Dieses Protokoll ermöglicht es uns, endogene Mitophagie-Komplexe in menschlichen Geweben wie Beta-Zellen zu überwachen und so die Mitophagieforschung in schlüsselrelevanten translationsrelevanten Geweben zu erleichtern. Ein Vorteil dieser Technik ist ihre Fähigkeit, wichtige Mitophagie-Komplexe in vivo in Geweben mit einer seltenen Verfügbarkeit oder in kleinen Probenzahlen zu visualisieren. Nach Isolation nach Standardprotokollen, Kultur vier bis sechs mal 10 bis die dritte menschliche Islet Äquivalente in 10 Milliliter komplette Pankreas-Islet-Medium für mindestens einen Tag bei 37 Grad Celsius.
Verwenden Sie am nächsten Tag ein Sezieren von Lichtmikroskop bei dreifacher Vergrößerung, um einzelne menschliche Inselchen innerhalb der Kultur zu zählen. Pick 40 Inselchen pro Behandlung oder Zustand von Interesse in 1,5 Milliliter Rohre Inselmedium. Sedimentieren Sie die Inseln durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS, ergänzt mit 50 Mikromolaren PR619, wieder auf.
Invertieren Sie die Röhre und sammeln Sie die Inseln durch Zentrifugation für eine zweite Wäsche in frischen PBS plus Deubiquitinase-Inhibitor. Nach der zweiten Zentrifugation dissoziieren Sie die Inselchen in Einzelzellen mit 125 Mikrolitern 0,25%Trypsin plus Inhibitor für drei Minuten bei 37 Grad Celsius mit periodischer sanfter Pipettierung. Am Ende der Inkubation, halten Sie die Reaktion mit einem Milliliter von 37 Grad Celsius erwärmt Bauchspeicheldrüsen-Islet-Medium mit PR619 ergänzt.
Sammeln Sie die Inseln durch Zentrifugation für zwei Wäschen in frischen PBS plus Inhibitor pro Waschgang. Nach der zweiten Wäsche die dissoziierten Inselchen in 150 Mikrolitern frischer PBS plus Inhibitor wieder aussetzen. Zur Haftung und Fixierung der einzelnen Inselchen wird die Zelllösung auf frostig geladene Mikroskopdias gezwickt und mit einem hydrophoben Pen im Zellbereich dargestellt.
Dann fixieren Sie die eingekreisten Zellen mit 4%Paraformaldehyd und PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Für die immunhistochemische Analyse der Ischenproben die Zellen mit zwei fünfminütigen Waschungen in PBS bei Raumtemperatur waschen, gefolgt von einer unspezifischen Bindungsblockierung mit 10% Eselserum und PBS plus 0,3% Waschmittel für eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der blockierenden Inkubation die Zellen mit primärem Mausantikörper gegen Ubiquitin-spezifische Peptidase 8, primären Kaninchenantikörper gegen Neuregulin-Rezeptor-Abbauprotein-1 und einen Marker spezifisch für die Beta-Zell-Identifikation, der nicht in Maus oder Kaninchen angehoben wurde, um das Proximity Ligation Assay-Signal über Nacht bei vier Grad Celsius nicht zu stören.
Am nächsten Morgen waschen Sie die Proben mit zwei fünfminütigen Wäschen in PBS auf eine Wippe. Fügen Sie Anti-Ziegen Cy5 Sekundärantikörper zu einer frisch zubereiteten Näherungligations-Assay-Lösung hinzu. Nach der zweiten Wäsche jede Isletprobe mit 20 Mikrolitern Sondenlösung beschriften und die Dias mit Kunststofffolie für eine einstündige Inkubation bei 37 Grad Celsius wiederherstellen.
Am Ende der Inkubation die Zellen mit zwei fünfminütigen Wäschen in Puffer A auf einer Wippe waschen, gefolgt von einer Inkubation mit 20 Mikrolitern frisch zubereiteter Ligationslösung, ergänzt mit 0,25 Einheiten pro Mikroliter Ligase pro Rutsche für eine 30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Ligation die Zellen zweimal mit Puffer A zwei Minuten pro Wäsche waschen. Bedecken Sie jede Probe mit 20 MikroliterN Verstärkungslösungen, ergänzt mit Polymerase für eine 100-bis 120-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Um die Zellen auf die Bildgebung vorzubereiten, waschen Sie die Proben zweimal in frischem Puffer A für 10 Minuten pro Wäsche auf einer Wippe, gefolgt von einer Wäsche in 0,1x Puffer B für zwei Minuten auf der Wippe. Nach der letzten Wäsche montieren Sie die Dias mit einem Tropfen Montagemedium mit DAPI und legen Sie vorsichtig einen Deckelschlupf über jede Probe mit einem Skalpell, um blasen zu drücken. Dann versiegeln Sie die Abdeckungen mit klarem Nagellack an den Rändern.
Um die Proben abzubilden, legen Sie eine Folie auf die Bühne eines Mikroskops, das mehrere Brennebenen erfassen kann, und wählen Sie die 100-fache Vergrößerung aus. Stellen Sie die Z-Stack-Höhe auf ca. 0,45 Mikrometer und die entsprechenden Flecken-, Gegenflecken- und Live-Zellsignalanregungs- und Emissionsparameter ein. Erhalten Sie mindestens neun verschiedene Fokale-Ebenenbilder.
Um sicherzustellen, dass die Fluoreszenzbild-Hintergrundsignale und streunendes Licht minimiert werden, verarbeiten Sie die Bilder unter Verwendung eines zweidimensionalen Dekonvolution-Algorithmus für den nächsten Nachbarn mithilfe einer Standard-Bildverarbeitungssoftware der Wahl. Um die Interaktionen mit der Nähe von Ligationsassay zu quantifizieren, öffnen Sie ImageJ und öffnen Sie das Proximity Ligation Assay-Bild. Klicken Sie ausgehend vom ersten scharfen Bild mit fokussiert auf Bild, und wählen Sie Anpassen und Schwellenwert aus.
Passen Sie den Schwellenwert an, um das gesamte unspezifische Näherungsligations-Assaysignal zu entfernen, und notieren Sie sich die Schwellenwertanpassung, um zu versuchen, das Signal während der gesamten Analyse konsistent zu halten. Klicken Sie auf Prozess, und wählen Sie Binär und Binary erstellen aus. Vergewissern Sie sich, dass Größe auf Null auf unendlich, Zirkularität auf Null auf eins, Anzeigen auf Gliederung und die Felder Ergebnisse anzeigen und Ergebnisse löschen aktivieren.
Beachten Sie die Anzahl der Partikel, die in einer Kalkulationstabelle analysiert wurden, die die Probe und die Z-Stack-Position angibt. Klicken Sie dann auf Partikel analysieren und analysieren, um die Partikel zu messen. Wenn alle fokussierten Z-Stacks für die Probe analysiert wurden, senden Sie die Gesamtzahl der Partikel für die Probe in der Kalkulationstabelle, um die Gesamtzahl der Interaktionen zu quantifizieren.
Die Antikörper, die im Näherungstest verwendet werden, sind spezifisch für die Liganden und weisen keine Überlappung auf. Wie bereits beobachtet, ist das Dispersionsprotokoll hocheffizient bei der Gewinnung einzelner Zellen im Mikroskopfeld für die nachgeschaltete Analyse und die Betazellfärbung bleibt nach der Proximity-Ligations-Assay-Färbung in primären menschlichen Inselchen erhalten. Mit Den gezeigten Techniken konnte festgestellt werden, dass die Wechselwirkung von Neuregulin-Rezeptor-Abbauprotein-1 und Ubiquitin-spezifischem Peptidase 8 nach einer 48-stündigen Exposition gegenüber Palmitat verringert wird, was die Durchführbarkeit dieses Tests zur Bewertung wichtiger endogener Mitophagiefaktoren nach diabetoogenen Reizen unterstreicht.
Die effiziente und schonende Dispersion menschlicher Inselchen ist entscheidend, um die Quantifizierung der richtigen Zellpopulationen flussabwärts zu gewährleisten. PLA ermöglicht die Bewertung wichtiger Mitophagie-Komplexe in menschlichen Isätsproben, die die Analyse von Mitophagie- und biologisch wichtigen menschlichen Patientenproben ermöglichen, die das Feld der Diabetesforschung voranbringen.
