Name: a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity
Uploaded: 2018-07-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der R & D Planen der Provinz Guangdong (VR China) (2016A050503028) finanziell unterstützt.

Aller Verfahren, einschließlich menschliche Blutentnahme wurden von Sun Yat-Sen Universität Ethik-Kommission genehmigt.
1. GPC3-S-Fab Design-Strategie
<ol><li>Entwerfen Sie GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung einer Fab Anti-GPC3 (vermenschlichten GC3313) mit einer Anti-CD16 LHKW14 (Abbildung 1).</li>
	<li>Synthetisieren Sie und Klonen Sie die VH-CH1-CD16-LHKW und VL-CL in der pET26b und pET21a Vektoren wie bereits berichtet12.</li>
</ol>2. Transformation und Kultur
<ol><li>Addieren Sie 100 ng von pET26b mit VH-CH1-CD16 (Abbildung 1A) und 100 ng von pET21a mit VL-CL (Abbildung 1A) in 100 µL kompetente BL21 (DE3) Zellen. Mischen Sie gut und inkubieren Sie für 30 min. inkubieren im Wasserbad 42 ° C für 45-90 s, Transfer, auf Eis und inkubieren Sie für ca. 3-5 min auf Eis.</li>
	<li>Fügen Sie 500 µL Lysogeny Brühe (LB) Medium in ein Röhrchen mit BL21 (DE3) Zellen und dann Inkubation bei 37 ° C, 150 u/min für 45-60 min. verteilt 100 µL BL21 (DE3) Zellen auf LB-Agar-Platten mit 50 µg/mL von Kanamycin und 100 µg/mL von Ampicillin , und dann Inkubation bei 37 ° C für 12-16 Uhr.<ol>
<li>Lysogeny Brühe (LB) Medium vorbereiten: 1 % wt/Vol Tryptone, 0,5 % wt/Vol Hefeextrakt, 1 % wt/Vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zellen aus einer einzigen Kolonie in 5 mL super Brühe (SB) Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillinund Kultur bei 37 ° C, 220 u/min, über Nacht zu impfen. Dann impfen Sie 1 mL der Kultur in 100 mL SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min für 4 h-haltigem Medium. Übertragen Sie anschließend 10 mL der Kultur in 1 L des SB 50 µg/mL Kanamycin und 100 µg/mL Ampicillin und Kultur bei 37 ° C, 220 u/min-haltigem Medium.<ol>
<li>Bereiten Sie super Brühe Medium: 3,2 % wt/Vol Tryptone, 2 % wt/Vol Hefeextrakt, 0,5 % wt/Vol NaCl.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erreicht die OD600 0,6 - fügen 0,8, Sie Isopropyl-b-D-Thio-Galactopyranoside (IPTG), eine Endkonzentration von 0,2 mM. Kultur bei 16 ° C, 180 u/min für 36-48 h für periplasmatischen Ausdruck.</li>
</ol>3. GPC3-S-Fab periplasmatischen Reinigung
<ol><li>Periplasmatischen Bruchteil Vorbereitung<ol>
<li>Sammeln Sie Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 x g, 4 ° C für 30 min zu, entsorgen Sie das Medium und Wägezellen Sie die.</li>
		<li>Aufschwemmen Sie die Zellen gründlich in 4 mL eiskaltes Saccharoselösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 25 % (wt/Vol) Saccharose und 1 mM EDTA) pro Gramm der Zellen und inkubieren Sie für 15 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit festen Winkeln), 4 ° C für 20 min. Überstands (Saccharose-Bruch) zu entfernen und speichern Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Die Pellets in einem Mix aus eiskalten 5 mM MgCl2 und 1 mM PMSF (4 mL pro Gramm Zellen) aufzuwirbeln. Hinzufügen von 40 µL Lysozym-Lager (15 mg/mL) pro Gramm, und inkubieren Sie für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren bei 8.500 x g (Tischplatte Zentrifuge, Rotor mit Winkeln fixiert), 4 ° C für 20 min. Transfer der Überstand (periplasmatischen Bruch) und speichern Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Kombinieren Sie die Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil und Zentrifugieren bei 30.000 x g, 4 ° C für 30 min. Überstands entfernen und speichern Sie es in einem 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NI-NTA-Affinitätsreinigung<ol>
<li>1 mL der Ni-NTA Agarose durch gründlich mischen, um eine homogene Suspension zu erreichen, 1 mL Ni-NTA Agarose, einem frischen 15 mL konische Rohr zu entfernen und Hinzufügen von 10 Spalte Volumen (CV) Gleichgewichtherstellung Puffer Aufschwemmen (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl) zu equilibrate.</li>
		<li>400 X g für 5 min zentrifugieren und den überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie die Ni-NTA-Agarose in der 50 mL-Tube mit Saccharose Bruchteil und periplasmatischen Bruchteil. Felsen bei 4 ° C für 2 h.</li>
		<li>Die Mischung bei 400 X g zentrifugieren, 4 ° C für 5 min. entfernen Sie vorsichtig den überstand auf eine andere frische eiskalte Röhre als ungebundene Bruch. Übertragen Sie die Ni-NTA-Agarose in eine Schwerkraft-Spalte.</li>
		<li>Fügen Sie 10 CV von Waschpuffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 20 mM, 30 mM oder 40 mM imidazol) auf die Spalte, und sammeln die Elute waschen Bruch. Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden.</li>
		<li>Fügen Sie 3 CV der Elution buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 300 mM NaCl; 100 mM, 200 mM, 300 mM oder 400 mM imidazol) in die Spalte und sammeln die Elute Elution Bruch 1, 2, 3 und 4. Anmerkung: Diese Lösungen sollten in der Reihenfolge der steigenden Konzentrationen von Imidazol hinzugefügt werden.</li>
		<li>Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4) mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h überprüfen das Vorhandensein von GPC3-S-Fab um 12 % SDS-PAGE und dann durch Coomassie blaue Färbung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>IgG-CH1 Affinitätsreinigung<ol>
<li>Überführen Sie 1 mL der IgG-CH1 Affinität Harz in ein 50 mL konische Röhrchen, und waschen Sie zuerst die Perlen mit PBS. Fügen Sie dann die dialysierten Lösung mit GPC3-S-Fab nach Schritt 3.2.6. Felsen bei 4 ° C für 2 h.</li>
		<li>Zentrifuge bei 400 X g für 5 min, 4 ° C. Sorgfältig entfernen des Überstands auf eine andere frische eiskalte Röhre und das Harz auf eine Schwerkraft-Spalte zu übertragen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 CV des Waschens Puffer (PBS) in die Spalte, und sammeln Sie die Elution der Wash-Bruch.</li>
		<li>Bereiten Sie die Röhrchen durch Zugabe von 1 M Tris pH 9.0 (0,1 mL pro mL der einzelnen eluierten Fraktionen). Eluieren mit 3 CV Elution Buffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,7), und sammeln den eluierten Bruch; Wiederholen Sie 3 Mal.</li>
		<li>Dialyse eluierten Brüche in 2 L des PBS mit Dialyse Schläuche (12,4 kDa) bei 4 ° C für 2 h zweimal wiederholen.</li>
		<li>Konzentration des Proteins durch Ultramicrospectrophotometer bestimmen (molare Aussterben Koeffizient: 91105. 1 A280 = 0,69 mg/L).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse
<ol><li>5 x SDS laden Puffer 10 µL der Probe berücksichtigen und gut mischen. Kochen Sie die Proteinmischung bei 100 ° C für 5 min.<ol>
<li>5 x SDS laden Puffer vorzubereiten: 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % wt/Vol SDS, 0,5 % wt/Vol Bromophenol Blue, 50 % Vol/Vol Glycerin, 5 % Vol/Vol Beta-Mercaptoethanol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie eine SDS-PAGE-Gel mit einem Laden Gel (5 %) und Trennung Gel (12 %) als zuvor beschriebenen26,27,28.</li>
	<li>Laden Sie 10 µL des gekochten Proteinmischung und Protein-Marker, und führen Sie die SDS-PAGE.</li>
	<li>Färben Sie das Gel durch Schütteln für 20 min mit Coomassie brilliant blau Lösung, und führen Sie dann entfärben.</li>
	<li>Für das westliche Beflecken, nach der Übertragung auf PVDF Membran, blockieren die Membran mit TBST (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 % Vol/Vol Tween 20) + 5 % wt/Vol Magermilch für 1 h bei Raumtemperatur unter schütteln.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran mit primären Antikörper (Anti-His oder Anti-Flag) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.</li>
	<li>Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Membran in Sekundärantikörper (HRP-linked Anti-Maus Fc Antikörper) verdünnt 1:2,000 in TBST + 5 % Magermilch für 1 h.</li>
	<li>Waschen mit TBST für 5 min bei Raumtemperatur, und 3 Mal wiederholen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL der HPR Substrat pro Film, entwickeln Sie und nehmen Sie Bilder.</li>
</ol>5. Gelanalyse Filtration
<ol><li>Verwenden Sie die folgende Spalte: Spalte Volumen von 24 mL; Gleichgewichtherstellung Puffer von PBS pH 7.4; Durchfluss von 0,5 mL/min bei gemäßigten Zimmer; Probenvolumen von 200 µL.</li>
	<li>Verwenden Sie die folgenden Protein Volumen und Konzentration: 500 µL 1,2 mg/mL GPC3-S-Fab. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.</li>
	<li>Nehmen Sie für die Protein-Marker-Volumen und Konzentration 100 µL Cytochrom C (2 mg/mL, 12,4 kDa), 140 µL Anhydrase (3 mg/mL, 29 kDa), Albumin (10 mg/mL, 66 kDa) 140 µL und 200 µL des Alkohol-Dehydrogenase (5 mg/mL, 150 kDa) in einem Rohr. Bei 20.000 x g für 30 min zentrifugieren und 200 µL laden zu nehmen.</li>
	<li>Waschen Sie vor jeder Fahrt mit mindestens 2 CV von destilliertem Wasser bei einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.</li>
	<li>Equilibrate die Spalte mit mindestens 2 CV Gleichgewichtherstellung Puffer (PBS, pH 7.4) mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min.</li>
	<li>Injizieren Sie automatisch Probe bei 0,5 mL/min auf die Probe zu laden.</li>
	<li>Eluieren mit Gleichgewichtherstellung Puffer mit 0,5 mL/min und bei 280 und 215 nm zu erkennen.</li>
</ol>(6) Flow Cytometry Analysis
<ol><li>Kultur der HepG2 (GPC3 positiv), Hep3B (GPC3 positiv), Huh7 (GPC3 positiv), und MHCC - 97H (GPC3 negativ) Zellen in Plastikschalen 100 x 20 mm mit DMEM Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C 5 % CO2.</li>
	<li>Kultur CHO (GPC3 negativ) und CHO/GPC3 Zellen beherbergen die in voller Länge menschlichen GPC3 cDNA (GPC3 positiv) in 100 mm x 20 mm Plastikschalen mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Kultur der NK92/CD16 beherbergen die in voller Länge menschlichen CD16 cDNA (CD16 positiv) in 25cm2 Kolben mit RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS, Penicillin (100 µg/mL) und Streptomycin (50 µg/mL) bei 37 ° C, 5 % CO2.</li>
	<li>Wenn die Zellen sind 70-90 % konfluierende, verwerfen das Medium und die Zellen mit 2 mL PBS waschen. Fügen Sie 1 mL von 0,25 % Trypsin und Inkubation bei 37 ° C für ca. 2-3 min (oder bis die Zellen beginnen sich zu lösen von der Oberfläche). Fügen Sie 1 mL des Mediums komplette Wachstum zu neutralisieren die Trypsin und erneut aussetzen der Zellen durch sanft auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Neubauer Hemocytometer und erkennen Sie die Zellviabilität Trypan blau zu.</li>
	<li>3 x 106 Zellen für jede Zelllinie zu sammeln. Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen. Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. zweimal wiederholen.</li>
	<li>Fügen Sie 0,3 mL PBS + 0,2 % BSA, die Zellen wieder auszusetzen, und übertragen Sie 100 µL (ca. 1 Million) auf jedes 5 mL Polystyrol Rundboden Röhrchen. Hinweis: Bitte stellen Sie sicher, dass alle Schritte von hier aus an den Rohren auf Eis kühl gelagert werden sollte. Wenn der Antikörper auf der Zelle Oberfläche Antigen gebunden ist, beginnt die Anlage zu verinnerlichen. Dadurch, dass es kalt, ist der Prozess deutlich verlangsamt.</li>
	<li>Jedes Rohr 10 µL Primärantikörper (GPC3-S-Fab oder menschlichen IgG1, Endkonzentration 5 µg/mL) hinzu, und auf Eis für 1 h inkubieren.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Neu in 100 µL PBS + 0,2 % BSA, auszusetzen und dann fügen Sie 0,5 µL sekundäre Antikörper (Anti-Human IgG(H+L)-488, endgültige Konzentration 10 µg/mL) und Inkubation für 1 h Hinweis auf Eis: von diesem Schritt bitte halten Sie die Zellen aus dem Licht.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL PBS + 0,2 % BSA zu waschen, und Zentrifuge bei 200 X g, 4 ° C für 5 min. Wiederholen Sie dreimal.</li>
	<li>Analysieren Sie die Zellen, indem Sie Durchflusszytometer nach Standardprotokoll29. Zellen mit einem 488 nm Laser Erregung zu erwerben.</li>
</ol>(7) zytotoxischen Assays
<ol><li>Bereiten Sie Tumorzellen.<ol>
<li>Kultur HepG2, Hep3B, Huh7, MHCC - 97H und CHO Zellinien wie 6.1-6.5 beschrieben.</li>
		<li>Verdünnen Sie Zellen 0,5 × 105/mL und Platte 100 µL Zellen (5.000 pro Well) auf 96-Well Platten. Kultur 6-8 h um die Zellen zu befestigen können.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) vorzubereiten.<ol>
<li>Verdünnen Sie frisches zubereitetes Blut mit ein gleiches Volumen an PBS in einer 50 mL konische Röhre. Z. B. verdünnen Sie 10 mL Blut mit 10 mL PBS.</li>
		<li>Eine frische 50 mL konische Rohr berücksichtigen Sie 15 mL Lymphozyten Trennmedium. Übertragen Sie das verdünnte Blut auf die Lymphozyten Trennmedium entlang der Schlauchseite langsam. Hinweis: Halten Sie das Rohr senkrecht. Brechen Sie die Oberfläche des Mediums Lymphozyten Trennung nicht.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 400 X g für 35 min bei Raumtemperatur mit der Bremse aus.</li>
		<li>Langsam entfernen Sie der oberen Plasmaschicht, und die weißen Blutkörperchen-Layer mit PBMCs an der Plasma-Lymphozyten Trennung mittlere Schnittstelle.</li>
		<li>Verdünnen Sie die PBMCs mit einem doppelten Volumen von PBS + 2 % FBS. 400 X g für 5 min zentrifugieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS + 2 % FBS. Zentrifuge bei 400 X g für 5 min. zählen die Zellzahlen wie in Schritt 6.5 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>NK-Zellen vorbereiten.<ol>
<li>Bereiten Sie die PBMCs Suspension in einer Konzentration von 5 x 107 Zellen/mL in PBS + 2 % FBS und Stelle Sie in eine 5 mL Polystyrol Rundboden-Tube.</li>
		<li>Fügen Sie menschliche NK Zelle Bereicherung Cocktail 50 µL/ml von Zellen. Gut verrühren und bei Raumtemperatur für 10 min inkubieren.</li>
		<li>Die Magnetpartikel von NK Zelle Enrichment Kit, und gut mischen, um sicherzustellen, dass sie gleichmäßig durch pipettieren ausgesetzt sind oben und unten kräftig mehr als 5mal aufzuwirbeln. Übertragen Sie die resuspendierte Magnetpartikel 100 µL/ml auf die Zellsuspension. Gut mischen und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Bringen Sie die Zellsuspension bis zu einem Gesamtvolumen von 2,5 mL durch Zugabe von PBS + 2 % FBS. Mischen Sie die Zellen in der Röhre durch pipettieren sanft nach oben und unten 2 - 3 Mal. Platzieren Sie das Rohr (ohne Deckel) in den Magneten. Lassen Sie die magnetische Beads niederlassen für 2,5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entfernen Sie den Magneten. Invertieren Sie in einer kontinuierlichen Bewegung das Rohr, gießt die angereicherten Zellsuspension in einen neuen Schlauch.</li>
		<li>Zählen Sie die Zelle Zahlen wie im Schritt 6.5 beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Richten Sie die zytotoxische Reaktion.<ol>
<li>Verdünnen Sie die NK-Zellen, 5 × 105 Zellen/mL mit dem entsprechenden Kulturmedium. Die Tumorzellen auf einer 96-Well-Platte vergoldet fügen Sie 100 µL Zellsuspension NK hinzu.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL GPC3-S-Fab in verschiedenen Konzentrationen mit der höchsten Dosis an eine Endkonzentration von 30 µg/mL, 3-fold Verdünnung, 9-Punkt (3 Wiederholungen).</li>
		<li>Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2 72 h.</li>
		<li>Entfernen Sie nach 72 h Inkubationszeit das Medium 100 µL 10 µL CCK8 Reagenz in jede Vertiefung in 96-Well Platten-haltigem DMEM Medium hinzufügen und dann bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Lesen Sie die Platte bei 450 nm bei 1, 2, 3 und 4 h nach dem Hinzufügen des CCK8 Reagens.</li>
		<li>Die Daten zu analysieren. Berechnen Sie die Überlebensrate als (OD450 GPC3-S-Fab + Effektor + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 % und (OD450 GPC3-S-Fab + Tumor - OD450 Medium) / (OD450 Tumor - OD450 Medium) × 100 %. Die Effektorzellen sind NK-Zellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

In dieser Studie präsentieren wir eine Strategie, um ein neues Format von BsAbs, konstruieren GPC3-S-Fab, die NK-Zellen GPC3 positive Tumorzellen gezielt rekrutieren kann. Die S-Fab basiert auf der natürlichen Fab Format durch das Hinzufügen einer Anti-CD16 LHKW11,12. Im Vergleich mit der BsAbs enthaltenden Fc Region, kann GPC3-S-Fab leicht in das Periplasma von Bakterien in großem Maßstab hergestellt werden.
Mit der im Protokoll ...

Monoklonale Antikörper dienen heute im großen und ganzen für Krebs Behandlung1. Aufgrund der Flexibilität der Antikörper wurden verschiedene Antikörper-basierte Formate aktiv untersucht. Im Vergleich mit monoklonalen Antikörpern, haben BsAbs zwei verschiedene Antigen Bindung Module, damit sie erkennen, dass zwei verschiedene Ziele gleichzeitig und effizient lösen die Rekrutierung von immun-Effektorzellen und Tumor Zellen2töten.
Aktuelle rekombinante BsAb Formate können in der Regel zwei Klassen zugeordnet werden: Fc-haltigen BsAbs und BsAbs ohne eine Fc-Region. Verglichen mit Fc-haltigen Formate, die meist in Säugerzellen hergestellt werden, BsAbs ohne eine Fc-Region haben die Vorteile der kleineren Größen sind leichter im Mikroorganismus Expressionssysteme produziert, und dringen Tumorgewebe effizienter 3.
BsAbs ohne eine Fc-Region entstehen häufig durch die Verknüpfung von einzelnen verbindlichen Moieties, wie Single-Chain Variable Fragmente (ScFvs) oder Fabs3. Ohne die stabilisierenden Domänen kompromittiert BsAbs basierend auf ScFv-Fragmenten oft thermische Stabilität, geringe Löslichkeit oder ein erhöhtes Potenzial für Aggregation4,5. Im Gegensatz dazu sind Fab-basierte BsAbs stabiler aufgrund der Heterodimerization der CH1 und CL in der nativen Fab Glyko-4,6.
Variable Domäne aus Heavy-Kette-nur Antikörper (Fhkw, auch als Einzeldomäne Antikörper bezeichnet) sind die aktiven Antigen-bindenen Fragment der natürliche schwere Kette Antikörper7. Fhkw haben die Eigenschaften der hohen Affinität, Spezifität von konventionellen IgGs8, niedrige Immunogenität und hohe Erträge in bakteriellen Ausdruck9. Fhkw haben höhere thermische Stabilität10gegenüber den Fv Fragmente. Fhkw haben gegenüber den Fab Moieties kleinere Größen aufgrund des Fehlens von CH1 und CL. So war S-Fab, gewonnen durch die Verknüpfung der Fab mit einer Einzeldomäne Antikörper, LHKW, BsAb-Format konzipiert und studierte für seine Anti-Tumor-Effekte11,12.
In dieser Studie wurde der Bau des GPC3-S-Fab durch die Verknüpfung der Fab hGC3313 mit einer Anti-CD16a LHKW14 beschrieben. Die GPC3-S-Fab kann effizient durch periplasmatischen Ausdruck in Escherichia coli (E. Coli)produziert werden. Funktionelle Studien von GPC3-S-Fab vorgeschlagen, dass GPC3-S-Fab eine vielversprechende Strategie für Leberkrebs-Therapie. So gehören die Vorteile der GPC3-S-Fab über alternative Techniken mit gültigen Verweise auf frühere Studien einfache Produktion und Reinigung und stabiler BsAbs.
Säugetier-Expressionssysteme und prokaryotischen Expressionssysteme wurden zur verschiedene Formate von BsAbs zum Ausdruck bringen. Im Gegensatz zu Säugetieren Expressionssysteme, E. Coli-basierte Protein Expressionssysteme haben viele Vorteile, einschließlich hohe Erträge, low-cost und arbeitssparend, die einfache genetische Manipulationen und hohe Umwandlung Leistungsfähigkeit15. Für die BsAbs Expression in E. Coli, gibt es zwei grundlegende Strategien: Ausdruck im Zytoplasma und Ausdruck in das Periplasma zwischen dem Zytoplasma und dem äußeren Zellmembranen15. Im Vergleich zu den reduzierenden Umgebung des Zytoplasma, ist das Periplasma ein mehr oxidierende Umgebung, die fördert die korrekte Faltung und Co Expression von Proteinen16. Korrekte Faltung spielt eine Schlüsselrolle in der Löslichkeit, Stabilität und Funktion Generation von BsAbs. Daher wurde ein Signal Sequenz PelB der N-Terminus von S-Fab Sekretion, das Periplasma von E. Coli17direkt hinzugefügt. Um sicherzustellen beschäftigt korrekte Faltung, Löslichkeit, thermische Stabilität und conformational Stabilität, reduzieren die Komplexität und die Größe eines Antikörpers ist häufig16. Das S-Fab-Format besteht aus einem Fab und einem LHKW, die im bakteriellen Systemen wahrscheinlich aufgrund der einfachen Struktur und der geringen Größe sehr gut zum Ausdruck kommt.
GPC3 wurde in diesem GPC3-S-Fab bispezifische Antikörper Format gewählt. Glypican-3 (GPC3) ist ein Mitglied der Heparin-Sulfat (HS)-Proteoglykan-Familie, die an der Zelloberfläche durch glycosylphosphatidylinositole (GPI)18verankert ist. GPC3 ist in 70 % der hepatozellulären Karzinom (HCC) Fällen, welches Konto für die Mehrheit der Leberkrebs19,20,21,22überexprimieren. Da GPC3 selten in normalen Geweben ausgedrückt wird, ist GPC3 als ein potenzielles Ziel für HCC vorgeschlagen worden. Mehrere Maus-mAbs wurden gegen GPC3 produziert. Jedoch nur GC33 stellte begrenzte Anti-Tumor-Aktivität 22und es versäumt, die klinischen Wirksamkeit bei Patienten aufweisen. In dieser Studie zeigte sich GPC3-S-Fab, NK-Zellen zu töten GPC3 Tumor Zellen14rekrutieren zu können.
NK-Zellen zu rekrutieren, wurde Anti-CD16 LHKW verwendet. CD16a ist eine geringe Affinität IgG-Rezeptor, vor allem auf einige Subtypen von T-Zellen, Monozyten und Makrophagen, natürliche Killerzellen (NK) ausgedrückt. Sie engagiert sich in Antikörper-abhängige Zelle Zytotoxizität (ADCC) von NK-Zellen-23. Menschlichen NK-Zellen können unterteilt werden in zwei Typen, CD56 - CD16 + / CD56 + CD16. Im Gegensatz zu CD56 + CD16− NK-Zellen, CD56-CD16 + NK-Zellen können höhere Perforin und granzym B lösen und damit eine starke Zytotoxizität24. Kupffer Zellen (KCs), mit dem Ausdruck CD16a, sind die Bewohner Makrophagen in Leber. Kupffer Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung von Leberkrebs25. So kann gezielt CD16a BsAbs eine viel versprechende Strategie als Beteiligung von T-Zellen gegen Leberkrebs sein.

<table><tbody><tr><td>Shaking incubator</td><td>Thermo Fisher</td><td>MAXQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Zhicheng</td><td>ZWYR-D2402</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Cence</td><td>GL-10MD</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman coulter</td><td>Avanti j-26S XPI</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Ultraviolet spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher</td><td>Nanodrop</td><td></td></tr><tr><td>Analytical polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td><td>Mini-PROTEAN&amp;reg; Tetra</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Trans-blot apparatus</td><td>Criterion</td><td>Bio-rad</td><td></td></tr><tr><td>Imaging system</td><td>Bio-rad</td><td>chemidoc tm XRS+</td><td></td></tr><tr><td>Fast Protein Liquid chromatogram</td><td>GE Healthcare</td><td>AKTA avant</td><td></td></tr><tr><td>GF column</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9909-44 Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Flow Cytometer</td><td>Beckman coulter</td><td>FC500</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5702R</td><td></td></tr><tr><td>Envision plate reader</td><td>TECAN</td><td>Infinite F50</td><td></td></tr><tr><td>Anti His-tag</td><td>eBioscience</td><td>14-6657-82</td><td></td></tr><tr><td>anti-Flag-tag</td><td>Sigma</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>anti-human(H&amp;amp;L)-488</td><td>A11013</td><td>Invitrogen</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP-linked antibody</td><td>Cell Signaling</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Agarose</td><td>Tribioscience</td><td>TBS9202-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG-CH1 affinity resin</td><td>Thermo Fisher</td><td>194320005</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>NK cell enrichment kit</td><td>Stemcell</td><td>19055</td><td></td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Stemcell</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>CCK8 kit</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500CP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>C11875500CP</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15050-057</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>Standard marker</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Gel filtration</td></tr><tr><td>Isopropyl-b-D-thio-galactopyranoside (IPTG)</td><td>VWR chemicals</td><td>VWRC0487-100G</td><td></td></tr><tr><td>Dialysis tubing</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0655-100FT</td><td></td></tr><tr><td>Knanamycine</td><td>VWR</td><td>VWRC0408-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>VWR</td><td>VWRC0339-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Thermo Fisher</td><td>LP0021B</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100241</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6791-1KG</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900106</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>aladdin</td><td>A110752-500g</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>aladdin</td><td>P112134-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900020</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sangon Biotech</td><td>A505255-0250</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate, Monobasic Anhydrous (KH2PO4)</td><td>VWR</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate, Dibasic, Anhydrous (Na2HPO4)</td><td>VWR</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>VWR</td><td>60-24-2</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride (PMSF)</td><td>VWR</td><td>329-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L6876-25G</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R250</td><td>VWR</td><td>VWRC0472-50G</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500922-25G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>VWR</td><td>VWRC0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V900122</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 20mm plastic dish</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 flask</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>96 well cell culture cluster</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610498-0005</td><td></td></tr><tr><td>CHO</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>GNHa 3</td><td></td></tr><tr><td>MHCC-97H</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>SCSP-528</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu 72</td><td></td></tr><tr><td>Huh7</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu182</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B</td><td>the Type Culture Collection of the Chinese Academy of Sciences</td><td>TCHu106</td><td></td></tr><tr><td>NK92</td><td>ATCC</td><td>CRL2408</td><td></td></tr></tbody></table>

a gpc3-targeting bispecific antibody, gpc3-s-fab, with potent cytotoxicity

Dieses Protokoll beschreibt den Bau und die funktionelle Studien ein bispezifische Antikörper (BsAb), GPC3-S-Fab. BsAbs erkennt man zwei verschiedene Epitope durch ihre zwei verschiedenen Waffen. BsAbs sind aktiv für ihre Fähigkeit, direkt rekrutieren Immunzellen zu töten Tumorzellen untersucht worden. Gegenwärtig werden die meisten BsAbs in Form von rekombinanten Proteinen, Fc-haltigen BsAbs oder als kleiner BsAb Derivate ohne die Fc-Region hergestellt. In dieser Studie wurde GPC3-S-Fab, ein Antikörper-Fragment (Fab) basierte bispezifische Antikörper, durch die Verknüpfung der Fab Anti-GPC3 Antikörper GC33 mit einem Anti-CD16 Einzeldomäne Antikörper entwickelt. GPC3-S-Fab werden in Escherichia coli ausgedrückt und durch zwei Affinität Chromatographies gereinigt. Die gereinigte GPC3-S-Fab kann speziell an binden und Krebszellen töten GPC3 positive Leber durch die Rekrutierung von natürlichen Killerzellen, was auf eine mögliche Anwendung der GPC3-S-Fab in Leberkrebs-Therapie.

GPC3-S-Fab-Reinigung
GPC3-S-Fab wurde von E. Coli durch eine zweistufige Affinitätsreinigung erst mit Ni-NTA-Agarose, gefolgt von IgG-CH1 Affinitätsreinigung gereinigt. Nach dem zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt wurde GPC3-S-Fab zur Homogenität mit zwei Ketten in der Nähe von 1:1 (Abbildung 2A). Das Vorhandensein von VH-CH1-CD16 LHKW und VL-CL Polypeptide kann...

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A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.

Ein GPC3-targeting Bispezifische Antikörper, GPC3-S-Fab, mit potenten Zytotoxizität

This protocol describes the construction and functional studies of a bispecific antibody (bsAb), GPC3-S-Fab. bsAbs can recognize two different epitopes ...

a-gpc3-targeting-bispecific-antibody-gpc3-s-fab-with-potent

Research

JoVE Journal

Cancer Research

8.5K Aufrufe.  Sun Yat-Sen University. Hier präsentieren wir ein Protokoll, um eine bispezifische Antikörper GPC3-S-Fab in Escherichia coli. Die gereinigte GPC3-S-Fab hat potente Zytotoxizität gegen GPC3 positive Leberkrebs Zellen.

Serie: A GPC3-targeting Bispecific Antibody, GPC3-S-Fab, with Potent Cytotoxicity

Analyzing Tumor and Tissue Distribution of Target Antigen Specific Therapeutic Antibody

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few decades, the field of antibody-drug conjugates, bispecific antibodies, chimeric antigen receptors (CAR) and cancer immunotherapy has emerged as the most promising area of basic and therapeutic investigations. With numerous successful human trials targeting immune checkpoint receptors and CAR-T cells in leukemia and melanoma at a breakthrough pace, it is highly exciting times for oncologic therapeutics derived from variations of antibody engineering. Regrettably, a significantly large numbers of antibody and CAR based therapeutics have also proven disappointing in human trials of solid cancers because of the limited availability of immune effector cells in the tumor bed. Importantly, nonspecific distribution of therapeutic antibodies in tissues other than tumors also contribute to the lack of clinical efficacy, associated toxicity and clinical failure. As faithful translation of preclinical studies into human clinical trails are highly relied on mice tumor xenograft efficacy and safety studies, here we highlight a method to test the tumor and general tissue distribution of therapeutic antibodies. This is achieved by labeling the protein-A purified antibody with near Infrared fluorescent dye followed by live imaging of tumor bearing mice.

Here we present a protocol to study the in vivo localization of antibodies in mice tumor xenograft models.

Analyse der Tumor- und Gewebeverteilung von Zielantigen-spezifischen therapeutischen Antikörpern

Monoclonal antibodies are high affinity multifunctional drugs that work by variable independent mechanisms to eliminate cancer cells. Over the last few ...

Forschung

Krebsforschung

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Biochemie

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

Selektive Zellelimination aus Mixed 3D Culture Mit einem Nah-Infrarot-Technik Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Biotechnik

Tracking Bispecific Antibody-Induced T Cell Trafficking Using Luciferase-Transduced Human T Cells

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as valency, spatial arrangement, interdomain distance, and Fc mutations affect the anti-tumor efficacy of these therapies, commonly by influencing the homing of T cells to tumors, which remains a major challenge. Here, we describe a method to transduce activated human T cells with luciferase, allowing in vivo tracking of T cells during T-BsAb therapy studies. The ability of T-BsAbs to redirect T cells to tumors can be quantitatively evaluated at multiple time points during treatment, allowing researchers to correlate the anti-tumor efficacy of T-BsAbs and other interventions with the persistence of T cells in tumors. This method alleviates the need to sacrifice animals during treatment to histologically assess T cell infiltration and can be repeated at multiple time points to determine the kinetics of T cell trafficking during and after treatment.

Here, we describe a method for transducing human T cells with luciferase to facilitate in vivo tracking of bispecific antibody-induced T cell trafficking to tumors in studies to evaluate the anti-tumor efficacy and mechanism of T cell-engaging bispecific antibodies.

Verfolgung des bispezifischen Antikörper-induzierten T-Zell-Transports mit Luciferase-transduzierten menschlichen T-Zellen

T cell-engaging bispecific antibodies (T-BsAbs) are in various stages of preclinical development and clinical testing for solid tumors. Factors such as ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Quantifying Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity in a Tumor Spheroid Model: Application for Drug Discovery

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of action of the antibodies is antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC), where the antibody binds to the cancer cells and engages the cellular component of the immune system, e.g., natural killer (NK) cells, to kill the tumor cells. The effectiveness of these therapies could be improved by identifying adjuvant compounds that increase the sensitivity of the cancer cells or the potency of the immune cells. In addition, undiscovered drug interactions in cancer patients co-medicated for previous conditions or cancer-associated symptoms may determine the success of the antibody therapy; therefore, such unwanted drug interactions need to be eliminated. With these goals in mind, we created a cancer ADCC model and describe here a simple protocol to find ADCC-modulating drugs. Since 3D models such as cancer cell spheroids are superior to 2D cultures in predicting in vivo responses of tumors to anticancer therapies, spheroid co-cultures of EGFP-expressing HER2+ JIMT-1 breast cancer cells and the NK92.CD16 cell lines were set up and induced with Trastuzumab, a monoclonal antibody clinically approved against HER2-positive breast cancer. JIMT-1 spheroids were allowed to form in cell-repellent U-bottom 96-well plates. On day 3, NK cells and Trastuzumab were added. The spheroids were then stained with Annexin V-Alexa 647 to measure apoptotic cell death, which was quantitated in the peripheral zone of the spheroids with an automated microscope. The applicability of our assay to identify ADCC-modulating molecules is demonstrated by showing that Sunitinib, a receptor tyrosine kinase inhibitor approved by the FDA against metastatic cancer, almost completely abolishes ADCC. The generation of the spheroids and image acquisition and analysis pipelines are compatible with high-throughput screening for ADCC-modulating compounds in cancer cell spheroids.

Here, we present a method to identify compounds that modulate the ADCC mechanism, an important cancer cell-killing mechanism of antitumor antibodies. The cytotoxic effect of NK cells is measured in breast cancer cell spheroids in the presence of Trastuzumab. Image analysis identifies live and dead killer and target cells in spheroids.

Quantifizierung der Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizität in einem Tumor-Sphäroid-Modell: Anwendung für die Wirkstoffforschung

Monoclonal antibody-based immunotherapy targeting tumor antigens is now a mainstay of cancer treatment. One of the clinically relevant mechanisms of ...

A Real-time Potency Assay for Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting Solid and Hematological Cancer Cells

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological malignancies such as childhood acute lymphocytic leukemia. Efforts are currently underway to extend this promising therapy to solid tumors in addition to other hematological cancers. Here, we describe the development and production of potent CAR T cells targeting antigens with unique or preferential expression on solid and liquid tumor cells. The in vitro potency of these CAR T cells is then evaluated in real-time using the highly sensitive impedance-based xCELLigence assay. Specifically, the impact of different costimulatory signaling domains, such as glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor (TNFR)-related protein (GITR), on the in vitro potency of CAR T cells is examined. This report includes protocols for: generating CAR T cells for preclinical studies using lentiviral gene transduction, expanding CAR T cells, validating CAR expression, and running and analyzing xCELLigence potency assays.

We describe a quantitative real-time in vitro cytolysis assay system to evaluate the potency of chimeric antigen receptor T cells targeting liquid and solid tumor cells. This protocol can be extended to assess other immune effector cells, as well as combination treatments.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy for cancer has achieved significant clinical benefit for resistant and refractory hematological ...

Immunologie und Infektion

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic fever and autoimmune diseases. Since thousands of antibodies with different epitopes are circulating in blood, no universal method, except for the dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF), was reported to target specific harmful antibodies. The development of DCAF molecules makes significant contribution to the progress of targeted therapy, which were demonstrated to eliminate the antibody dependent enhancement (ADE) effect in a Dengue virus (DENV) infection model and to boost the acetylcholine receptor activity in a myasthenia gravis model. Here, we describe a protocol for the synthesis of a DCAF molecule (DCAF1), which can selectively block 4G2 antibody to attenuate ADE effect during Dengue virus infection, and illustrate the binding of DCAF1 to 4G2 antibody by an ELISA assay. In our method, DCAF1 is synthesized by the conjugation of a hydrazine derivative of a Fc-III peptide and a recombinant expressed long &#945;-helix with antigenic sequence through native chemical ligation (NCL). This protocol has been successfully applied to DCAF1 as well as other DCAF molecules for targeting their cognate antibodies.

Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics DCAF

Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) is novel for the elimination of harmful antibodies. Here, we describe a detailed protocol for the synthesis of DCAF1 molecule, which can selectively block 4G2 antibody to eliminate antibody dependent enhancement effect during Dengue virus infection.

Gezielte Antikörperblockierung durch ein dual-funktionales Konjugat von antigenem Peptid und Fc-III-Mimetik (DCAF)

Elimination of harmful antibodies from organisms is a valuable approach for the intervention of antibody-associated diseases, such as Dengue hemorrhagic ...

Assessment of Human Natural Killer Cell Events Driven by Fc&#947;RIIIa Engagement in the Presence of Therapeutic Antibodies

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and cytotoxicity, driven by Fc&#947;RIIIa (CD16) expressed on natural killer (NK) cells. These observations have led to research focusing on methods to increase Fc receptor-mediated events, which include removal of a fucose moiety found on the Fc portion of the antibody. Further studies have elucidated the mechanistic changes in signaling, cellular processes, and cytotoxic characteristics that increase ADCC activity with afucosylated antibodies. Additionally, other studies have shown the potential benefits of these antibodies in combination with small molecule inhibitors. These experiments demonstrated the molecular and cellular mechanisms underlying the benefits of using afucosylated antibodies in combination settings. Many of these observations were based on an artificial in vitro activation assay in which the Fc&#947;RIIIa on human NK cells was activated by therapeutic antibodies. This assay provided the flexibility to study downstream effector NK cell functions, such as cytokine production and degranulation. In addition, this assay has been used to interrogate signaling pathways and identify molecules that can be modulated or used as biomarkers. Finally, other therapeutic molecules (i.e., small molecule inhibitors) have been added to the system to provide insights into the combination of these therapeutics with therapeutic antibodies, which is essential in the current clinical space. This manuscript aims to provide a technical foundation for performing this artificial human NK cell activation assay. The protocol demonstrates key steps for cell activation as well as potential downstream applications that range from functional readouts to more mechanistic observations.

A protocol for studying Fc&#947;RIIIa-driven events by therapeutic antibodies in human natural killer cells is described here. This artificial stimulation platform permits the interrogation of downstream effector functions such as degranulation, chemokine/cytokine production, and signaling pathways mediated by the Fc&#947;RIIIa and Fc portions of antibodies involved in binding.

Bewertung menschlicher natürlicher Killerzellereignisse, die durch fcγRIIIa Engagement in Gegenwart therapeutischer Antikörper angetrieben werden

One mechanism of action for clinical efficacy by therapeutic antibodies is the promotion of immune-related functions, such as cytokine secretion and ...

Advances in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Chimeric Antigen Receptor-Expressing Natural Killer Cells

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived chimeric antigen receptor (CAR) expressing NK cells has emerged as a promising avenue for "off the shelf" cancer immunotherapy. Here, we utilized an NK cell-optimized CAR construct that includes the transmembrane domain of NKG2D, the 2B4 co-stimulatory domain, and the CD3&#950; signaling domain, which has been demonstrated to stimulate robust antigen-specific NK cell-mediated antitumor activity. The use of iPSCs for CAR NK cell generation offers several advantages, including homogenous CAR expression, scalability, reproducibility, and the potential for clinical application. This detailed step-by-step protocol from cell engineering to differentiation enables the generation of NK cell-optimized iPSC-derived CAR-expressing NK cells, providing a standardized and targeted cancer immunotherapy with improved antitumor activity and highlighting their potential as a promising treatment option for various malignancies.

Here, we present a method to differentiate and expand human iPSC-derived chimeric antigen receptor (CAR)-expressing natural killer cells with improved killing against various malignancies. This protocol demonstrates the differentiation and expansion of natural killer (NK) optimized iPSC-derived CAR-NK cells and the measurement of antitumor activity against various tumor cell lines.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Natural killer (NK) cells are innate immune cells that play a crucial role in the body's defense against tumors and viral infections. The generation of ...