Diese Methode ermöglicht es Anwendern, T-Zellen einfach in vivo zu verfolgen, um die Kinetik des Homings zu bewerten und die Persistenz von T-Zellen zu überwachen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie zu mehreren Zeitpunkten am selben Tier wiederholt werden kann, ohne dass Abstriche bei der Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie erforderlich sind. Diese Technik könnte modifiziert werden, um auch andere Arten von Immunzellen zu verfolgen.
Um 293T-Zellen zu kultivieren, bereiten Sie einen Liter DMEM vor, indem Sie 110 Milliliter hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum und 11 Milliliter Penicillin-Streptomycin hinzufügen. Tauen Sie fünfmal 10 bis zu den sechsten 293T-Zellen auf und überführen Sie sie in einen T175-Kolben, der DMEM enthält. Teilen Sie die Zellen sechs Tage lang alle drei Tage um eins bis 10, bevor die Zellen zu mehr als 90 % zusammenfließen.
Für die Transfektion werden 1,5 Milliliter Medien mit einer Pipette in zwei 50-Milliliter-Röhrchen überführt. In ein Röhrchen 10 Mikrogramm VSVG-Plasmid, 20 Mikrogramm Knebelpol und 20 Mikrogramm Schnellkäfer-Rot-TDtomato oder CBRTDR-Luciferase-Plasmid geben und mischen. Geben Sie 100 Mikroliter DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz in ein anderes Röhrchen und mischen Sie.
Inkubieren Sie beide Röhrchen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz wird tropfenweise in das Röhrchen mit den DNA-Plasmiden überführt und vorsichtig mit einer Pipette vermischt. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Während der Inkubation werden die 293T-Zellen durch Zugabe von fünf bis 10 Millilitern 0,05%igem Trypsin abgetrennt. Sobald sich die Zellen gelöst haben, fügen Sie 10 Milliliter Medien hinzu und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 800 G. Resuspendieren Sie die Zellen in 1,5 Millilitern Medien.
Geben Sie das Medium mit dem DNA-In-vitro-Transfektionsreagenz und den DNA-Plasmiden zu den 293T-Zellen und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation wird die Suspension in einen T175-Kolben überführt. 18 Milliliter Medien zugeben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Am nächsten Tag saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Glaspipette ab, ohne die Zellen zu lösen, und ersetzen Sie es durch 18 Milliliter frisches Medium. Auch hier über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie am nächsten Tag den Virusüberstand mit einer Pipette, legen Sie sie auf Eis und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 800 G, um die Zellen und Trümmer zu pelletieren.
Filtern Sie den viralen Überstand mit einem 0,22-Mikron-Filter und legen Sie ihn sofort auf Eis. Für die In-vitro-Aktivierung menschlicher T-Zellen werden 10 Milliliter PBS mit 0,1 % Rinderserumalbumin oder BSA und zwei Millimolaren EDTA in ein steriles 15-Milliliter-Röhrchen gegeben. Um die Perlen zu waschen, geben Sie die Perlen in ein Röhrchen und legen Sie das Röhrchen in ein Magnetgestell.
Entfernen Sie das PBS nach zwei Minuten aus dem Röhrchen. Nach der Herstellung von DMEM werden gewaschene Kügelchen und Interleukin-2 oder IL-2 zu einer Endkonzentration von 30 internationalen Einheiten pro Milliliter hinzugefügt. Zählen Sie die T-Zellen mit einem Hämozytometer und einer Trypanblaufärbung.
Geben Sie nach dem Zählen die gewünschte Anzahl von T-Zellen in das Medium und drehen Sie das Röhrchen vorsichtig um, um es zu mischen. Platte 2,5 Milliliter Medien mit zwei Millionen T-Zellen, Beads und IL-2 in jeder Vertiefung einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Kultur bei 37 Grad Celsius in befeuchtetem 5%igem Kohlendioxid.
Untersuchen Sie die T-Zellen drei Tage lang täglich unter einem 20X-Objektiv, um zu bestimmen, wann sie mit Luciferase transduzieren müssen. Um eine RetroNektin-Platte herzustellen, geben Sie als Nächstes zwei Milliliter 20 Mikrogramm pro Milliliter RetroNektin in PBS in eine Vertiefung einer unbehandelten Sechs-Well-Platte und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie das RetroNectin, ohne den Boden der Platte zu zerkratzen, und fügen Sie drei Milliliter 2 % BSA in PBS pro Vertiefung in die Sechs-Well-Platte hinzu.
30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Als nächstes saugen Sie für die Spinokulation die BSA ab und waschen Sie die Vertiefungen einmal mit drei Millilitern PBS. Fahren Sie fort oder ersetzen Sie es durch frisches PBS und lassen Sie die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius abgedeckt stehen.
Am nächsten Tag zwei Milliliter CBRTDR-Luciferase-Virusüberstand pro Vertiefung hinzufügen und 90 Minuten lang bei 32 Grad Celsius bei 1.240 g zentrifugieren. Für die Transduktion wird nach der Zählung der T-Zellen der virale Überstand abgesaugt und zwei Millionen T-Zellen pro Well in sechs Milliliter DMEM mit 30 internationalen Einheiten pro Milliliter menschlichem IL-2 geplättet. Untersuchen Sie die T-Zellen zwei Tage lang.
Wenn die Zellen fast konfluieren, waschen Sie sie vorsichtig mit einer Pipette vom Boden der Platte ab und geben Sie jede Vertiefung in einen separaten T75-Kolben. Fügen Sie neun Milliliter Medien hinzu, um insgesamt 15 Milliliter Volumen pro Kolben zu erhalten. Fügen Sie am nächsten Tag 15 Milliliter Medium hinzu und bestätigen Sie die erfolgreiche Transduktion durch Durchflusszytometrie.
Nachdem die Maus mit einer 26-Gauge-Nadel betäubt wurde, injizieren Sie retroorbital 20 Millionen T-Zellen in 100 Mikroliter Medien. Verabreichen Sie 1.000 Einheiten rekombinantes IL-2 subkutan, um das Überleben der T-Zellen in vivo zu unterstützen. Anschließend wird der bispezifische Antikörper retroorbital oder intraperitoneal verabreicht.
Für die In-vivo-Bildgebung werden 100 Mikroliter von drei Milligramm D-Luciferin durch retroorbitale Injektion mit einer 26-Gauge-Nadel in eine anästhesierte Maus verabreicht. Um Bilder aufzunehmen, platzieren Sie die Maus so in der lichtdichten Kammer des Imagers, dass die Flanke mit dem Xenotransplantat nach oben zur Kamera zeigt. Wählen Sie in der Erfassungssteuerung die Optionen "Lumineszierend", "Foto" und "Überlagern" aus.
Stellen Sie die Belichtungszeit auf automatisch, das Binning auf mittel und die Blende auf eins ein und nehmen Sie Bilder auf. Stellen Sie nach dem ersten Bild die Belichtungszeit so ein, dass sie mit der für das erste Bild automatisch berechneten Zeit übereinstimmt, so dass nachfolgende Bilder direkt verglichen werden können. Machen Sie eine weitere Reihe von Bildern mit der Maus in Rückenlage, um das Vorhandensein von T-Zellen in der Lunge zu bewerten.
Bewaffnete T-Zellen schleusten schneller in den Tumor ein als unbewaffnete T-Zellen und verließen die Lunge zwei Tage früher. Die Quantifizierung der T-Zell-Infiltration in Tumore über die Zeit wurde mittels Biolumineszenz gemessen und als Gesamtflocken oder Strahldichte pro Pixel ausgedrückt, die über die Tumorkontur integriert sind. Der T-Zell-Transport konnte 28 Tage nach der Injektion der Luciferase-transduzierten T-Zellen überwacht werden, so dass das Homing und die Persistenz der T-Zellen während der gesamten Behandlung verfolgt werden konnten.
Es wird gezeigt, wie T-Zellen in HER2-positive menschliche Brustkrebspatientinnen mit Xenotransplantaten in DKO-Mäusen transportiert werden. Die Behandlung mit dem bispezifischen HER2-Antikörper mit einem nicht silenced FC hatte im Vergleich zu einem kontrollierten bispezifischen Antikörper keinen Einfluss auf das Tumorwachstum. Im Gegensatz dazu konnte die Behandlung mit bispezifischen HER2-Antikörpern mit N297A-Mutation allein oder in Kombination mit einer K322A-Mutation das Tumorwachstum vollständig stoppen.
Bei Gruppen mit den Silencing-Mutationen erreichte das T-Zell-Lumineszenzsignal am dritten Tag nach der Injektion einen höheren Höhepunkt und persistierte auf einem höheren Niveau als der kontrollierte bispezifische Antikörper und der nicht stummgeschaltete bispezifische HER2-Antikörper. Mäuse mit Xenotransplantaten von Neuroblastom-Patienten zeigten, dass die Depletion von Ly6C-positiven Makrophagen das Homing von T-Zellen zu Tumoren signifikant erhöhte, was zu einem verringerten Tumorwachstum und einem verlängerten Überleben führte. Der Effekt war bei Xenotransplantaten von Osteosarkompatienten ausgeprägter.
Unter den bispezifischen Antikörpern, die gegen das Tumorantigen STEAP1 gerichtet sind, führte das IGGL-SCFV-Format zu einer signifikant höheren T-Zell-Infiltration am sechsten Tag nach der ersten Dosis von T-Zellen, die für die Dauer der Behandlung anhielt. Solche Beobachtungen wurden durch In-vitro-Zytotoxizitätsassays nicht vorhergesagt. Nach der Nachverfolgung von T-Zellen in vivo können Anwender immer noch eine Immunhistochemie durchführen, um genauer zu bestimmen, wo sich die T-Zellen im Tumor oder in anderen normalen Geweben befinden.
