Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Allergy and Infectious Diseases in der National Institutes of Health [Grant Zahlen R01 AI117211, R01 AI130060 R21 AI127954 und R42 AI106375 BS] und US Food and Drug Administration [Vertrag unterstützt. HHSF223201710199C, BML].

Alle Verfahren, bei denen Tiere müssen von der Forscher institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt werden.
1. Vorbereitung der bakterielle Inokulum
<ol><li>Bakterienkolonien zu isolieren.<ol>
<li>Streifen ein Bakterienstamm (z. B. A. Baumannii "HUMC1") auf geeigneten sterilen Agar Medium (z. B.Tryptic Soy Agar), wobei Sie darauf achten, isolierte Kolonien zu generieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie zu angemessenen Bedingungen (z. B.über Nacht bei 37 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachsen Sie über Nacht Kultur.<ol>
<li>Wählen Sie einen Vertreter, isolierten Kolonie von der Agarplatte mit einer sterilen Impfkeimen Schleife und es 10 mL geeigneten sterilen Brühe Medium (z.B. Tryptic Soja Brühe) zu impfen.</li>
		<li>Lassen Sie die Probe, die stationäre Phase zu angemessenen Bedingungen (z.B., 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min über Nacht in eine belüftete Kappe, 50 mL konische Ampulle) zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachsen der Subkultur.<ol>
<li>10 mL frische sterile Brühe mit einer Pipette übermitteln Sie 100 μL der Nacht Kultur.</li>
		<li>Erlauben Sie, um exponentielle/Log-Phase bei den richtigen Bedingungen (z.B., 37 ° C mit schütteln bei 200 u/min für 3 h in einer entlüftet-Cap, 50 mL konische Phiole) zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Waschen der Subkultur.<ol>
<li>Entfernen Sie die Subkultur aus seiner Inkubation Umgebung.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 4.000 × g für 5 min um die Bakterien zu Pellets.</li>
		<li>Aspirieren und den überstand verwerfen.</li>
		<li>Pellet und Strudel kräftig bis voll Nukleinsäuretablette fügen Sie 10 mL sterile Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS hinzu).</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.4.2 - 1.4.4 zweimal, für eine Gesamtmenge von 3 wäscht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passen Sie die Konzentration der Bakteriensuspension.<ol>
<li>Mit einem Spektralphotometer, die Maßnahmen der Extinktion bei 600 nm (OD600), Messung die optische Dichte der Bakteriensuspension.</li>
		<li>Hinzufügen, sterile PBS die Bakteriensuspension bis die optische Dichte des Inokulums sinkt auf ein OD600 von 0,5, unter Verwendung der Gleichung Cich× Vich = Cf× Vf, wo "C" Konzentration, "V" ist, "ich" ist initial, und "f" ist endgültig. * Cf sollte immer 0,5; Vf ist die Variable zu lösen.</li>
		<li>Wenn die Bakteriensuspension eines OD600 von 0,5 unterschreitet, Zentrifugieren Sie es 4.000 × g für 5 min pellet-die Bakterien zu entfernen einen angemessenen Betrag des Überstands ein OD600 von 0,5 erreichen.</li>
		<li>Führen Sie serielle Verdünnungen in sterilen PBS (z.B. drei Verdünnungen von 1: 100, 1 × 10-6zu erreichen) und Platte auf sterile Agar der Korrelationskoeffizient bestimmen, die offenbart die Bakterienkonzentration in koloniebildenden Einheiten pro mL (KBE/mL) bei einer OD600 von 0,5. Hinweis: Der Wert dieser Korrelationskoeffizient für jede Belastung der einzelnen Arten variiert und vor Inokulum Vorbereitung für eine Infektion festzustellen.</li>
		<li>Verwenden Sie nach der Bestimmung der Korrelationskoeffizient, um erstellen Sie ein Inokulum die gewünschte Konzentration (z.B. 2 × 108- 1 × 109 KBE/mL); Wenn das gewünschte Inokulum OD600 von 0,5 übersteigt, Zentrifugieren der Bakteriensuspension bei 4.000 × g für 5 min pellet-die Bakterien zu entfernen, einen angemessenen Betrag des Überstands um die gewünschte Konzentration zu erreichen.</li>
		<li>Führen Sie in Vivo Pilotstudien um die Virulenz von jede bakterielle Isolat in jedem Stamm der Maus zu bestimmen, da diese Werte zwischen bakterielle Isolate der gleichen Spezies und Mäuse verschiedene genetische Hintergründe variieren. Für verschiedene Gram-negative ist das LD100 bei Mäusen in der Regel 1 bis 5 × 108 KBE/Maus, obwohl bestimmte Stämme am unteren Impfkulturen tödlich sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frieren Sie identische Aliquote für eine spätere Verwendung als auf Abruf, präzise Impfkulturen als zuvor veröffentlichten8 (optional).<ol>
<li>Bereiten Sie 1 L bakterielle Inokulum als oben beschrieben, Übertragung auf zwei konischen 500-mL-Fläschchen und Zentrifuge bei 4.000 × g für 5 min.</li>
		<li>Verwerfen Sie 450 mL des Überstands von konischen jede und Aufschwemmen Sie der Pellets von Bakterien im restlichen überstand.</li>
		<li>Übertragen Sie das konzentrierte bakterielle Inokulum auf eine 250 mL-Becherglas mit einer magnetischen Stir Bar und kontinuierlich auf einer Platte rühren bei 300 u/min mischen.</li>
		<li>Übertragen Sie sorgfältig genau 600 μL der konzentrierten bakterielle Inokulum (z.B.1 x 1010 KBE/mL) mit einer Pipette zu einem kryogenen 1,6 mL-Fläschchen mit genau 300 μL der sterilen H2O und 300 μL der sterilen Glycerin; mischen und speichern bei-80 ° C. Hinweis: Notwendig für die Lagerung Glycerin kann verwirren die experimentellen Ergebnisse und Übersterblichkeit verursachen, so es notwendig ist, es zu waschen.</li>
		<li>Wenn Sie bereit sind für den Einsatz, tauen Sie die Probe für 10 min bei Raumtemperatur auf.</li>
		<li>Übertragen Sie 1 mL zu einem konischen 50-mL-Fläschchen zu, fügen Sie 9 mL sterile PBS und Zentrifuge bei 4.000 × g für 5 min um die Bakterien zu Pellets. Den überstand abgesaugt und erneut die vorgegebene Anzahl der KBE (1 mL × eingefroren Lager Konzentration in KBE/mL) in einem entsprechenden Volumen von PBS, die gewünschte Konzentration für das infektiöse Inokulum zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) betäubende Mäuse
<ol><li>Ketamin/Xylazin Hinweis: Betäubung mit Ketamin/Xylazin hat eine lange Laufzeit, bietet genügend Zeit für den Forscher, die neue an dieser Technik für die Inokulation Vorgang, bevor die Maus erwacht ist.<ol>
<li>10 mL Injektionslösung durch die Kombination von 8,5 mL Pharmaceutifcal Grade PBS, 1 mL 100 mg/mL Ketamin-Stammlösung vorbereiten (Endkonzentration 10 mg/mL), und 20 mg/mL Stammlösung Xylazin 0,5 mL (Endkonzentration 10 mg/mL).</li>
		<li>Verwalten Sie 10 μL/g durch intraperitoneale Injektion der (IP) (z.B. 250 μl für eine 25-g-Maus).</li>
		<li>Die Augen der Mäuse mit Ketamin/Xylazin betäubt, weil ihre Augen anfällig sind für Beschädigungen während längerer Anästhesie zuweisen Sie Augenheilkunde Salbe.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig und überwachen Sie, bis es aus der Narkose erwacht. Hinweis: Das Tier sollte nicht unbeaufsichtigt gelassen werden bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isofluran Hinweis: Mäuse aufwachen schnell aus Isofluran induzierte Narkose nach der Entnahme aus der Kammer Induktion diese Methode der Narkose sollte nur verwendet werden, nachdem Sie kompetent bei der Impfung Verfahren geworden.<ol>
<li>Legen Sie die naive Mäuse in eine entsprechend dimensionierte Induktion Kammer mit Sauerstoff fließt.</li>
		<li>Nachdem die Kammer versiegelten geschlossen ist, Betäuben Sie die Mäuse mit eine Präzision Vaporizer Isofluran bei 4 % (V/V) für mindestens 5 min hinzufügen; die Narkose durch eine Maus aus der Induktion Kammer entfernen und Messen, wie lange es dauert, bis aus der Narkose aufwachen zu bestätigen (~ 60 s). Hinweis: Beachten Sie, dass die Anästhesie, die Zeiten variieren basierend auf Richtlinien und einige Tiere erfordern mehr als 5 min bis vollständig betäubt werden.</li>
		<li>Pflegen Sie die Narkose für bis zu 10 min durch eine Anpassung der Isofluran Konzentration auf 2-3 %; Wenn die Gesamtdauer der Narkose ist > 15 min, ophthalmologische Salbe für die Augen der narkotisierten Mäuse gelten.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in einem Käfig und überwachen Sie, bis es aus der Narkose, wie in Schritt 2.1 aufwacht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) impfen/infizieren Mäuse
<ol><li>Aussetzen einer narkotisierten Maus, durch die oberen Schneidezähne an einer starken, dünnen Schnur (z.B., Zahnseide) hängen an einem festen Gegenstand in einer Höhe ungefähr zweimal die Maus Körperlänge (z.B.20 cm) über der Arbeitsfläche (z. B. gesichert Labortisch).</li>
	<li>Ziehen Sie die Maus Zunge aus seinen Mund mit Pinzette steril, Blunt beendet. Übertragen Sie die Zunge auf eine sterile, behandschuhten Finger gegen versehentliche Zerkleinerung von der Maus Zunge. Halten Sie die Zunge außerhalb der Mündung, den Zugriff auf die Mund-Rachenraum und schlucken des Inokulums zur Seite zu verhindern.</li>
	<li>Halten Sie die Maus Zunge, Platz 50 μL Inokulum (Bakteriensuspension) in den Mund-Rachenraum mit einer Mikropipette; der Mund-Rachenraum befindet sich an der Kreuzung von der Mundhöhle und des Rachens im hinteren Bereich des Mundes. Hinweis: Es ist sehr wichtig, nur Flüssigkeit durch pipettieren, die erste Station auf der Mikropipette liefern. Die Maus stoppt Atem für ein paar Sekunden, wenn das Inokulum im Oropharynx gelegt wird; Schließlich verursacht reflexive streben die Maus, um die Bakteriensuspension, angezeigt durch die markante knisterndes Geräusch von Flüssigkeit in die Lunge, führt zu einer Lungenentzündung Infektion zu inhalieren.</li>
	<li>Wenn das Inokulum nicht weit steht genug, um normale Atmung zu blockieren, die Nasenlöcher mit Zangen zwingen reflexive Absaugen durch Mund und anschließende Einatmen des Inokulums Kneifen zurück.</li>
	<li>Lassen Sie nach der Inokulation die Zunge, entfernen Sie die Maus aus dem String Suspension, legen Sie sie in einen Käfig und überwachen Sie, bis er aus der Narkose, wie in Schritt 2.1 erwacht.</li>
</ol>4. Überwachung der Progression der Erkrankung
Hinweis: Aufgrund von Tierleid, sollte verschiedene Indikatoren verwendet werden um anzuzeigen, wenn Mäuse moribund geworden; Euthanasie sollte nach dieser Bestimmung gemäß einer zuvor genehmigten IACUC Protokoll durchgeführt werden; verschiedene Marker des Moribundity gehören Körpertemperatur, Gewichtsverlust, aussehen, Gang und andere Biomarker, die von Blut (z. B. über iSTAT)9,10,11,12gewonnen werden können, 13,14,15,16.
<ol><li>Einschläfern Sie die Mäuse nach zuvor genehmigten IACUC Protokoll (z.B. CO2 gefolgt von zervikale Dislokation).</li>
	<li>Entfernen Sie die Lunge aus euthanasierten Maus durch Schneiden der Luftröhre, Lungenarterie und Pulmonalvene in der Nähe der Lunge.<ol>
<li>Mikroskopie<ol>
<li>Legen Sie die Lunge (oder Teil) in einer Probe-Form.</li>
			<li>Füllen Sie den Probe-Schimmel mit optimalen schneiden Temperatur (O.C.T.) Verbindung, das Gewebe vollständig untertauchen.</li>
			<li>Einfrieren der Probe bei-80 ° C.</li>
			<li>Senden Sie die Probe an ein Labor Pathologie Abschnitt und montieren auf Folien für die Mikroskopie.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bakterielle Belastung<ol>
<li>Wiegen Sie das Lungengewebe auf einer Analysenwaage.</li>
			<li>Übertragen Sie das Lungengewebe auf 50 mL konisch Fläschchen mit 2-5 mL sterile PBS (abhängig von der Größe des Gewebes).</li>
			<li>Homogenisieren des Lungengewebes mit einem Gewebe-Homogenisator.</li>
			<li>Führen Sie Verdünnungsreihen Das Homogenat in sterilen PBS, etwa 1.000 KBE/mL, basierend auf erwartete bakterielle Belastung in der Lunge zu erreichen.<ol>
<li>Zum Beispiel wenn 1 × 109 KBE/mg zu erwarten ist, führen Sie drei Verdünnungen von 1: 100: Transfer 100 μL von Homogenat bis 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die erste 1: 100 Verdünnung. Übertragen Sie 100 μl der ersten 1: 100 Verdünnung auf 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die zweite 1: 100 Verdünnung. Übertragen Sie 100 μl der zweiten 1: 100 Verdünnung auf 9,9 mL PBS und Wirbel; Dies ist die dritte und letzte 1: 100 Verdünnung.</li>
				<li>Wenn bakterielle Belastung in der Lunge nicht bekannt ist, führen Sie eine Reihe von Verdünnungen des erwarteten Bereichs zu erfassen.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Platte Dilution(s) auf sterile Agar.<ol>
<li>Sterile Tryptic Soy Bouillon (TSB) mit Agarplatten (TSA) vorbereiten: Mähdrescher 30 g TSB, 15 g Agar, 1 L Wasser, mischen mit einem Magnetrührer und Hitze zum Kochen bringen bei ~ 100 ° C für 5 min. zulassen, um Cool und dann Autoklaven auf flüssigen Zyklus für 15 min. abkühlen lassen ~ 55 ° C, Transfer 10 mL frisch autoklaviert TSA, sterile Petrischalen und auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Lassen Sie auf Benchtop für 2-5 d trocken oder unter einen Schrank für 10 min Biosafety aufgedeckt.</li>
				<li>100 μl der Verdünnung auf einer Petrischale mit sterilem TSA übertragen und TSA mit einem Streuer oder Glas Perlen verteilt.</li>
				<li>Speichern der Petrischale über Nacht bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator (d.h. 37 ° C Inkubator mit einem aufgedeckt 1-L-Becher mit Wasser gefüllt)</li>
			</ol>
</li>
			<li>KBE/mL Lunge Homogenat basierend auf Agar-Beschichtung zu bestimmen (z. B.100 KBE auf TSA Teller mit 100 μL der dritte und letzte Verdünnung, die oben beschriebenen wäre 100 KBE/100 μL × 100Dil #1 × 100Dil #2 × 100Dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).</li>
			<li>Berechnen Sie KBE/mg Lungengewebe durch Division KBE/mL Lunge Homogenat von mg Lunge Gewebe/mL Homogenat (z. B., wenn oben beschriebene Beispiel 100 mg in 5 mL PBS, dann 1 × 109 KBE/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 107 homogenisiert Lungengewebe verwendet basierend CFUs/mg).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spellberg, B., Talbot, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+Design+Features+of+Future+Clinical+Trials+of+Antibacterial+Agents+for+Hospital-Acquired+Bacterial+Pneumonia+and+Ventilator-Associated+Bacterial+Pneumonia.">Recommended Design Features of Future Clinical Trials of Antibacterial Agents for Hospital-Acquired Bacterial Pneumonia and Ventilator-Associated Bacterial Pneumonia.</a> Clinical Infectious Diseases. 51 (S1), S150-S170 (2010).</li><li>Kalil, A. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Um sicher zu sein, sind die Mäuse nicht Miniatur Menschen. Ergebnisse aus Mausmodellen müssen im Zusammenhang betrachtet und anschließend auf Übertragbarkeit auf den Menschen, basierend auf Unterschiede und Gemeinsamkeiten zwischen den beiden Arten6interpretiert werden. Es ist auch wichtig, die entsprechenden Maus-Stamm als wählen sicher sind einige Infektionen anfälliger als andere; das gleiche gilt für die Erreger-Stamm von Wahl16.
Es is...

Infektion der unteren Atemwege ist die tödlichste Infektionskrankheit der Welt und die häufigste Todesursache in Entwicklungsländern1. Diese Infektionen entfallen weltweit mehr als 3,2 Millionen Todesfälle1. Darüber hinaus nosokomiale Pneumonie gehört zu den häufigsten und tödlichen Formen der Gesundheitswesen erworbenen Infektionen und wird durch die meisten Antibiotika-resistente Erreger2,3verursacht. Der typische Weg des Erwerbs von für beide ambulant erworbenen bakteriellen Pneumonie und nosokomialer Pneumonie ist das Bestreben der oropharyngealen Inhalt in die Alveolen. Murine Modelle verwendet, um diese Krankheiten oft zu studieren verwenden intranasale Impfung4, ein Großteil der Bakterien außerhalb der Lunge, wodurch Ziel Komplikationen und Symptome wie Sinusitis und physischen Traumata, die mit der Krankheit inkongruent sind der Hinterlegung Progression bei Menschen, die die Modelle wurden entwickelt, um zu emulieren. Andere Modelle können Inhalation Kammern und Micromisting Geräte, die genauer virale, tuberkulösen und Pilz-Pneumonien zu imitieren, aber nicht genau rekapitulieren die Normalroute des Erwerbs für typische bakterielle Pneumonien.
Das murine oropharyngealen Aspiration Lungenentzündung Modell kann genutzt werden, um den natürlichen Weg und Pathogenese der bakteriellen Pneumonie zu simulieren. Von Impfkeimen 50 µL Bakteriensuspension in den Mund-Rachenraum narkotisierten Mäuse mit einer Pipette folgt reflexive Anspruch, woraus sich infektiöse Lungenentzündung. Mit diesem Modell kann man die Pathogenese von Lungenentzündung-verursachenden Erreger und neue Therapien zur Bekämpfung dieser Krankheiten mit höheren Treue Vorbild mehr analog zur Aspiration Pneumonie Infektionen beim Menschen beobachtet untersuchen. Darüber hinaus sorgt im Gegensatz zu ähnlichen Modellen, die durch die Mundhöhle5,6infizieren, dieses Modell die volle Inokulum der Lunge statt den Darm erreicht wo es Off-Site-Entzündungen und Infektionen wie Gastritis verursachen kann und Enteritis. Schließlich, im Gegensatz zu anderen veröffentlichten Modell, das erfordert ein Laryngoskop und inoculates durch die Luftröhre7, dieses Modell nicht behindert die Atemwege mit einer Magensonde Nadel und erfordert keine Injektion für Inokulum Lieferung. Impfung, stützt sich auf das natürliche streben Reflex der Maus.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214530</td><td>Combine with TSB to make TSA</td></tr><tr><td>Beads, Borosilicate Glass</td><td>Kimble</td><td>135003</td><td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td></tr><tr><td>Beaker, 250 mL</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td>Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>ST 40R</td><td>Capable of 4,000&amp;times;g at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chamber for Anesthesia</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>VetFlo-0720</td><td>Accommodates up to 5 mice</td></tr><tr><td>Cryomold, Intermediate Size</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4566</td><td>Disposable vinyl specimen molds, 15&amp;times;15&amp;times;5 mm</td></tr><tr><td>Dental Floss</td><td>Oral-B</td><td>37000469537</td><td>Tie to stable post approx. 6&quot; above table height</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td>Used to gently pull tongue out of mouse&#039;s mouth</td></tr><tr><td>Homogenizer for Lung Tissue</td><td>Omni International</td><td>TM125-115</td><td>Autoclave before first use; rinse between samples</td></tr><tr><td>Isoflurane for Anesthesia</td><td>Abbott</td><td>10015516</td><td>Alternative drug can be used; modify procedure accordingly</td></tr><tr><td>iSTAT Cartridge</td><td>Abbott</td><td>03P79-25</td><td>Various cartridges are available to suit your needs</td></tr><tr><td>Ketamine, 100 mg/mL</td><td>Western Medical Supply</td><td>4165</td><td>Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Ointment for Eyes</td><td>Akorn</td><td>Tears Renewed</td><td>Avoid touching eye with tip of dispenser</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Used to freeze lung samples at -80 &amp;deg;C to prepare for pathology sectioning</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Polystyrene, disposable, sterilized, 100&amp;times;15 mm</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Dulbecco&#039;s PBS without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200-&amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Pipetter, 200-&amp;mu;L</td><td>Gilson</td><td>Pipetman P200</td><td>Autoclave and calibrate before use</td></tr><tr><td>Spreader, Bacterial Cell</td><td>Bel-Art</td><td>F377360006</td><td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td></tr><tr><td>Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter &amp;times; 38.1 mm Length</td><td>VWR</td><td>58948-150</td><td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td></tr><tr><td>Stir Plate, Magnetic</td><td>Corning</td><td>PC-620D</td><td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td>Combine with Agar to make TSA</td></tr><tr><td>Vial, Conical, Sterile, 50 mL</td><td>Corning</td><td>431720</td><td>Used for preparing bacterial inocula</td></tr><tr><td>Vial, Conical, Sterile, 500 mL</td><td>Corning</td><td>431123</td><td>Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula</td></tr><tr><td>Vial, Cryogenic, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula</td></tr><tr><td>Xylazine, 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>AnaSed Injection</td><td>Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL</td></tr></tbody></table>

murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia

Murine Infektionsmodelle sind entscheidend für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika entwickelt, um die verursachenden Erreger zu bekämpfen. Infektiöse Lungenentzündung zählt zu den häufigsten Infektionen von Patienten in der Klinik vorgestellt und somit garantiert eine geeignete in-Vivo -Modell. Typische Pneumonie-Modelle verwenden intranasale Impfung, die übermäßige Organismen außerhalb der Lunge verursacht Ziel Komplikationen und Symptome wie Sinusitis, Gastritis, Enteritis, physisches Trauma oder Mikropartikel beschlagen Aerosol imitieren Einlagen die Ausbreitung ist eher typisch für virale, tuberkulösen oder pilzartige Pneumonie. Diese Modelle entsprechen nicht exakt die Pathogenese der bakteriellen Lungenentzündung typischen Gemeinschaft oder Gesundheitswesen erworben. Im Gegensatz dazu imitiert dieses Mausmodell der oropharyngealen Aspirationspneumonie die Tröpfchen-Route im Gesundheitswesen-erworbener Pneumonie. Impfen 50 µL der Bakterien verursacht Aussetzung in den Mund-Rachenraum narkotisierten Mäuse reflexive Aspiration, die zu einer Lungenentzündung führt. Mit diesem Modell kann man die Pathogenese von Lungenentzündung-verursachenden Erreger und neue Therapien zur Bekämpfung dieser Krankheiten untersuchen.

Durch sorgfältig Folgendes Protokoll, können leicht reproduzierbare und robuste Daten abgerufen werden. Es ist wichtig, sich strikt an die individuelle Inokulum Vorbereitung Protokoll für Experimente zu einem miteinander verglichen werden. Es ist auch wichtig, richtig Mäuse während des Verfahrens der Infektion zu behandeln. Achten Sie darauf, um Mäuse in einer Narkose Kammer frei von Isofluran zu platzieren. Mäuse werden Panik, wenn sie in eine Kammer platziert werden, die mit Isof...

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Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.

Murine oropharyngealen Aspiration Modell der Ventilator-assoziierten und nosokomiale Bakterielle Pneumonie

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

murine-oropharyngeal-aspiration-model-ventilator-associated-hospital

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K Aufrufe.  University of Southern California. Infektiöse Lungenentzündung gehört zu den häufigsten Infektionen beim Menschen. Eine geeignete in-Vivo -Modell ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und Prüfung der Wirksamkeit neuer Therapeutika. Mit diesem Modell murine oropharyngealen Aspiration Pneumonie kann man die Pathogenese und neue Therapien gegen diese tödliche Infektionen untersuchen.

Serie: Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Ein Nicht-invasive und in technischer Hinsicht nicht intensive Verfahren zur Induktion und Phänotypisierung für experimentelle bakterielle Pneumonie bei Mäusen

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

A Robust Pneumonia Modell in intaktem Immunsystem Nagetiere zur Bewertung antibakterieller Wirksamkeit gegen<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; oder<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Offene Tracheotomie Magensäure Aspiration Mausmodell der akuten Lungenschädigung Ergebnisse in Maximal Akute nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Medizin

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, murine models of co-infection have been the primary tool developed to explore the pathologies of both the primary and secondary infections. Despite the prevalence of this model, considerable discrepancies regarding instillation procedures, dose volumes, and efficacies are prevalent among studies. Furthermore, these efforts have been largely incomplete in addressing how the pathogen may be directly influencing disease progression post-infection. Herein we provide a precise method of pathogen delivery, recovery, and analysis to be used in murine models of secondary bacterial pneumonia. We demonstrate that intratracheal instillation enables an efficient and accurate delivery of controlled volumes directly and evenly into the lower respiratory tract. Lungs can be excised to recover and quantify the pathogen burden. Following excision of the infected lungs, we describe a method to extract high quality pathogen RNA for subsequent transcriptional analysis. This procedure benefits from being a non-surgical method of delivery without the use of specialized laboratory equipment and provides a reproducible strategy to investigate pathogen contributions to secondary bacterial pneumonia.

Here, we present methods to improve secondary bacterial pneumonia studies by providing a non-invasive route of instillation into the lower respiratory tract followed by pathogen recovery and transcript analysis. These procedures are reproducible and can be performed without specialized equipment such as cannulas, guide wires, or fiber optic cables.

Ein präzises Pathogen-Liefer- und Wiederherstellungssystem für murine Modelle der sekundären bakteriellen Pneumonie

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

Ein Mausmodell für den Übergang von Streptococcus pneumoniae vom Kolonisator zum Krankheitserreger nach viraler Koinfektion rekapituliert altersbedingte Erkrankung

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Etablierung eines Lung-on-Chip-Modells für Studien zu Atemwegsinfektionen

Immunocompetent Alveolus-on-Chip Model for Studying Alveolar Mucosal Immune Responses

We introduce an advanced immunocompetent lung-on-chip model designed to replicate the human alveolar structure and function. This innovative model employs a microfluidic-perfused biochip that supports an air-liquid interface mimicking the environment in the human alveoli. Tissue engineering is used to integrate key cellular components, including endothelial cells, macrophages, and epithelial cells, to create a representative tissue model of the alveolus. The model facilitates in-depth examinations of the mucosal immune responses to various pathogens, including viruses, bacteria, and fungi, thereby advancing our understanding of lung immunity. The primary goal of this protocol is to provide details for establishing this alveolus-on-chip model as a robust in vitro platform for infection studies, enabling researchers to closely observe and analyze the complex interactions between pathogens and the host's immune system within the pulmonary environment. This is achieved through the application of microfluidic-based techniques to simulate key physiological conditions of the human alveoli, including blood flow and biomechanical stimulation of endothelial cells, alongside maintaining an air-liquid interface crucial for the realistic exposure of epithelial cells to air. The model system is compatible with a range of standardized assays, such as immunofluorescence staining, cytokine profiling, and colony-forming unit (CFU)/plaque analysis, allowing for comprehensive insights into immune dynamics during infection. The Alveolus-on-chip is composed of essential cell types, including human distal lung epithelial cells (H441) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) separated by porous polyethylene terephthalate (PET) membranes, with primary monocyte-derived macrophages strategically positioned between the epithelial and endothelial layers. The tissue model enhances the ability to dissect and analyze the nuanced factors involved in pulmonary immune responses in vitro. As a valuable tool, it should contribute to the advancement of lung research, providing a more accurate and dynamic in vitro model for studying the pathogenesis of respiratory infections and testing potential therapeutic interventions.

Autor im Rampenlicht: Entwicklung eines mikrofluidischen Lung-on-Chip-Modells für eine eingehende Untersuchung der menschlichen Immunantwort und Infektionsmechanismen

Lung-on-chip models surpass traditional 2D cultures by mimicking the air-liquid interface and endothelial cell perfusion, simulating blood flow and nutrient exchange crucial for lung physiology studies. This enhances lung research relevance, offering a dynamic, physiologically accurate environment to advance the understanding and treatment of respiratory infections.

Immunkompetentes Alveolen-on-Chip-Modell zur Untersuchung der Immunantworten der Alveolarschleimhaut

We introduce an advanced immunocompetent lung-on-chip model designed to replicate the human alveolar structure and function. This innovative model employs ...

Murine oropharyngealen Aspiration Modell der Ventilator-assoziierten und nosokomiale Bakterielle Pneumonie

Zusammenfassung

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