Diese Arbeit wurde von der R & D Planen der Provinz Guangdong (VR China) (2016A050503028) finanziell unterstützt.

Aller Verfahren, einschließlich menschliche Blutentnahme wurden von Sun Yat-Sen Universität Ethik-Kommission genehmigt.
1. GPC3-S-Fab Design-Strategie
<ol><li>Entwerfen Sie GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung einer Fab Anti-GPC3 (vermenschlichten GC3313) mit einer Anti-CD16 LHKW14 (Abbildung 1).</li>
	<li>Synthetisieren Sie und Klonen Sie die VH-CH1-CD16-LHKW und VL-CL in der pET26b und pET21a Vektoren wie bereits berichtet12.</li>
</ol>2. Transformation und Kultur
<ol><li>Addieren Sie 100 ng von pET26b mit VH-CH1-CD16 (Abbildung 1A) und 100 ng von pET21a mit VL-CL (Abbildung 1A) in 100 µL kompetente BL21 (DE3) Zellen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 30 min. inkubieren im Wasserbad 42 ° C für 45-90 s, Transfer, auf Eis und inkubieren Sie für ca. 3-5 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Lysogeny Brühe (LB) Medium in ein Röhrchen mit BL21 (DE3) Zellen und dann Inkubation bei 37 ° C, 150 u/min für 45-60 min. verteilt 100 µL BL21 (DE3) Zellen auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL von Kanamycin und 100 µg/mL von Ampicillin , und dann Inkubation bei 37 ° C für 12-16 Uhr.<ol>
<li>Lysogeny Brühe (LB) Medium vorbereiten: 1 % wt/Vol Tryptone, 0,5 % wt/Vol Hefeextrakt, 1 % wt/Vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellen aus einer einzigen Kolonie in 5 mL super Brühe (SB) Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillinund Kultur bei 37 ° C, 220 u/min, über Nacht zu impfen. Dann impfen Sie 1 mL der Kultur in 100 mL SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min für 4 h-haltigem Medium. Übertragen Sie anschließend 10 mL der Kultur in 1 L des SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min-haltigem Medium.<ol>
<li>Bereiten Sie super Brühe Medium: 3,2 % wt/Vol Tryptone, 2 % wt/Vol Hefeextrakt, 0,5 % wt/Vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erreicht die OD600 0,6 - fügen 0,8, Sie Isopropyl-b-D-Thio-Galactopyranoside (IPTG), eine Endkonzentration von 0,2 mM. Kultur bei 16 ° C, 180 u/min für 36-48 h für periplasmatischen Ausdruck.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab periplasmatischen Reinigung
<ol><li>Periplasmatischen Bruchteil Vorbereitung<ol>
<li>Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g, 4 ° C für 30 min zu, entsorgen Sie das Medium und Wägezellen Sie die.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie die Zellen gründlich in 4 mL eiskaltes Saccharoselösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25 % (wt/Vol) Saccharose und 1 mM EDTA) pro Gramm der Zellen und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit festen Winkeln), 4 ° C für 20 min. Überstands (Saccharose-Bruch) zu entfernen und speichern Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Die Pellets in einem Mix aus eiskalten 5 mM MgCl2 und 1 mM PMSF (4 mL pro Gramm Zellen) aufzuwirbeln. Hinzufügen von 40 µL Lysozym-Lager (15 mg/mL) pro Gramm, und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit Winkeln fixiert), 4 ° C für 20 min. Transfer der Überstand (periplasmatischen Bruch) und speichern Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil und Zentrifugieren bei 30.000 x g, 4 ° C für 30 min. Überstands entfernen und speichern Sie es in einem 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NI-NTA-Affinitätsreinigung<ol>
<li>1 mL der Ni-NTA Agarose durch gründlich mischen, um eine homogene Suspension zu erreichen, 1 mL Ni-NTA Agarose, einem frischen 15 mL konische Rohr zu entfernen und Hinzufügen von 10 Spalte Volumen (CV) Gleichgewichtherstellung Puffer Aufschwemmen (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) zu equilibrate.</li>
		<li>400 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie die Ni-NTA-Agarose in der 50 mL-Tube mit Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil. Felsen bei 4 ° C für 2 h.</li>
		<li>Die Mischung bei 400 X g zentrifugieren, 4 ° C für 5 min. entfernen Sie vorsichtig den überstand auf eine andere frische eiskalte Röhre als ungebundene Bruch. Übertragen Sie die Ni-NTA-Agarose in eine Schwerkraft-Spalte.</li>
		<li>Fügen Sie 10 CV von Waschpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM oder 40 mM imidazol) auf die Spalte, und sammeln die Elute waschen Bruch. Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie 3 CV der Elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM oder 400 mM imidazol) in die Spalte und sammeln die Elute Elution Bruch 1, 2, 3 und 4. Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden.</li>
		<li>Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h überprüfen das Vorhandensein von GPC3-S-Fab um 12 % SDS-PAGE und dann durch Coomassie blaue Färbung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-CH1 Affinitätsreinigung<ol>
<li>Überführen Sie 1 mL der IgG-CH1 Affinität Harz in ein 50 mL konische Röhrchen, und waschen Sie zuerst die Perlen mit PBS. Fügen Sie dann die dialysierten Lösung mit GPC3-S-Fab nach Schritt 3.2.6. Felsen bei 4 ° C für 2 h.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 X g für 5 min, 4 ° C. Sorgfältig entfernen des Überstands auf eine andere frische eiskalte Röhre und das Harz auf eine Schwerkraft-Spalte zu übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 CV des Waschens Puffer (PBS) in die Spalte, und sammeln Sie die Elution der Wash-Bruch.</li>
		<li>Bereiten Sie die Röhrchen durch Zugabe von 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL pro mL der einzelnen eluierten Fraktionen). Eluieren mit 3 CV Elution Buffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7), und sammeln den eluierten Bruch; Wiederholen Sie 3 Mal.</li>
		<li>Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h zweimal wiederholen.</li>
		<li>Konzentration des Proteins durch Ultramicrospectrophotometer bestimmen (molare Aussterben Koeffizient: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
<ol><li>5 x SDS laden Puffer 10 µL der Probe berücksichtigen und gut mischen. Kochen Sie die Proteinmischung bei 100 ° C für 5 min.<ol>
<li>5 x SDS laden Puffer vorzubereiten: 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % wt/Vol SDS, 0,5 % wt/Vol Bromophenol Blue, 50 % Vol/Vol Glycerin, 5 % Vol/Vol Beta-Mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine SDS-PAGE-Gel mit einem Laden Gel (5 %) und Trennung Gel (12 %) als zuvor beschriebenen26,27,28.</li>
	<li>Laden Sie 10 µL des gekochten Proteinmischung und Protein-Marker, und führen Sie die SDS-PAGE.</li>
	<li>Färben Sie das Gel durch Schütteln für 20 min mit Coomassie brilliant blau Lösung, und führen Sie dann entfärben.</li>
	<li>Für das westliche Beflecken, nach der Übertragung auf PVDF Membran, blockieren die Membran mit TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % Vol/Vol Tween 20) + 5 % wt/Vol Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur unter schütteln.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörper (Anti-His oder Anti-Flag) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.</li>
	<li>Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran in Sekundärantikörper (HRP-linked Anti-Maus Fc Antikörper) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.</li>
	<li>Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der HPR Substrat pro Film, entwickeln Sie und nehmen Sie Bilder.</li>
</ol>5. Gelanalyse Filtration
<ol><li>Verwenden Sie die folgende Spalte: Spalte Volumen von 24 mL; Gleichgewichtherstellung Puffer von PBS pH 7.4; Durchfluss von 0,5 mL/min bei gemäßigten Zimmer; Probenvolumen von 200 µL.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Protein Volumen und Konzentration: 500 µL 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.</li>
	<li>Nehmen Sie für die Protein-Marker-Volumen und Konzentration 100 µL Cytochrom C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL Anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), Albumin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL und 200 µL des Alkohol-Dehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) in einem Rohr. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.</li>
	<li>Waschen Sie vor jeder Fahrt mit mindestens 2 CV von destilliertem Wasser bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrate die Spalte mit mindestens 2 CV Gleichgewichtherstellung Puffer (PBS, pH 7.4) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.</li>
	<li>Injizieren Sie automatisch Probe bei 0,5 mL/min auf die Probe zu laden.</li>
	<li>Eluieren mit Gleichgewichtherstellung Puffer mit 0,5 mL/min und bei 280 und 215 nm zu erkennen.</li>
</ol>(6) Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Kultur der HepG2 (GPC3 positiv), Hep3B (GPC3 positiv), Huh7 (GPC3 positiv), und MHCC - 97H (GPC3 negativ) Zellen in Plastikschalen 100 x 20 mm mit DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C 5 % CO2.</li>
	<li>Kultur CHO (GPC3 negativ) und CHO/GPC3 Zellen beherbergen die in voller Länge menschlichen GPC3 cDNA (GPC3 positiv) in 100 mm x 20 mm Plastikschalen mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Kultur der NK92/CD16 beherbergen die in voller Länge menschlichen CD16 cDNA (CD16 positiv) in 25cm2 Kolben mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Wenn die Zellen sind 70-90 % konfluierende, verwerfen das Medium und die Zellen mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 2-3 min (oder bis die Zellen beginnen sich zu lösen von der Oberfläche). Fügen Sie 1 mL des Mediums komplette Wachstum zu neutralisieren die Trypsin und erneut aussetzen der Zellen durch sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Neubauer Hemocytometer und erkennen Sie die Zellviabilität Trypan blau zu.</li>
	<li>3 x 106 Zellen für jede Zelllinie zu sammeln. Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen. Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. zweimal wiederholen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,3 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen, und übertragen Sie 100 µL (ca. 1 Million) auf jedes 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen. Hinweis: Bitte stellen Sie sicher, dass alle Schritte von hier aus an den Rohren auf Eis kühl gelagert werden sollte. Wenn der Antikörper auf der Zelle Oberfläche Antigen gebunden ist, beginnt die Anlage zu verinnerlichen. Dadurch, dass es kalt, ist der Prozess deutlich verlangsamt.</li>
	<li>Jedes Rohr 10 µL Primärantikörper (GPC3-S-Fab oder menschlichen IgG1, Endkonzentration 5 µg/mL) hinzu, und auf Eis für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Neu in 100 µL PBS + 0,2 % BSA, auszusetzen und dann fügen Sie 0,5 µL sekundäre Antikörper (Anti-Human IgG(H+L)-488, endgültige Konzentration 10 µg/mL) und Inkubation für 1 h Hinweis auf Eis: von diesem Schritt bitte halten Sie die Zellen aus dem Licht.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen, indem Sie Durchflusszytometer nach Standardprotokoll29. Zellen mit einem 488 nm Laser Erregung zu erwerben.</li>
</ol>(7) zytotoxischen Assays
<ol><li>Bereiten Sie Tumorzellen.<ol>
<li>Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H und CHO Zellinien wie 6.1-6.5 beschrieben.</li>
		<li>Verdünnen Sie Zellen 0,5 × 105/mL und Platte 100 µL Zellen (5.000 pro Well) auf 96-Well Platten. Kultur 6-8 h um die Zellen zu befestigen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) vorzubereiten.<ol>
<li>Verdünnen Sie frisches zubereitetes Blut mit ein gleiches Volumen an PBS in einer 50 mL konische Röhre. Z. B. verdünnen Sie 10 mL Blut mit 10 mL PBS.</li>
		<li>Eine frische 50 mL konische Rohr berücksichtigen Sie 15 mL Lymphozyten Trennmedium. Übertragen Sie das verdünnte Blut auf die Lymphozyten Trennmedium entlang der Schlauchseite langsam. Hinweis: Halten Sie das Rohr senkrecht. Brechen Sie die Oberfläche des Mediums Lymphozyten Trennung nicht.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 35 min bei Raumtemperatur mit der Bremse aus.</li>
		<li>Langsam entfernen Sie der oberen Plasmaschicht, und die weißen Blutkörperchen-Layer mit PBMCs an der Plasma-Lymphozyten Trennung mittlere Schnittstelle.</li>
		<li>Verdünnen Sie die PBMCs mit einem doppelten Volumen von PBS + 2 % FBS. 400 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS + 2 % FBS. Zentrifuge bei 400 X g für 5 min. zählen die Zellzahlen wie in Schritt 6.5 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK-Zellen vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie die PBMCs Suspension in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL in PBS + 2 % FBS und Stelle Sie in eine 5 mL Polystyrol Rundboden-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie menschliche NK Zelle Bereicherung Cocktail 50 µL/ml von Zellen. Gut verrühren und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Die Magnetpartikel von NK Zelle Enrichment Kit, und gut mischen, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig durch pipettieren ausgesetzt sind oben und unten kräftig mehr als 5mal aufzuwirbeln. Übertragen Sie die resuspendierte Magnetpartikel 100 µL/ml auf die Zellsuspension. Gut mischen und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bringen Sie die Zellsuspension bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 mL durch Zugabe von PBS + 2 % FBS. Mischen Sie die Zellen in der Röhre durch pipettieren sanft nach oben und unten 2 - 3 Mal. Platzieren Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten. Lassen Sie die magnetische Beads niederlassen für 2,5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie den Magneten. Invertieren Sie in einer kontinuierlichen Bewegung das Rohr, gießt die angereicherten Zellsuspension in einen neuen Schlauch.</li>
		<li>Zählen Sie die Zelle Zahlen wie im Schritt 6.5 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie die zytotoxische Reaktion.<ol>
<li>Verdünnen Sie die NK-Zellen, 5 × 105 Zellen/mL mit dem entsprechenden Kulturmedium. Die Tumorzellen auf einer 96-Well-Platte vergoldet fügen Sie 100 µL Zellsuspension NK hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL GPC3-S-Fab in verschiedenen Konzentrationen mit der höchsten Dosis an eine Endkonzentration von 30 µg/mL, 3-fold Verdünnung, 9-Punkt (3 Wiederholungen).</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 72 h.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 72 h Inkubationszeit das Medium 100 µL 10 µL CCK8 Reagenz in jede Vertiefung in 96-Well Platten-haltigem DMEM Medium hinzufügen und dann bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Lesen Sie die Platte bei 450 nm bei 1, 2, 3 und 4 h nach dem Hinzufügen des CCK8 Reagens.</li>
		<li>Die Daten zu analysieren. Berechnen Sie die Überlebensrate als (OD450 GPC3-S-Fab + Effektor + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 % und (OD450 GPC3-S-Fab + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 %. Die Effektorzellen sind NK-Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonclinical+evaluation+of+GMA161--an+antihuman+CD16+(FcgammaRIII)+monoclonal+antibody+for+treatment+of+autoimmune+disorders+in+CD16+transgenic+mice.">Nonclinical evaluation of GMA161--an antihuman CD16 (FcgammaRIII) monoclonal antibody for treatment of autoimmune disorders in CD16 transgenic mice.</a> Toxicological Sciences. 125 (1), 299-309 (2012).</li><li>Sharma, R., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ-specific+phenotypic+and+functional+features+of+NK+cells+in+humans.">Organ-specific phenotypic and functional features of NK cells in humans.</a> Immunological Research. 58 (1), 125-131 (2014).</li><li>Li, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+CD16a,+the+surface+receptor+of+Kupffer+cells,+on+the+growth+of+hepatocellular+carcinoma+cells.">Effect of CD16a, the surface receptor of Kupffer cells, on the growth of hepatocellular carcinoma cells.</a> International Journal of Molecular Medicine. 37 (6), 1465-1474 (2016).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> Journal of Visualized Experiments. (48), (2011).</li><li>Hwang, A. C., Grey, P. H., Cuddy, K., Oppenheimer, D. 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R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).</li><li>Feng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutically+targeting+glypican-3+via+a+conformation-specific+single-domain+antibody+in+hepatocellular+carcinoma.">Therapeutically targeting glypican-3 via a conformation-specific single-domain antibody in hepatocellular carcinoma.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (12), E1083-E1091 (2013).</li></ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

In dieser Studie präsentieren wir eine Strategie, um ein neues Format von BsAbs, konstruieren GPC3-S-Fab, die NK-Zellen GPC3 positive Tumorzellen gezielt rekrutieren kann. Die S-Fab basiert auf der natürlichen Fab Format durch das Hinzufügen einer Anti-CD16 LHKW11,12. Im Vergleich mit der BsAbs enthaltenden Fc Region, kann GPC3-S-Fab leicht in das Periplasma von Bakterien in großem Maßstab hergestellt werden.
Mit der im Protokoll ...

Monoklonale Antikörper dienen heute im großen und ganzen für Krebs Behandlung1. Aufgrund der Flexibilität der Antikörper wurden verschiedene Antikörper-basierte Formate aktiv untersucht. Im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern, haben BsAbs zwei verschiedene Antigen Bindung Module, damit sie erkennen, dass zwei verschiedene Ziele gleichzeitig und effizient lösen die Rekrutierung von immun-Effektorzellen und Tumor Zellen2töten.
Aktuelle rekombinante BsAb Formate können in der Regel zwei Klassen zugeordnet werden: Fc-haltigen BsAbs und BsAbs ohne eine Fc-Region. Verglichen mit Fc-haltigen Formate, die meist in Säugerzellen hergestellt werden, BsAbs ohne eine Fc-Region haben die Vorteile der kleineren Größen sind leichter im Mikroorganismus Expressionssysteme produziert, und dringen Tumorgewebe effizienter 3.
BsAbs ohne eine Fc-Region entstehen häufig durch die Verknüpfung von einzelnen verbindlichen Moieties, wie Single-Chain Variable Fragmente (ScFvs) oder Fabs3. Ohne die stabilisierenden Domänen kompromittiert BsAbs basierend auf ScFv-Fragmenten oft thermische Stabilität, geringe Löslichkeit oder ein erhöhtes Potenzial für Aggregation4,5. Im Gegensatz dazu sind Fab-basierte BsAbs stabiler aufgrund der Heterodimerization der CH1 und CL in der nativen Fab Glyko-4,6.
Variable Domäne aus Heavy-Kette-nur Antikörper (Fhkw, auch als Einzeldomäne Antikörper bezeichnet) sind die aktiven Antigen-bindenen Fragment der natürliche schwere Kette Antikörper7. Fhkw haben die Eigenschaften der hohen Affinität, Spezifität von konventionellen IgGs8, niedrige Immunogenität und hohe Erträge in bakteriellen Ausdruck9. Fhkw haben höhere thermische Stabilität10gegenüber den Fv Fragmente. Fhkw haben gegenüber den Fab Moieties kleinere Größen aufgrund des Fehlens von CH1 und CL. So war S-Fab, gewonnen durch die Verknüpfung der Fab mit einer Einzeldomäne Antikörper, LHKW, BsAb-Format konzipiert und studierte für seine Anti-Tumor-Effekte11,12.
In dieser Studie wurde der Bau des GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung der Fab hGC3313 mit einer Anti-CD16a LHKW14 beschrieben. Die GPC3-S-Fab kann effizient durch periplasmatischen Ausdruck in Escherichia coli (E. Coli)produziert werden. Funktionelle Studien von GPC3-S-Fab vorgeschlagen, dass GPC3-S-Fab eine vielversprechende Strategie für Leberkrebs-Therapie. So gehören die Vorteile der GPC3-S-Fab über alternative Techniken mit gültigen Verweise auf frühere Studien einfache Produktion und Reinigung und stabiler BsAbs.
Säugetier-Expressionssysteme und prokaryotischen Expressionssysteme wurden zur verschiedene Formate von BsAbs zum Ausdruck bringen. Im Gegensatz zu Säugetieren Expressionssysteme, E. Coli-basierte Protein Expressionssysteme haben viele Vorteile, einschließlich hohe Erträge, low-cost und arbeitssparend, die einfache genetische Manipulationen und hohe Umwandlung Leistungsfähigkeit15. Für die BsAbs Expression in E. Coli, gibt es zwei grundlegende Strategien: Ausdruck im Zytoplasma und Ausdruck in das Periplasma zwischen dem Zytoplasma und dem äußeren Zellmembranen15. Im Vergleich zu den reduzierenden Umgebung des Zytoplasma, ist das Periplasma ein mehr oxidierende Umgebung, die fördert die korrekte Faltung und Co Expression von Proteinen16. Korrekte Faltung spielt eine Schlüsselrolle in der Löslichkeit, Stabilität und Funktion Generation von BsAbs. Daher wurde ein Signal Sequenz PelB der N-Terminus von S-Fab Sekretion, das Periplasma von E. Coli17direkt hinzugefügt. Um sicherzustellen beschäftigt korrekte Faltung, Löslichkeit, thermische Stabilität und conformational Stabilität, reduzieren die Komplexität und die Größe eines Antikörpers ist häufig16. Das S-Fab-Format besteht aus einem Fab und einem LHKW, die im bakteriellen Systemen wahrscheinlich aufgrund der einfachen Struktur und der geringen Größe sehr gut zum Ausdruck kommt.
GPC3 wurde in diesem GPC3-S-Fab bispezifische Antikörper Format gewählt. Glypican-3 (GPC3) ist ein Mitglied der Heparin-Sulfat (HS)-Proteoglykan-Familie, die an der Zelloberfläche durch glycosylphosphatidylinositole (GPI)18verankert ist. GPC3 ist in 70 % der hepatozellulären Karzinom (HCC) Fällen, welches Konto für die Mehrheit der Leberkrebs19,20,21,22überexprimieren. Da GPC3 selten in normalen Geweben ausgedrückt wird, ist GPC3 als ein potenzielles Ziel für HCC vorgeschlagen worden. Mehrere Maus-mAbs wurden gegen GPC3 produziert. Jedoch nur GC33 stellte begrenzte Anti-Tumor-Aktivität 22und es versäumt, die klinischen Wirksamkeit bei Patienten aufweisen. In dieser Studie zeigte sich GPC3-S-Fab, NK-Zellen zu töten GPC3 Tumor Zellen14rekrutieren zu können.
NK-Zellen zu rekrutieren, wurde Anti-CD16 LHKW verwendet. CD16a ist eine geringe Affinität IgG-Rezeptor, vor allem auf einige Subtypen von T-Zellen, Monozyten und Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK) ausgedrückt. Sie engagiert sich in Antikörper-abhängige Zelle Zytotoxizität (ADCC) von NK-Zellen-23. Menschlichen NK-Zellen können unterteilt werden in zwei Typen, CD56 - CD16 + / CD56 + CD16. Im Gegensatz zu CD56 + CD16− NK-Zellen, CD56-CD16 + NK-Zellen können höhere Perforin und granzym B lösen und damit eine starke Zytotoxizität24. Kupffer Zellen (KCs), mit dem Ausdruck CD16a, sind die Bewohner Makrophagen in Leber. Kupffer Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Leberkrebs25. So kann gezielt CD16a BsAbs eine viel versprechende Strategie als Beteiligung von T-Zellen gegen Leberkrebs sein.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MAXQ 4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Zhicheng</td>
			<td>ZWYR-D2402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Cence</td>
			<td>GL-10MD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>Avanti j-26S XPI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Mini-PROTEAN&#174; Tetra</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans-blot apparatus</td>
			<td>Criterion</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>chemidoc tm XRS+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid chromatogram</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>AKTA avant</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GF column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman coulter</td>
			<td>FC500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>5702R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envision plate reader</td>
			<td>TECAN</td>
			<td>Infinite F50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti His-tag</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>14-6657-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Flag-tag</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-human(H&#38;L)-488</td>
			<td>A11013</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA-Agarose</td>
			<td>Tribioscience</td>
			<td>TBS9202-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG-CH1 affinity resin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>194320005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Plaque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK cell enrichment kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>19055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnet</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCK8 kit</td>
			<td>Dojindo</td>
			<td>CK04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11995500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C11875500CP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15050-057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard marker</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>MWGF200</td>
			<td>Gel filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>VWRC0487-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0655-100FT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Knanamycine</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0408-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0339-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptone</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0042B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>LP0021B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A100241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma base</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T6791-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>A110752-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>aladdin</td>
			<td>P112134-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A505255-0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7778-77-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>329-98-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysozyme</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L6876-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a name="RANGE!A50">Coomassie Brilliant Blue R250</a></td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0472-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromophenol blue</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A500922-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRC0332-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V900122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100mm x 20mm plastic dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25cm2 flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well cell culture cluster</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>A610498-0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHO</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>GNHa 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MHCC-97H</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>SCSP-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HepG2</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu 72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh7</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hep3B</td>
			<td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td>
			<td>TCHu106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK92</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL2408</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

Dieses Protokoll beschreibt den Bau und die funktionelle Studien ein bispezifische Antikörper (BsAb), GPC3-S-Fab. BsAbs erkennt man zwei verschiedene Epitope durch ihre zwei verschiedenen Waffen. BsAbs sind aktiv für ihre Fähigkeit, direkt rekrutieren Immunzellen zu töten Tumorzellen untersucht worden. Gegenwärtig werden die meisten BsAbs in Form von rekombinanten Proteinen, Fc-haltigen BsAbs oder als kleiner BsAb Derivate ohne die Fc-Region hergestellt. In dieser Studie wurde GPC3-S-Fab, ein Antikörper-Fragment (Fab) basierte bispezifische Antikörper, durch die Verknüpfung der Fab Anti-GPC3 Antikörper GC33 mit einem Anti-CD16 Einzeldomäne Antikörper entwickelt. GPC3-S-Fab werden in Escherichia coli ausgedrückt und durch zwei Affinität Chromatographies gereinigt. Die gereinigte GPC3-S-Fab kann speziell an binden und Krebszellen töten GPC3 positive Leber durch die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen, was auf eine mögliche Anwendung der GPC3-S-Fab in Leberkrebs-Therapie.

GPC3-S-Fab-Reinigung
GPC3-S-Fab wurde von E. Coli durch eine zweistufige Affinitätsreinigung erst mit Ni-NTA-Agarose, gefolgt von IgG-CH1 Affinitätsreinigung gereinigt. Nach dem zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt wurde GPC3-S-Fab zur Homogenität mit zwei Ketten in der Nähe von 1:1 (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von VH-CH1-CD16 LHKW und VL-CL Polypeptide kann...

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A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.

Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Aufrufe.  Sun Yat-Sen University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.

Serie: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients' tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

We describe a method for stable labeling of patient-derived xenografts (PDXs) with lentiviral particles expressing green-fluorescent protein and luciferase reporters. This method allows for tracking the growth of PDXs at the primary site, as well as detecting spontaneous and experimental metastases using in vivo imaging systems.

Die Markierung von Brustkrebs-Patienten stamm Xenografts mit Nachvollziehbare Reporter für Tumorwachstum und Metastasierung Studies

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Forschung

Krebsforschung

Potentiation of Anticancer Antibody Efficacy by Antineoplastic Drugs: Detection of Antibody-drug Synergism Using the Combination Index Equation

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy against cancer. Here we provide a protocol to identify a rational combination at the preclinical step. First, we describe a cell-based assay to assess the synergism between anticancer mAb and cytotoxic drugs, that uses the combination index equation of Chou and Talalay1. This includes the measurement of tumor cell drug- and antibody-sensitivity using an MTT assay, followed by an automated computer analysis to calculate the combination index (CI) values. CI values of &lt;1 indicate synergism between tested mAbs and cytotoxic agents1. To corroborate the in vitro findings in vivo, we further describe a method to assess the combination regimen efficacy in a xenograft tumor model. In this model, the combined regimen significantly delays tumor growth, which results in a significant extended survival in comparison to single-agent controls. Importantly, the in vivo experimentation reveals that the combination regimen is well tolerated. This protocol allows the effective evaluation of anticancer drug combinations in preclinical models and the identification of rational combination to evaluate in clinical trials.

This protocol describes how to assess synergism between an anticancer antibody and antineoplastic drugs in preclinical models by using the combination index equation of Chou and Talalay.

Potenzierung der Anti-Krebs-Antikörper-Wirksamkeit von Zytostatika: Nachweis von Antikörper-Wirkstoff-Synergismus mit der Kombination-Index-Gleichung

Potentiation of hostile monoclonal antibodies (mAb) by chemotherapeutic agents constitutes a valuable strategy for designing effective and safer therapy ...

In Vivo Immunofluorescence Localization for Assessment of Therapeutic and Diagnostic Antibody Biodistribution in Cancer Research

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in tumorigenesis, can be directed to cancer biomarkers enabling tumor detection and characterization, and can be used for cancer therapy as mAbs or antibody-drug conjugates to activate immune effector cells, to inhibit signaling pathways, or directly kill cells carrying the specific antigen. Despite clinical advancements in the development and production of novel and highly specific mAbs, diagnostic and therapeutic applications can be impaired by the complexity and heterogeneity of the tumor microenvironment. Thus, for the development of efficient antibody-based therapies and diagnostics, it is crucial to assess the biodistribution and interaction of the antibody-based conjugate with the living tumor microenvironment. Here, we describe In Vivo Immunofluorescence Localization (IVIL) as a new approach to study interactions of antibody-based therapeutics and diagnostics in the in vivo physiological and pathological conditions. In this technique, a therapeutic or diagnostic antigen-specific antibody is intravenously injected in&#160;vivo and localized ex vivo with a secondary antibody in isolated tumors. IVIL, therefore, reflects the in vivo biodistribution of antibody-based drugs and targeting agents. Two IVIL applications are described assessing the biodistribution and accessibility of antibody-based contrast agents for molecular imaging of breast cancer. This protocol will allow future users to adapt the IVIL method for their own antibody-based research applications.

The in vivo immunofluorescence localization (IVIL) method can be used to examine in vivo biodistribution of antibodies and antibody conjugates for oncological purposes in living organisms using a combination of in vivo tumor targeting and ex vivo immunostaining methods.

In Vivo Immunfluoreszenzlokalisation zur Bewertung der therapeutischen und diagnostischen Antikörperbiodistribution in der Krebsforschung

Monoclonal antibodies (mAbs) are important tools in cancer detection, diagnosis, and treatment. They are used to unravel the role of proteins in ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

An Automated Differential Nuclear Staining Assay for Accurate Determination of Mitocan Cytotoxicity

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes more complex, the goal of targeting mitochondria using various compounds that inflict mitochondrial damage (so-called mitocans) is becoming quite popular. Unfortunately, many existing cytotoxicity assays, such as those based on tetrazolium salts or resazurin require functional mitochondrial enzymes for their performance. The damage inflicted by compounds that target mitochondria often compromises the accuracy of these assays. Here, we describe a modified protocol based on differential staining with two fluorescent dyes, one of which is cell-permeant (Hoechst 33342) and the other of which is not (propidium iodide). The difference in staining allows living and dead cells to be discriminated. The assay is amenable to automated microscopy and image analysis, which increases throughput and reduces bias. This also allows the assay to be used in high-throughput fashion using 96-well plates, making it a viable option for drug discovery efforts, particularly when the drugs in question have some level of mitotoxicity. Importantly, results obtained by Hoechst/PI staining assay show increased consistency, both with trypan blue exclusion results and between biological replicates when the assay is compared to other methods.

The protocol describes a rapid, high-throughput, reliable, inexpensive, and unbiased assay for efficiently determining cellular viability. This assay is particularly useful when cells&#39; mitochondria have been damaged, which interferes with other assays. The assay uses automated counting of cells stained with two nuclear dyes &#8211; Hoechst 33342 and propidium iodide.

Ein automatisierter Differential-Nuklearfärbungstest zur genauen Bestimmung der Mitocan-Zytotoxizität

The contribution of mitochondria to oncogenic transformation is a subject of wide interest and active study. As the field of cancer metabolism becomes ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Überwachung der Krebszellinvasion und T-Zell-Zytotoxizität in der 3D-Kultur

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach in&#160;vaccine design. Antigen is delivered to DC via antibodies specific for endocytosis receptors such as DEC-205 that induce uptake, processing, and MHC class I- and II-presentation.
Efficient and reliable conjugation of the desired antigen to a suitable antibody is a critical step in DC targeting and among other factors depends on the format of the antigen. Chemical conjugation of&#160;full-length protein to purified antibodies is one possible strategy. In the past, we have successfully established cross-linking of the model antigen ovalbumin (OVA) and a DEC-205-specific IgG2a antibody (&#945;DEC-205)&#160;for in vivo DC targeting studies in mice. The first step of the protocol is the purification of the antibody from the supernatant of the NLDC (non-lymphoid dendritic cells)-145 hybridoma by affinity chromatography. The purified antibody is activated for chemical conjugation by sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) while at the same time the sulfhydryl-groups of the OVA protein are exposed through incubation with TCEP-HCl (tris (2-carboxyethyl) phosphine hydrochloride). Excess TCEP-HCl and sulfo-SMCC are removed and the antigen is mixed with the activated antibody for overnight coupling. The resulting &#945;DEC-205/OVA conjugate is concentrated and freed from unbound OVA. Successful conjugation of OVA to &#945;DEC-205 is verified by western blot analysis and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
We have successfully used chemically crosslinked &#945;DEC-205/OVA to induce cytotoxic T cell responses in the liver and to compare different adjuvants for their potential in inducing humoral and cellular immunity following in vivo targeting of DEC-205+ DC. Beyond that, such chemically coupled antibody/antigen conjugates offer valuable tools for the efficient induction of vaccine responses to tumor antigens and have been proven to be superior to classical immunization approaches regarding the prevention and therapy of various types of tumors.

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

We describe a protocol for the chemical conjugation of the model antigen ovalbumin to an endocytosis receptor-specific antibody for in vivo dendritic cell targeting. The protocol includes purification of the antibody, chemical conjugation of the antigen, as well as purification of the conjugate and the verification of efficient conjugation.

Chemische Konjugation eines gereinigten DEC-205-gerichteten Antikörpers mit Protein in voller Länge für das Targeting von dendritischen Zellen der Maus in vitro und in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an autoinjector apparatus, trained operators can achieve more efficient and consistent transplantation results compared to those obtained using a manual injector. Here, we cover topics in a chronological fashion: from the crossing of Drosophila lines, to the induction and dissection of the primary tumor, transplantation of the primary tumor into a new adult host and continued generational transplantation of the tumor for extended studies. As a demonstration, here we use Notch intracellular domain (NICD) overexpression induced salivary gland imaginal ring tumors for generational transplantation. These tumors can first be reliably induced in a transition-zone microenvironment within larval salivary gland imaginal rings, then allografted and cultured in vivo to study continued tumor growth, evolution, and metastasis. This allotransplantation method can be useful in potential drug screening programs, as well as for studying tumor-host interactions.

Tumor Allotransplantation in Drosophila melanogaster with a Programmable Auto-Nanoliter Injector

This protocol provides detailed guidance for the initial and continued generational allotransplantation of Drosophila tumors into the abdomen of adult hosts for studying various aspects of neoplasia. Using an autoinjector apparatus, researchers can achieve improved efficiency and tumor yields compared to those achieved by traditional, manual methods.

Tumorallotransplantation in Drosophila melanogaster mit einem programmierbaren Auto-Nanoliter-Injektor

This protocol describes the allotransplantation of tumors in Drosophila melanogaster using an auto-nanoliter injection apparatus. With the use of an ...

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection (DP-CAR) for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), relying on collateral flow to the liver through the gastroduodenal artery (GDA). In the current manuscript, the technical conduct of robotic DP-CAR is outlined. The greater curve of the stomach is mobilized with care to avoid sacrificing the gastroepiploic vessels. The stomach and liver are retracted cephalad to facilitate dissection of the porta hepatis. The hepatic artery (HA) is dissected and encircled with a vessel loop. The gastroduodenal artery (GDA) is carefully preserved. The common HA is clamped and triphasic flow in the proper HA via the GDA is confirmed using intra-operative ultrasound. A retropancreatic tunnel is made over the superior mesenteric vein (SMV). The pancreas is divided with an endovascular stapler at the neck. The inferior mesenteric vein (IMV) and splenic vein are ligated. The HA is stapled proximal to the GDA. The entire specimen is retracted laterally with further dissection cephalad to expose the superior mesenteric artery (SMA). The SMA is then traced back to the aorta. The dissection continues cephalad along the aorta with the bipolar energy device used to divide the crural fibers and celiac nerve plexus. The specimen is mobilized from the patient's right to left until the origin of the celiac axis is identified and oriented towards the left. The trunk is circumferentially dissected and stapled. Additional dissection with hook cautery and the bipolar energy device fully mobilizes the pancreatic tail and spleen. The specimen is removed from the left lower quadrant extraction site and one drain is left in the resection bed. A final intra-operative ultrasound of the proper HA confirms pulsatile, triphasic flow in the artery and liver parenchyma. The stomach is inspected for evidence of ischemia. Robotic DP-CAR is safe, feasible and when used in conjunction with multi-modality therapy, offers potential for long-term survival in selected patients.

Robot Assisted Distal Pancreatectomy with Celiac Axis Resection DP-CAR for Pancreatic Cancer: Surgical Planning and Technique

We present our operative approach to robot assisted distal pancreatectomy, splenectomy, and celiac axis resection (DP-CAR), demonstrating that the procedure is safe and feasible with proper planning, patient selection, and surgeon experience.

Robotergestützte distale Pankreatektomie mit Zöliakie-Achsenresektion (DP-CAR) bei Bauchspeicheldrüsenkrebs: Operationsplanung und -technik

Malignant pancreatic tumors involving the celiac artery can be resected with a distal pancreatectomy, splenectomy and celiac axis resection (DP-CAR), ...