, um sorgfältig Testmedien aus allen Vertiefungen entfernen und zu entsorgen, um nicht-Inseln zu entfernen. fügen Sie vorsichtig 200 ul PBS zu Inselchen sie der Testmedien zu waschen. Entfernen Sie vorsichtig und PBS mit einer Mikropipette zu verwerfen und sanft Inseln wieder mit einem zusätzlichen 200 &amp; mgr; l PBS waschen. </li><li> Entfernen und entsorgen PBS mit einer Mikropipette und fügen 100 ul 0,025% Trypsin, 2 mM EDTA-Lösung. 3 min bei RT inkubieren. Pipettieren Inselchen in der Trypsin-EDTA-Lösung nach oben und unten je 2 min bis Inseln werden visuell in einzelne Zellen dispergiert und bestätigt werden (beachten Sie, dass einige kleine Klumpen von Zellen noch vorhanden sein können) mit einem Lichtmikroskop. Übertragen Sie das gesamte Volumen jeder Vertiefung einzelnerly in labeled- Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 400 ul der Inselkulturmedien zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen, die Trypsin-vermittelte Zell-Dissoziation zu stoppen. </li><li> Zentrifuge Proben für 5 min bei 100 × g bei 4 ° C Inselzellen auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchen zu pelletieren. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig Überstand einer Mikropipette und Pellet in 200 ul frische Inselkultur-Medien. </li><li> Unter Verwendung eines Zyto-Zentrifuge, distanzierte Zentrifuge Inseln bei 140 × g für 3 min auf geladene Objektträger. </li><li> Luft trocknen Dias bei RT für 10 min, ziehen dann einen Rahmen um die dissoziierte Inselchen mit einem hydrophoben Markierungsstift. </li><li> Fix-Zellen mit 75 &amp; mgr; l 4% Paraformaldehyd (PFA) bei RT für 10 min. Entfernen Sie die 4% PFA und vorsichtig waschen Zellen in 75 &amp; mgr; l PBS zweimal. Nach dem Waschen permeabilisieren Zellen mit 75 &amp; mgr; l 0,2% Triton X-100 in PBS für 10 min. Dann waschen Sie die Zellen mit 75 &amp; mgr; l PBS. Achtung: PFA ist bekannt, allergen, krebserregend und giftig. </li></ol&gt; 8. Immunofluoreszenz Kennzeichnung von Dissociated Inselchen für Insulin und die Zellproliferation Marker, Ki67 <ol><li> Bereiten Sie eine feuchte Kammer durch zwei nasse Handtücher in den Boden einer 100 Dia Kapazität Objektträger Box platzieren. </li><li> Die Objektträger flach nach unten (Zellen nach oben) in der feuchten Kammer. Vorbereiten Proben für die Markierung durch die PBS aus dem vorhergehenden Waschschritt Aspirieren einer Mikropipette und Zugabe von 75 &amp; mgr; l Blockierlösung (5% normalem Eselserum (NDS) in PBS) zu jeder Folie zu blockieren unspezifische Bindung von Antikörpern an den Proben. Inkubiere Objektträger in Lösung für 1 Stunde bei RT blockiert. </li><li> enthält Meerschweinchen-anti-Insulin und Kaninchen-Anti-Ki67-Antikörpern, verdünnt auf 1 &amp; mgr; g / ml in 5% NDS in PBS vorsichtig absaugen Lösung unter Verwendung einer Mikropipette blockieren und 75 &amp; mgr; l primärer Antikörper-Lösung hinzu. für 1 h bei RT inkubiert. HINWEIS: Alternative Marker der Zellproliferation umfassen wuchernden cell nuclear antigen (PCNA) und Phosphohistone H3 (PH 3), </li><li> vorsichtig absaugen primären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und spülen Sie die Zellen mit 75 &amp; mgr; l PBS. Absaugen PBS mit einer Mikropipette und spülen Zellen zwei Mal mit je 75 &amp; mgr; l PBS. Inkubieren jede Probe mit 75 &amp; mgr; l anti-Meerschweinchen-Cy5 sekundären Antikörper und Anti-Kaninchen sekundären Antikörpers Cy3 bis 2 &amp; mgr; g / ml verdünnte Lösung für 1 h bei RT in blockieren. HINWEIS: Verwenden Sie mit dem gleichen oder spektral überlappende Fluorophore markierte Antikörper verwenden, die bereits verwendet wurde, um die Mikrokugeln beschriften nicht zweitrangig. </li><li> Absaugen sekundären Antikörper-Lösung mit einer Mikropipette und Inkubation in 75 &amp; mgr; l von 300 nM DAPI in PBS für 3 min bei RT mit. Absaugen DAPI mit einer Mikropipette und spülen Sie in VE-Wasser für 5 min. </li><li> Vorsichtig absaugen Wasser aus Proben mit einer Mikropipette. Spot eine Tropfen (etwa 100 ul) von schnelltrocknend Befestigungslösung verblassungshemmenden Reagenz auf einem Deckglas enthält. Kehren Sie die Mikroskop-Objektträger Probenseite nach unten, onde Montagelösung. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schieber eine Pipettenspitze mit Blasen zu entfernen und überschüssige Flüssigkeit mit einem weichen Reinigungstuch abwischen. Erlauben Deck über Nacht bei RT trocknen. </li></ol> 9. Bildaufnahme und Analyse <ol><li> Verwenden Sie ein Epifluoreszenz-Mikroskop mit einer angeschlossenen Kamera zur Bildaufnahme. Für jeden Fluorophor, bestimmen die optimale Belichtungszeit (in der Regel 20 msec für DAPI, 40-80 msec für Insulin und 250 msec für Ki67). Sicherzustellen Bildaufnahmeparameter für alle Proben gleich sind. </li><li> Für jede Probe zählen manuell 3000 Insulin-positiven Zellen und derer zählen, wie viele sind auch Ki67-positiv. Nur zählen Insulin-positive Zellen, die eine gut definierte und deutlich sichtbaren Kern haben. Der prozentuale Anteil proliferierender β-Zellen für jede Probe durch die Anzahl der Ki67-positiv / Insulin-positive Zellen durch die Gesamtzahl von Insulin-positiven Zellen Dividieren und Multiplizieren mit 100. </li><li> Nach determining den Prozentsatz für jede Probe β-Zellen von proliferierenden, festzustellen, wenn ein statistisch signifikanter Unterschied in Proliferations β-Zellen zwischen Kontroll- und experimentellen Proben vorhanden ist, indem Ergebnisse mit einer Einweg-ANOVA unter Verwendung kommerziell erhältlicher Software statistischen Analyse. </li></ol>

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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS-responsive+microspheres+for+on+demand+antioxidant+therapy+in+a+model+of+diabetic+peripheral+arterial+disease.">ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease.</a> Biomaterials. 41, 166-175 (2015).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Die Studie der β-Zellproliferation in Kultur wird typischerweise durch mehrere Schwierigkeiten behindert. Zunächst verewigt β-Zelllinien werden durch höhere Grad der Proliferation gekennzeichnet als das, was in endogenen β-Zellen in lebenden Inseln zu finden ist. Außerdem fehlt diesen immortalisierten Zelllinien die normale Architektur kritisch für die normale β-Zellfunktion. Diese beiden Tatsachen machen es schwierig , zu bestimmen , ob die Resultate mit dem verewigte β-Zelllinien erhalten wird wahr halten , w...

Pancreatic β-Zellen sind die einzigen Insulin-produzierenden Zellen im Körper und sind kritisch Blutzucker Homöostase aufrechtzuerhalten. Während gesunde Individuen ausreichend β-Zellmasse aufweisen und Funktion richtig Blutzucker, Personen mit Diabetes durch unzureichende β-Zellmasse charakterisiert und / oder Funktions 1,2 regulieren. Es ist vorgeschlagen worden , dass β-Zell - Proliferation induzierende letztlich β-Zellmasse erhöhen und Glukose - Homöostase bei Patienten mit Diabetes 3 wieder herzustellen. Allerdings Evaluierung und Validierung von potentiellen β-Zell-proliferative Verbindungen in intakten Inseln ist notwendig, bevor wirksame Therapien entwickelt werden können. Die Transplantation von menschlichen Kadaver Inseln in Personen mit Diabetes stellt Blutzucker-Homöostase für einige Zeit, aber die Verfügbarkeit und den Erfolg dieses experimentellen Verfahrens wird durch einen Mangel an menschlichen Inselchen für Transplantation und von ß-Zelltod in den kleinen Inseln achtern behinderter Transplantation 4. Selbst mit der Entdeckung von Faktoren , die die Vermehrung von Insulin-produzierenden Zellen zu induzieren, eine große Herausforderung noch existiert , diese Faktoren zu den relevanten Stellen in vivo zu liefern. Eine Strategie für eine nachhaltige lokale Auslieferung von β-Zellen-proliferative Verbindungen ist Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA). PLGA hat eine Geschichte der Verwendung in FDA Drug - Delivery - Produkte zugelassen seiner hohen Sicherheit durch, die biologische Abbaubarkeit und erweiterte Freisetzungskinetik 5. Insbesondere ist PLGA ein Copolymer aus Lactid und Glycolid , das mit Wasser durch Hydrolyse abgebaut wird entweder in vivo oder in Kultur zu Milchsäure und Glykolsäure, die natürlich Metaboliten im Körper auftreten. Die verkapselte Wirkstoff-Verbindung kann sowohl durch Diffusion und / oder Abbau gesteuerte Freisetzungsmechanismen in die Umgebung freigesetzt werden. Verkapselung von COI bietet Schutz vor enzymatischem Abbau, die Verbesserung der Bioverfügbarkeit des Reagens gegenüber unencapsulated COI 5. Wir schlagen vor , dass PLGA - Mikrokügelchen verwendet werden können Kandidatenverbindungen auf intakte Inseln in Kultur zu verabreichen, und letztlich in vivo. Testen der Wirksamkeit von PLGA β-Zell - Mitogene zu verabreichen vivo zu Inselchen ex ist kritisch , vor der Transplantation Protokolle untersucht werden. Derzeit gibt es keine Technik, β-Zellproliferation in lebenden Tieren zu messen. Experimente Wirksamkeit potenzieller proliferative Verbindungen in vivo zu beurteilen , daher Verabreichung dieser Verbindungen erfordern Tiere zu leben, mit anschließender Trennung und Verarbeitung von Bauchspeicheldrüsen für Immunmarkierung. Solche Protokolle sind teuer und mühsam, und erfordern die Verbindung systemisch verabreicht werden, ohne Garantie, dass sie die Inseln zu erreichen. Umgekehrt sind einige immortalisierte β-Zelllinien für die Untersuchung von Insulin-produzierenden Zellen in Kultur zur Verfügung, aber diese Zellinien fehlt das islet Architektur und environment gefunden in lebenden Organismen 6. Immortalisierte β-Zelllinien sind auch als mit einem viel höheren Grad an Replikations als endogene β-Zellen in vivo charakterisiert, wodurch Analyse von Verbindungen komplizieren die Proliferation induzieren. In dieser Studie beschreiben wir ein Protokoll, das intakte Inseln, isoliert aus erwachsenen Mäusen verwendet. Im Gegensatz zu β-Zelllinien behalten intakte Inseln normale Inselarchitektur. Ebenso reduziert im Gegensatz zu Experimenten in vivo durchgeführt, Verabreichen proliferative Verbindungen direkt mit kultivierten intakte Inseln signifikant die Menge an Reagenzien , die genau erforderlich ist , um β-Zell - Proliferation zu messen. Die vorliegende Studie verwendet PLGA ein COI, in diesem Beispiel rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) zu verabreichen. Das hier beschriebene Verfahren verleiht einen signifikanten Vorteil gegenüber der Verabreichung von rohen Verbindung zu kultivierten Inseln, wie es für eine kontinuierliche Freisetzung der Verbindung in th erlaubte Medien. Bemerkenswert ist, kann dieser Assay eine Vielzahl von Proteinen und Antikörpern von Interesse intakte Inseln zu verabreichen, werden modifiziert. Auswirkungen auf andere endokrine Zelltypen, einschließlich α-Zellen, ebenfalls analysiert werden.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>For labeling COI with fluorophore</td></tr><tr><td>DMSO Dimethyl Sulfoxide</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>For dissolving fluorophore in step 1</td></tr><tr><td>Disposable PD-10 Desalting Columns</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>Desalting column used in step 1</td></tr><tr><td>Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>Used in generation of microspheres in step 2</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Scientific</td><td>11879-020</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Dextrose Anhydrous</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>Antibiotics for islet media</td></tr><tr><td>Normal horse serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>Supplement for islet media</td></tr><tr><td>96-well tissue culture plate</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>For culturing islets</td></tr><tr><td>Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Supplement for pre-assay islet media</td></tr><tr><td>Cytospin 4 Cytocentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78300003</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>EZ Single Cytofunnel</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>For spinning cells onto microscope slides</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>Used in dissociating islets</td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>For fixing cells</td></tr><tr><td>Triton&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>For permeabilizing cells</td></tr><tr><td>Normal donkey serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>Blocking reagents for immunofluorescence</td></tr><tr><td>Anti-Ki67 antibody</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Polyclonal Guinea Pig Anti-Insulin</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>For Ki67 immunofluorescence</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea Pig</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>For insulin immunofluorescence</td></tr><tr><td>DAPI (4&#039;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>For nuclei visualization in immunofluorescence</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>Fast drying mounting media</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>For lyophilization of microspheres</td></tr></tbody></table>

sustained administration of &#946;-cell mitogens to intact mouse islets ex vivo using biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres

Die Entwicklung von Biomaterialien erhöht signifikant das Potential für eine gezielte Arzneimittelabgabe an eine Vielzahl von Zell- und Gewebetypen, einschließlich den pankreatischen β-Zellen. Darüber hinaus Biomaterial Partikel, Hydrogele und Gerüste bieten auch eine einzigartige Gelegenheit, steuerbaren Medikamentenabgabe aufrechterhalten, zu verabreichen zu ß-Zellen in Kultur und transplantierte Gewebe-Modelle. Diese Technologien ermöglichen die Untersuchung der Kandidaten β-Zell-Proliferation Faktoren intakte Inseln und translational relevanten System. Außerdem β-Zell - Proliferation in einem Kultursystem die Wirksamkeit und Durchführbarkeit der Kandidatenbestimmungsfaktoren für die Stimulierung ist von entscheidender Bedeutung vor uns auf in - vivo - Modellen zu bewegen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Zusammenarbeit Kultur intakte Maus Inselchen mit biologisch abbaubaren Verbindung von Interesse (COI) beladene Poly (Milch-co-Glykolsäure) (PLGA) Mikrokugeln für die Zwecke der die Auswirkungen der anhaltenden Bewertung der in - situ - Freisetzung of mitogenen Faktoren auf β-Zellproliferation. Diese Technik beschreibt im Detail, wie PLGA-Mikrokügelchen zu erzeugen, um eine gewünschte Ladung unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien enthält. Während die beschriebene Technik rekombinantes menschliches Bindegewebe-Wachstumsfaktor (rhCTGF) als Beispiel verwendet wird, könnte eine Vielzahl von COI ohne weiteres verwendet werden. Zusätzlich verwendet dieses Verfahren 96-Well-Platten, die Menge der Reagenzien zu minimieren, notwendig, β-Zellproliferation zu beurteilen. Dieses Protokoll kann ohne weiteres auf die Verwendung des alternativen Biomaterialien und anderen endokrinen Zelleigenschaften angepasst werden, wie das Überleben von Zellen und Differenzierungsstatus.

Figur 1 ist eine visuelle Darstellung der Mikrokugeln unter Verwendung des obigen Protokolls erzeugt. Das hier beschriebene Protokoll ergibt rhCTGF beladenen Mikrokügelchen in verschiedenen Größen. Der größte Teil der Mikrokügelchen zwischen 1 und 10 &amp; mgr; m im Durchmesser sein, obwohl einige Mikrokugeln kann größer (Abbildung 2). Falls gewünscht, können Mikrokügelchen eine Größe basierend auf Herstellungsparameter abge...

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Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of &#946;-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate &#946;-cell mitogens.

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Verwendung von biologisch abbaubaren Poly (Milch-co-Glykolsäure) Microspheres

The development of biomaterials has significantly increased the potential for targeted drug delivery to a variety of cell and tissue types, including the ...

sustained-administration-cell-mitogens-to-intact-mouse-islets-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.2K Aufrufe.  Vanderbilt University Medical Center. Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Serie: Sustained Administration of β-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

Generation of Alginate Microspheres for Biomedical Applications

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and physical architecture. Applications include cell encapsulation, drug delivery, stem cell culture, and tissue engineering scaffolds. In fact, clinical trials are currently being performed in which islets are encapsulated in PLO coated alginate microbeads as a treatment of type I diabetes. However, large numbers of islets are required for efficacy due to poor survival following transplantation. The ability to locally stimulate microvascular network formation around the encapsulated cells may increase their viability through improved transport of oxygen, glucose and other vital nutrients. Fibroblast growth factor-1 (FGF-1) is a naturally occurring growth factor that is able to stimulate blood vessel formation and improve oxygen levels in ischemic tissues. The efficacy of FGF-1 is enhanced when it is delivered in a sustained fashion rather than a single large-bolus administration. The local long-term release of growth factors from islet encapsulation systems could stimulate the growth of blood vessels directly towards the transplanted cells, potentially improving functional graft outcomes. In this article, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. In addition, we describe a method we developed for generating multilayered alginate microbeads. Cells can be encapsulated in the inner alginate core, and angiogenic proteins in the outer alginate layer. The release of proteins from this outer layer would stimulate the formation of local microvascular networks directly towards the transplanted islets.

In the following sections, we outline procedures for the preparation of alginate microspheres for use in biomedical applications. We specifically illustrate a technique for creating multilayered alginate microspheres for the dual purpose of cell and protein encapsulation as a potential treatment for type 1 diabetes.

Erzeugung von Alginat-Mikrokugeln für biomedizinische Anwendungen

Alginate-based materials have received considerable attention for biomedical applications because of their hydrophilic nature, biocompatibility, and ...

Forschung

Medizin

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

Gerüstgestützte Transplantation von Inseln in der epididymalen Fettauflage von diabetischen Mäusen

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

Biotechnik

Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and survival post-transplantation. This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using an ultrathin heparin-incorporated starPEG (Hep-PEG) nanocoating. To generate the Hep-PEG nanocoating for pancreatic islet surface engineering, heparin succinimidyl succinate (Heparin-NHS) was first synthesized by modification of its carboxylate groups using N-(3-dimethylamino propyl)-N'-ethyl carbodiimide hydrochloride (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). The Hep-PEG mixture was then formed by crosslinking of the amino end-functionalized eight-armed starPEG (starPEG-(NH2)8) and Heparin-NHS. For islet surface coating, mouse islets were isolated via collagenase digestion and gradient purification using Histopaque. Isolated islets were then treated with ice cold Hep-PEG solution for 10 min to allow covalent binding between NHS and the amine groups of islet cell membrane. Nanocoating with the Hep-PEG incurs minimal alteration to islet size and volume and heparinization of the islets with Hep-PEG may also reduce instant blood-mediated inflammatory reaction during islet transplantation. This "easy-to-adopt" approach is mild enough for surface engineering of living cells without compromising cell viability. Considering that heparin has shown binding affinity to multiple cytokines, the Hep-PEG nanocoating also provides an open platform that enables incorporation of unlimited functional biological mediators and multi-layered surfaces for living cell surface bioengineering.

This protocol aims to achieve surface engineering of pancreatic islets using a heparin-incorporated starPEG nanocoating via pseudo-bioorthogonal chemistry between the N-hydroxysuccinimide groups of the nanocoating and the amine groups of islet cell membrane.

Oberflächentechnik von pankreatischen kleinen Inseln mit einer Heparinisierten StarPEG NanoCoatings

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet &#946;-cells remains an attractive strategy. &#946;-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain &#946;-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify &#946;-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a &#946;-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on &#946;-cells and the molecular mechanisms that regulate &#946;-cell growth.

A High-content In Vitro Pancreatic Islet &#946;-cell Replication Discovery Platform

Critical challenges for the diabetes research field are to understand the molecular mechanisms that regulate islet &#946;-cell replication and to develop methods for stimulating &#946;-cell regeneration. Herein a high-content screening method to identify and assess the &#946;-cell replication-promoting activity of small molecules is presented.

Ein hoher Gehalt<em&gt; In Vitro</em&gt; Pancreatic Islet β-Zell-Replikation-Discovery-Plattform

Loss of insulin-producing &#946;-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion ...

Intraportal Transplantation of Pancreatic Islets in Mouse Model

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation site in experimental islet transplantation is the kidney capsule. However, as less is known about the interaction of pancreatic islets with blood constituents, it also makes sense to utilize the portal vein approach in experimental islet transplantation.
This protocol demonstrates an intraportal islet transplantation technique in NMRI nude mice. Streptozotocin (180 mg/kg) is injected intraperitoneally to induce hyperglycemia in recipient mice. They are considered as diabetic at a non-fasting blood glucose level greater than 20 mmol/L. One day prior to transplantation, mouse pancreatic islets are isolated from the donor pancreas by collagenase digestion; a minimum of 350 islets are utilized per diabetic recipient. Depending upon the islet isolation yield, two or more donor mice are utilized per recipient. After overnight culture at 37 &#176;C, islets are administered into the recipient liver via the portal vein. After surgery, the mice are protected in red Makrolon houses and observed until are awake. This protocol maintains glycemic control for 120 days in syngeneic mice and 15 days in allogeneic mice.

Pancreatic islet transplantation is a way to achieve normoglycemia in type 1 diabetes. This article focuses on the transplantation technique through the intraportal route to maintain normal glucose levels in diabetic mice.

Intraportal Transplantation der Bauchspeicheldrüse Inselchen im Mausmodell

Pancreatic islet transplantation to reduce hyperglycemia is highly successful in rodents with chemically-induced diabetes. The most common transplantation ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

Eine Methode zur Maus-Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation und intrazellulären cAMP-Bestimmung

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Biologie

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens. 
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas. 
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell&#180;s tensegrity.

In Vitro Pancreas Organogenesis from Dispersed Mouse Embryonic Progenitors

The three-dimensional culture method described in this protocol recapitulates pancreas development from dispersed embryonic mouse pancreas progenitors, including their substantial expansion, differentiation and morphogenesis into a branched organ. This method is amenable to imaging, functional interference and manipulation of the niche.

In-vitro-Pankreas Organogenese von Dispersed embryonalen Maus-Vorläufer

The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the ...

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the kidney capsule in most rodent preclinical islet transplantation studies. This model is commonly used because murine intrahepatic islet transplantation is technically challenging, and a high percentage of mice could die from surgical complications, especially bleeding from the injection site post-transplantation. In this study, two procedures that can minimize the incidence of post-infusion portal vein bleeding are demonstrated. The first method applies an absorbable hemostatic gelatin sponge to the injection site, and the second method involves penetrating the islet injection needle through the fat tissue first and then into the portal vein by using the fat tissue as a physical barrier to stop bleeding. Both methods could effectively prevent bleeding-induced mouse death. The whole liver section showing islet distribution and evidence of islet thrombosis post-transplantation, a typical feature for intrahepatic islet transplantation, were presented. These improved protocols refine the intrahepatic islet transplantation procedures and may help laboratories set up the procedure to study islet survival and function in pre-clinical settings.

Here we present refined surgical procedures on successfully performing intraportal islet transplantation, a clinically relevant but technically challenging surgical procedure, in mice.

Minimierung der Venenblutung nach der Infusion während der intrahepatischen Inseltransplantation bei Mäusen

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

Ein einfaches Hocheffizienzprotokoll für die Isolierung von Pankreas-Isleten von Mäusen

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

A Method for Islet Transplantation to the Omentum in Mouse

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet infusion is far from ideal and therefore, the omentum is re-emerging as a potentially valuable site for islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and the implantation of the islets to the diabetic recipients. Transplantation to the omentum requires surgical steps that can be better demonstrated visually. Here, the detailed steps for this procedure are presented. Two methods of mixing the isolated islets with hydrogel before placing the mixture into the omental pouch of diabetic mice are described here. Different hydrogels are used for the different conditions. Blood glucose levels of diabetic mouse recipients of syngeneic islets in the omentum were monitored for up to 35 days. Some animals were sacrificed after 14 days to perform immuno-histochemical analysis. This pre-clinical transplantation approach can be used as preliminary data leading up to translation to clinical transplantation.

A method for the omental transplantation of islets in a mouse is introduced. The isolated islets are mixed with hydrogel and the mixture is placed into the omental pouch of a diabetic mouse. Then, the blood glucose is monitored, and immuno-histochemical analysis is performed.

Eine Methode zur Inselversetzung, Omentum in Maus

Islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Recent compelling evidence indicates that intravascular islet ...

Sustained Verabreichung von β-Zellen-Mitogene zu Intact Maus Inselchen

Zusammenfassung

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