Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas no National Institutes of Health [Grant número R01 AI117211, R01 AI130060, R21 AI127954 e R42 AI106375 BS] e Food and Drug Administration [contrato HHSF223201710199C a BML].

Todos os procedimentos que envolvam animais devem ser aprovados do pesquisador institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização (IACUC).
1. preparação do inóculo bacteriano
<ol><li>Isole colônias bacterianas.<ol>
<li>Raia uma estirpe bacteriana (por exemplo, a. baumannii "HUMC1") em ágar-ágar estéril apropriado (por exemplo, ágar Tryptic soy), tendo o cuidado de gerar colónias isoladas.</li>
		<li>Incube a condições apropriadas (por exemplo, durante a noite a 37 ° C).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresce a cultura durante a noite.<ol>
<li>Selecione um representante, colônia isolada da placa de ágar com um loop inoculando estéril e usá-lo para inocular 10 mL do meio de caldo estéril apropriado (por exemplo, caldo Tryptic soy).</li>
		<li>Permitir que a amostra chegar a fase estacionária em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm durante a noite em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cresce a subcultura.<ol>
<li>Transferi 100 μL da cultura durante a noite a 10 mL de caldo estéril fresco, usando uma pipeta.</li>
		<li>Permita alcançar a fase exponencial/log em condições adequadas (por exemplo, 37 ° C, com agitação a 200 rpm para 3h em um frasco cónico ventilado-cap, 50 mL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave a subcultura.<ol>
<li>Remova a subcultura do seu ambiente de incubação.</li>
		<li>Centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas.</li>
		<li>Aspirar e desprezar o sobrenadante.</li>
		<li>Adicione 10 mL de salina tampão fosfato (PBS) para a pelota e vórtice vigorosamente até totalmente resuspended.</li>
		<li>Repita as etapas 1.4.2 - 1.4.4 duas vezes, para um total de 3 lavagens.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajuste a concentração da suspensão bacteriana.<ol>
<li>Usando um espectrofotômetro que mede a densidade óptica em 600 nm (OD600), medir a densidade óptica da suspensão bacteriana.</li>
		<li>Adicionar PBS estéril à suspensão bacteriana até a densidade óptica do inóculo cai para uma OD600 de 0.5, usando a equação Ceu× Veu = Cf× Vf, onde "C" é a concentração, "V" é o volume, o "eu" é inicial, e "f" é final. * Cf sempre deve ser 0,5; Vf é a variável para resolver.</li>
		<li>Se a suspensão bacteriana cai abaixo de um OD600 de 0.5, centrifugá-lo a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para alcançar uma OD600 de 0,5.</li>
		<li>Realizar diluições em série em PBS estéril (por exemplo, três diluições de 1: 100 para atingir 1 × 10-6) e placa no ágar estéril para determinar o coeficiente de correlação que revela a concentração bacteriana em formadoras unidades por mL (CFUs/mL) em um OD de600 de 0,5. Nota: O valor do coeficiente de correlação deste irá variar para cada cepa de cada espécie e deve ser determinado antes da preparação do inóculo para a infecção.</li>
		<li>Depois de determinar o coeficiente de correlação, usá-lo para criar um inóculo da concentração desejada (por exemplo, 2 × 108- 1 × 109 CFUs/mL); Se o inóculo desejado for maior que o OD600 de 0.5, centrifugar a suspensão bacteriana 4.000 × g por 5 min para as bactérias de pelotas e retirar uma quantidade apropriada de sobrenadante para atingir a concentração desejada.</li>
		<li>Execute na vivo estudos-piloto para determinar a virulência de cada isolado bacteriano em cada cepa de rato como esses valores variam entre isolados bacterianos da mesma espécie e ratos de diferentes origens genéticas. Para várias espécies de bactérias Gram-negativas, o LD100 em camundongos é geralmente 1-5 × 108 CFUs/rato, embora certas estirpes são letais em inóculos inferiores.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Congele as alíquotas idênticas para uso futuro como inóculos sob demanda, precisos, como publicado anteriormente8 (opcional).<ol>
<li>Prepare 1 L de inóculo bacteriano como descrita acima, transferência para dois frascos Erlenmeyer 500 mL e centrifugar 4.000 × g por 5 min.</li>
		<li>Descartar a 450 mL do sobrenadante de cada frasco de Erlenmeyer e ressuspender as pelotas de bactérias no sobrenadante restante.</li>
		<li>Transferir o inóculo bacteriano concentrado para um copo de 250 mL contendo uma barra de agitação magnética e misture continuamente em cima de um prato de agitar a 300 rpm.</li>
		<li>Transferir com cuidado, exatamente 600 μL de inóculo bacteriano concentrado (por exemplo, 1 × 1010 CFUs/mL) com uma pipeta para um frasco criogênico de 1,6 mL, contendo exatamente 300 μL de estéril H2O e 300 μL de glicerol estéril; mistura e loja a-80 ° C. Nota: O glicerol necessário para armazenamento pode confundir os resultados experimentais e causar excesso de mortalidade, por isso é necessário lavá-lo.</li>
		<li>Quando estiver pronto para uso, descongele a amostra durante 10 minutos à temperatura ambiente.</li>
		<li>Transferir 1 mL para um frasco de Erlenmeyer de 50 mL, adicionar 9 mL de PBS estéril e centrifugar a 4.000 × g por 5 min para as bactérias de Pelotas. Aspirar o sobrenadante e ressuspender a quantidade pré-determinada de CFUs (1 mL × congelado a concentração das ações em CFUs/mL) em um volume adequado de PBS para atingir a concentração desejada para o inóculo infeccioso.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. anestesiar os ratos
<ol><li>Xilazina/cetamina Nota: A anestesia com cetamina/xilazina tem uma longa duração, que dispõe de tempo suficiente para o pesquisador, que é novo nesta técnica para concluir o procedimento de inoculação antes o mouse desperta.<ol>
<li>Prepare-se 10 mL de solução injetável, combinando 8,5 mL de pharmaceutifcal série PBS, 1ml de 100mg/mL solução estoque de cetamina (concentração final 10 mg/mL) e 0,5 mL de 20 mg/mL solução estoque de xilazina (concentração final 10 mg/mL).</li>
		<li>Administre 10 μL/g por injeção intraperitoneal de (IP) (por exemplo, 250 μL para um rato de 25-g).</li>
		<li>Aplica a pomada oftálmica aos olhos dos ratos anestesiados com cetamina/xilazina, porque seus olhos estão danificados durante longos períodos de anestesia.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia. Nota: O animal não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isoflurano Nota: Os ratos rapidamente acordam da anestesia induzida por isoflurano após ser removido da câmara de indução, então este método de anestesia só deve ser usado depois de se tornar proficientes em procedimento de inoculação.<ol>
<li>Coloque os ratos ingênuo em uma câmara de indução apropriadamente dimensionados com oxigênio fluindo.</li>
		<li>Depois que a câmara é vedada, anestesiar os ratos usando um vaporizador de precisão para adicionar isoflurano em 4% (v/v) pelo menos 5 min; confirmar a anestesia, removendo um rato da câmara de indução e medir o tempo que demora para acordar da anestesia (~ 60 s). Nota: Esteja ciente de que anestesia vezes podem variar com base em diretrizes institucionais e alguns animais podem exigir mais de 5 min para tornar-se totalmente anestesiado.</li>
		<li>Manter a anestesia por até 10 min. ajustando a concentração de isoflurano para 2-3%; se a duração total da anestesia é > 15 min, aplique pomada oftálmica nos olhos de ratos anestesiados.</li>
		<li>Coloque o mouse em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. inocular/infectar ratos
<ol><li>Suspender um rato anestesiado, pendurá-lo pelos seus incisivos superiores em uma corda forte, fina (por exemplo, fio dental) fixados a um objeto fixo a uma altura de aproximadamente duas vezes do mouse comprimento do corpo (por exemplo, 20 cm) acima da superfície de funcionamento (por exemplo bancada de laboratório).</li>
	<li>Suavemente puxe a língua do rato fora de sua boca utilizando pinça estéril, sem corte-terminado. Transferi a língua para um dedo estéril, com luvas para evitar o esmagamento acidental da língua do rato. Segure a língua fora da boca, permitindo o acesso à orofaringe e evitando a deglutição do inóculo para o lado.</li>
	<li>Enquanto segura a língua do rato, coloque o inóculo de 50 μL (suspensão bacteriana) na orofaringe utilizando uma micropipeta; a orofaringe está localizada na junção da cavidade oral e faringe em direção a parte traseira da boca. Nota: É muito importante entregar apenas líquido pipetando para a primeira parada da micropipeta. O rato vai parar de respirar por alguns segundos quando o inóculo é colocado na orofaringe; eventualmente, aspiração reflexiva fará com que o mouse inalar a suspensão bacteriana, indicada pelo ruído crepitante distintivo do líquido entrar nos pulmões, o que resulta em infecção de uma pneumonia.</li>
	<li>Se o inóculo não é colocado longe de volta suficiente para bloquear a respiração normal, beliscar as narinas com fórceps para forçar reflexiva aspiração através da boca e inalação subsequente do inóculo.</li>
	<li>Após a inoculação, solte a língua, remover o mouse da cadeia de suspensão, colocá-lo em uma gaiola e monitorar até ele acorda da anestesia, como no passo 2.1.</li>
</ol>4. monitorar a progressão da doença
Nota: Devido ao sofrimento dos animais, vários indicadores devem ser usados para indicar quando os ratos se tornam moribundos; eutanásia deve ser realizada após esta determinação, em conformidade com um protocolo IACUC previamente aprovado; vários marcadores de moribundity incluem a temperatura corporal, perda de peso, aparência, da marcha e outros biomarcadores que podem ser obtidos a partir do sangue (por exemplo, através do iSTAT)9,10,11,12, 13,14,15,16.
<ol><li>Eutanásia nos ratos, de acordo com protocolo previamente aprovado de IACUC (por exemplo, CO2 , seguido por deslocamento cervical).</li>
	<li>Remova os pulmões de eutanásia mouse cortando a traqueia, artéria pulmonar e veia pulmonar perto dos pulmões.<ol>
<li>Microscopia<ol>
<li>Coloque os pulmões (ou parte) em um molde do espécime.</li>
			<li>Encha o molde de amostra com temperatura de corte ideal (O.C.T.) composto, submergindo completamente o tecido.</li>
			<li>Congelar a amostra a-80 ° C.</li>
			<li>Envie a amostra para um laboratório de patologia de seção e montar em lâminas de microscopia.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Carga bacteriana<ol>
<li>Pese o tecido pulmonar em uma balança analítica.</li>
			<li>Transferi o tecido pulmonar para frasco cónico de 50 mL contendo 2-5 mL de PBS estéril (dependendo do tamanho do tecido).</li>
			<li>Homogeneizar o tecido pulmonar com um homogeneizador.</li>
			<li>Realize diluições em série do homogeneizado em PBS estéril para atingir aproximadamente 1.000 CFUs/mL, com base na carga bacteriana esperada nos pulmões.<ol>
<li>Por exemplo, se 1 × 109 CFUs/mg é esperado, realizar três diluições de 1: 100: transferir 100 μL de homogeneizado a 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a primeira diluição 1: 100. Transferir 100 µ l da primeira diluição 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a segunda diluição de 1: 100. Transferir 100 μL da segunda diluição de 1: 100 para 9,9 mL de PBS e vortex; Esta é a diluição de 1: 100 terceira e final.</li>
				<li>Se a carga bacteriana nos pulmões é desconhecida, execute uma série de diluições para capturar a escala prevista.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Placa dilution(s) em ágar estéril.<ol>
<li>Prepare-se estéril Tryptic Soy caldo (TSB) com placas de agar (TSA): Combine 30 g de TSB, 15 g de ágar-ágar, 1 L de água, misturar com um agitador magnético e aqueça até ferver a ~ 100 ° C durante 5 min. deixe esfriar e então autoclave no ciclo líquido durante 15 min. permitir arrefecer à ~ 55 ° C, transferência 10ml recém autoclavado TSA para pratos de Petri estéril e deixar arrefecer à temperatura ambiente. Deixe secar na bancada para 2-5 d ou descobertos sob uma armário por 10 min de biossegurança.</li>
				<li>Transferir 100 µ l da diluição para uma placa de Petri contendo TSA estéril e espalharam TSA usando um difusor ou vidro grânulos.</li>
				<li>Armazenar o prato de Petri durante a noite a 37 ° C numa incubadora umidificado (ou seja, incubadora 37 ° C, contendo um copo 1-L descoberto, cheio de água)</li>
			</ol>
</li>
			<li>Determinar CFUs/mL pulmão homogenate baseado no chapeamento de ágar (por exemplo, 100 CFUs na placa TSA com 100 μL de terceira e última diluição descrita acima seria 100 CFUs/100 μL × 100dil #1 × 100dil #2 × 100dil #3 = 1 × 109 CFUs/mL).</li>
			<li>Calcular o tecido de pulmão CFUs/mg baseado dividindo homogenate de pulmão CFUs/mL por mg pulmão homogeneizado de tecido/mL (por exemplo, se o exemplo descrito acima usado 100 mg de tecido pulmonar homogeneizado em 5 mL de PBS e, em seguida, 1 × 109 CFUs/mL ÷ 100 mg / 5 mL = 5 × 10-7 CFUs/mg).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Para ter certeza, os ratos não são seres humanos em miniatura. Resultados obtidos em modelos do rato devem ser considerados no contexto e posteriormente interpretados para aplicabilidade aos seres humanos, com base em diferenças e semelhanças entre as duas espécies de6. Também é importante escolher a tensão apropriada do mouse como certos estão mais suscetíveis a algumas infecções do que outros; o mesmo se aplica para a cepa de patógeno de escolha16.
<p cla...

Infecção respiratória inferior é a mais mortal das doenças transmissíveis do mundo e a causa mais comum de morte nos países em desenvolvimento1. Globalmente, estas infecções são responsáveis por mais de 3,2 milhões de mortes1. Além disso, uma pneumonia nosocomial está entre as formas mais comuns e mortais de infecções adquiridas de saúde e é causada por patógenos mais resistentes aos antibióticos,2,3. A rota típica de aquisição da pneumonia bacteriana para ambos adquirida na Comunidade e pneumonia nosocomial é a aspiração do conteúdo da orofaringe em alvéolos. Murino modelos utilizados para estudar estas doenças frequentemente usam inoculação intranasal4, depositando muito das bactérias fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas como sinusite e traumas físicos, que são incongruentes com a doença progressão em humanos que os modelos foram projetados para emular. Outros modelos podem usar câmaras de inalação e dispositivos de micromisting, que com mais precisão imitam pneumonias virais, tuberculosas e fúngicas, mas não com precisão recapitular a rota normal de aquisição para pneumonias bacterianas típicas.
O modelo de uma pneumonia de aspiração orofaríngea murino pode ser utilizado para simular a rota natural e patogênese da pneumonia bacteriana. Pela inoculando 50 µ l da suspensão bacteriana em orofaringe de ratos anestesiados com uma pipeta, aspiração reflexiva segue, o que resulta em uma pneumonia infecciosa. Usando este modelo, um pode examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças com um modelo de fidelidade maior, mais semelhante a infecções de pneumonia de aspiração observadas em humanos. Além disso, ao contrário dos modelos semelhantes que infectam através da cavidade oral5,6, este modelo garante que o inóculo completo atinge os pulmões em vez do intestino, onde pode causar inflamação fora do local e infecções, como a gastrite e enterite. Finalmente, ao contrário de outro modelo publicado que requer um laringoscópio e inocula-se através da traqueia7, este modelo não obstrua as vias aéreas com uma agulha de gavagem e não exige a injeção para a entrega de inóculo. Em vez disso, inoculação depende o reflexo de aspiração natural do mouse.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214530</td><td>Combine with TSB to make TSA</td></tr><tr><td>Beads, Borosilicate Glass</td><td>Kimble</td><td>135003</td><td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td></tr><tr><td>Beaker, 250 mL</td><td>Pyrex</td><td>1003</td><td>Used during precise aliquoting of concentrated bacterial inocula</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>ST 40R</td><td>Capable of 4,000&amp;times;g at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Chamber for Anesthesia</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>VetFlo-0720</td><td>Accommodates up to 5 mice</td></tr><tr><td>Cryomold, Intermediate Size</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4566</td><td>Disposable vinyl specimen molds, 15&amp;times;15&amp;times;5 mm</td></tr><tr><td>Dental Floss</td><td>Oral-B</td><td>37000469537</td><td>Tie to stable post approx. 6&quot; above table height</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td>Used to gently pull tongue out of mouse&#039;s mouth</td></tr><tr><td>Homogenizer for Lung Tissue</td><td>Omni International</td><td>TM125-115</td><td>Autoclave before first use; rinse between samples</td></tr><tr><td>Isoflurane for Anesthesia</td><td>Abbott</td><td>10015516</td><td>Alternative drug can be used; modify procedure accordingly</td></tr><tr><td>iSTAT Cartridge</td><td>Abbott</td><td>03P79-25</td><td>Various cartridges are available to suit your needs</td></tr><tr><td>Ketamine, 100 mg/mL</td><td>Western Medical Supply</td><td>4165</td><td>Dilute 1:10 in PBS to 1 mg/mL and combine with Xylazine at 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Ointment for Eyes</td><td>Akorn</td><td>Tears Renewed</td><td>Avoid touching eye with tip of dispenser</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td>Used to freeze lung samples at -80 &amp;deg;C to prepare for pathology sectioning</td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Polystyrene, disposable, sterilized, 100&amp;times;15 mm</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CM</td><td>Dulbecco&#039;s PBS without calcium and magnesium</td></tr><tr><td>Pipette Tips, 200-&amp;mu;L</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td>Autoclave before use</td></tr><tr><td>Pipetter, 200-&amp;mu;L</td><td>Gilson</td><td>Pipetman P200</td><td>Autoclave and calibrate before use</td></tr><tr><td>Spreader, Bacterial Cell</td><td>Bel-Art</td><td>F377360006</td><td>Sterilize by baking or autoclaving before each use</td></tr><tr><td>Stir Bar, Magnetic, 7.9 mm Diameter &amp;times; 38.1 mm Length</td><td>VWR</td><td>58948-150</td><td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td></tr><tr><td>Stir Plate, Magnetic</td><td>Corning</td><td>PC-620D</td><td>Used for stiring concentrated bacterial inocula during aliquoting</td></tr><tr><td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td><td>BD</td><td>211822</td><td>Combine with Agar to make TSA</td></tr><tr><td>Vial, Conical, Sterile, 50 mL</td><td>Corning</td><td>431720</td><td>Used for preparing bacterial inocula</td></tr><tr><td>Vial, Conical, Sterile, 500 mL</td><td>Corning</td><td>431123</td><td>Used to concentrate inocula for preparing frozen inocula</td></tr><tr><td>Vial, Cryogenic, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430659</td><td>Used for cryogenic storage of concentrated bacterial inocula</td></tr><tr><td>Xylazine, 20 mg/mL</td><td>Akorn</td><td>AnaSed Injection</td><td>Dilute 1:20 in PBS to 1 mg/mL and combine with Ketamine at 1 mg/mL</td></tr></tbody></table>

murine oropharyngeal aspiration model of ventilator-associated and hospital-acquired bacterial pneumonia

Modelos de infecção murino são essenciais para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica novela projetada para combater agentes patogénicos causadores. Pneumonia infecciosa está entre as infecções mais comuns apresentadas pelos pacientes na clínica e, portanto, garante um modelo apropriado na vivo . Pneumonia típica modelos usam inoculação intranasal, que deposita excessivos organismos fora do pulmão, causando complicações fora do alvo e sintomas, tais como sinusite, gastrite, enterite, trauma físico ou micropartículas de nebulização para imitar o aerossol Espalhe mais típico de pneumonia viral, fúngica ou tuberculosa. Estes modelos não refletem com precisão a patogênese da pneumonia bacteriana típica ou cuidados de saúde-adquirida na Comunidade. Em contraste, este modelo murino de pneumonia por aspiração orofaríngea imita a rota da gota em pneumonia adquirida na saúde. Suspensão em orofaringe de ratos anestesiados inocular 50 µ l das bactérias faz com que aspiração reflexiva, o que resulta em uma pneumonia. Com este modelo, pode-se examinar a patogênese de patógenos causadores de pneumonia e novos tratamentos para combater estas doenças.

Cuidadosamente, seguindo o protocolo, reproduzíveis e robustos de dados podem ser facilmente obtidos. É fundamental para aderir do inóculo personalizado preparação protocolo para experiências ser comparado com um outro. Também é importante tratar adequadamente os ratos durante o processo de infecção. Não se esqueça de colocar os ratos em uma câmara de anestesia desprovido de isoflurano. Os ratos entrará em pânico se eles são colocados em uma câmara que tenha sido previame...

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Murine Oropharyngeal Aspiration Model of Ventilator-associated and Hospital-acquired Bacterial Pneumonia

Pneumonia infecciosa é entre as infecções mais comuns em humanos. Um modelo apropriado na vivo é fundamental para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica de romance. Com este modelo de pneumonia de aspiração orofaríngea murino, um pode examinar a patogênese e novos tratamentos contra essas infecções mortais.

Modelo murino aspiração orofaríngea da Pneumonia bacteriana associada e hospitalares

Murine infection models are critical for understanding disease pathogenesis and testing the efficacy of novel therapeutics designed to combat causative ...

murine-oropharyngeal-aspiration-model-ventilator-associated-hospital

Research

JoVE Journal

Medicine

11.7K visualizações.  University of Southern California. Pneumonia infecciosa é entre as infecções mais comuns em humanos. Um modelo apropriado na vivo é fundamental para compreender a patogênese da doença e testar a eficácia da terapêutica de romance. Com este modelo de pneumonia de aspiração orofaríngea murino, um pode examinar a patogênese e novos tratamentos contra essas infecções mortais.

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The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

A utilização de orofaringe Intratraqueal Administração PAMP e Lavagem Broncoalveolar para avaliar a resposta imune do hospedeiro em camundongos

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

Imunologia e Infecção

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa Lesão Pulmonar Induzida Modelo

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of the host depends on the involvement of an adapted immune response against the pathogen1. Immune response is complex and results from interaction of the pathogens and several immune or non-immune cellular types2. In vitro studies cannot characterise these interactions and focus on cell-pathogen interactions. Moreover, in the airway3, particularly in patients with suppurative chronic lung disease or in mechanically ventilated patients, polymicrobial communities are present and complicate host-pathogen interaction. Pseudomonas aeruginosa and Candida albicans are both problem pathogens4, frequently isolated from tracheobronchial samples, and associated to severe infections, especially in intensive care unit5. Microbial interactions have been reported between these pathogens in vitro but the clinical impact of these interactions remains unclear6. To study the interactions between C. albicans and P. aeruginosa, a murine model of C. albicans airways colonization, followed by a P. aeruginosa-mediated acute lung infection was performed.

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

While in vitro study of host-pathogen interactions allow the characterization of specific immune responses, in vivo models are required to observe the effects of complex responses. Using Candida albicans exposure followed by Pseudomonas aeruginosa-mediated lung infection, we established a murine model of microbial interactions involved in ventilator-associated pneumonia pathogenicity.

Estudar comunidades microbianas<em&gt; In Vivo</em&gt;: Um modelo de interação mediada por anfitrião entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; E<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Nas Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant preclinical advances in our understanding of the underlying cellular and molecular pathogenesis. In vivo mouse models capture the integrated physiology and resilience of the host defense response in a manner not revealed by alternative, simplified ex vivo approaches. Several methods have been described in the literature for intrapulmonary inoculation of bacteria in mice, including aerosolization, intranasal delivery, peroral endotracheal cannulation under &#39;blind&#39; and visualized conditions, and transcutaneous endotracheal cannulation. All methods have relative merits and limitations. Herein, we describe in detail a non-invasive, technically non-intensive, inexpensive, and rapid method for intratracheal delivery of bacteria that involves aspiration (i.e., inhalation) by the mouse of an infectious inoculum pipetted into the oropharynx while under general anesthesia. This method can be used for pulmonary delivery of a wide variety of non-caustic biological and chemical agents, and is relatively easy to learn, even for laboratories with minimal prior experience with pulmonary procedures. In addition to describing the aspiration pneumonia method, we also provide step-by-step procedures for assaying the subsequent in vivo pulmonary innate immune response of the mouse, in particular, methods for quantifying bacterial clearance and the cellular immune response of the infected airway. This integrated and simple approach to pneumonia assessment allows for rapid and robust evaluation of the effect of genetic and environmental manipulations upon pulmonary innate immunity.

Several methods have been described in the literature for modeling bacterial pneumonia in mice. Herein, we describe a non-invasive, inexpensive, rapid method for inducing pneumonia via aspiration (i.e., inhalation) of a bacterial inoculum pipetted into the oropharynx. Downstream methods for assessment of the pulmonary innate immune response are also detailed.

Um método não-invasivo e tecnicamente não-intensivo para indução e fenotipagem of Experimental pneumonia bacteriana em ratos

Although community-acquired pneumonia remains a major public health problem, murine models of bacterial pneumonia have recently facilitated significant ...

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or A. baumannii

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, preferably in models which mimic the intended clinical indication. A method for inducing robust lung infections in immunocompetent rats and mice is described which allows for the assessment of treatments in a model of serious pneumonia caused by S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae or A. baumannii. Animals are anesthetized, and an agar-based inoculum is deposited deep into the lung via nonsurgical intratracheal intubation. The resulting infection is consistent, reproducible, and stable for at least 48 h and up to 96 h for most isolates. Studies with marketed antibacterials have demonstrated good correlation between in vivo efficacy and in vitro susceptibility, and concordance between pharmacokinetic/pharmacodynamic targets determined in this model and clinically accepted targets has been observed. Although there is an initial time investment when learning the technique, it can be performed quickly and efficiently once proficiency is achieved. Benefits of the model include elimination of the neutropenic requirement, increased robustness and reproducibility, ability to study more pathogens and isolates, improved flexibility in study design and establishment of a challenging infection in an immunocompetent host.

A Robust Pneumonia Model in Immunocompetent Rodents to Evaluate Antibacterial Efficacy against S. pneumoniae, H. influenzae, K. pneumoniae, P. aeruginosa or  A. baumannii

A method for establishing lung infections in immunocompetent rodents is described. With proficiency, this method can be performed quickly and easily to induce stable infection with many isolates of S. pneumoniae, H. influenzae, P. aeruginosa, K. pneumoniae and A. baumannii.

Um Modelo Pneumonia robusta em imunocompetentes Roedores para avaliar antibacteriano Eficácia contra<i&gt; S. pneumoniae</i&gt;,<i&gt; H. influenzae</i&gt;,<i&gt; K. pneumoniae</i&gt;,<em&gt; P. aeruginosa</em&gt; ou<em&gt; A. baumannii</em

Efficacy of candidate antibacterial treatments must be demonstrated in animal models of infection as part of the discovery and development process, ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute respiratory distress syndrome (ARDS), characterized by neutrophilic alveolitis, and injury to both alveolar epithelium and vascular endothelium. Clinically, ARDS is defined by acute onset of hypoxemia, bilateral patchy pulmonary infiltrates and non-cardiogenic pulmonary edema. Human studies have provided us with valuable information about the physiological and inflammatory changes in the lung caused by ARDS, which has led to various hypotheses about the underling mechanisms. Unfortunately, difficulties determining the etiology of ARDS, as well as a wide range of pathophysiology have resulted in a lack of critical information that could be useful in developing therapeutic strategies.
Translational animal models are valuable when their pathogenesis and pathophysiology accurately reproduce a concept proven in both in vitro and clinical settings. Although large animal models (e.g., sheep) share characteristics of the anatomy of human trachea-bronchial tree, murine models provide a host of other advantages including: low cost; short reproductive cycle lending itself to greater data acquisition; a well understood immunologic system; and a well characterized genome leading to the availability of a variety of gene deletion and transgenic strains. A robust model of low pH induced ARDS requires a murine ALI that targets mainly the alveolar epithelium, secondarily the vascular endothelium, as well as the small airways leading to the alveoli. Furthermore, a reproducible injury with wide differences between different injurious and non-injurious insults is important.
The murine gastric acid aspiration model presented here using hydrochloric acid employs an open tracheostomy and recreates a pathogenic scenario that reproduces the low pH pneumonitis injury in humans. Additionally, this model can be used to examine interaction of a low pH insult with other pulmonary injurious entities (e.g., food particles, pathogenic bacteria).

This protocol induces acute lung injury in a mouse that has close fidelity to the pathogenesis of acid pneumonitis observed in humans. We generate a maximal acute nonlethal low pH lung injury and account for differences in rodent-human anatomic respiratory structure using an open tracheostomy coupled with circumferential pressure release.

Abrir traqueostomia ácido gástrico aspiração Modelo murino de lesão pulmonar aguda Resultados em Maximal aguda não-letal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

Medicina

A Precise Pathogen Delivery and Recovery System for Murine Models of Secondary Bacterial Pneumonia

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, murine models of co-infection have been the primary tool developed to explore the pathologies of both the primary and secondary infections. Despite the prevalence of this model, considerable discrepancies regarding instillation procedures, dose volumes, and efficacies are prevalent among studies. Furthermore, these efforts have been largely incomplete in addressing how the pathogen may be directly influencing disease progression post-infection. Herein we provide a precise method of pathogen delivery, recovery, and analysis to be used in murine models of secondary bacterial pneumonia. We demonstrate that intratracheal instillation enables an efficient and accurate delivery of controlled volumes directly and evenly into the lower respiratory tract. Lungs can be excised to recover and quantify the pathogen burden. Following excision of the infected lungs, we describe a method to extract high quality pathogen RNA for subsequent transcriptional analysis. This procedure benefits from being a non-surgical method of delivery without the use of specialized laboratory equipment and provides a reproducible strategy to investigate pathogen contributions to secondary bacterial pneumonia.

Here, we present methods to improve secondary bacterial pneumonia studies by providing a non-invasive route of instillation into the lower respiratory tract followed by pathogen recovery and transcript analysis. These procedures are reproducible and can be performed without specialized equipment such as cannulas, guide wires, or fiber optic cables.

Um sistema de entrega e recuperação de patógenos precisos para modelos murinos de pneumonia bacteriana secundária

Secondary bacterial pneumonias following influenza infections consistently rank within the top ten leading causes of death in the United States. To date, ...

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic pathogen upon influenza A virus (IAV) infection. Advanced age enhances host susceptibility to secondary pneumococcal pneumonia and is associated with worsened disease outcomes. The host factors driving those processes are not well defined, in part due to a lack of animal models that reproduce the transition from asymptomatic colonization to severe clinical disease. 
This paper describes a novel mouse model that recreates the transition of pneumococci from asymptomatic carriage to disease upon viral infection. In this model, mice are first intranasally inoculated with biofilm-grown pneumococci to establish asymptomatic carriage, followed by IAV infection of both the nasopharynx and lungs. This results in bacterial dissemination to the lungs, pulmonary inflammation, and obvious signs of illness that can progress to lethality. The degree of disease is dependent on the bacterial strain and host factors. 
Importantly, this model reproduces the susceptibility of aging, because compared to young mice, old mice display more severe clinical illness and succumb to disease more frequently. By separating carriage and disease into distinct steps and providing the opportunity to analyze the genetic variants of both the pathogen and the host, this S. pneumoniae/IAV co-infection model permits the detailed examination of the interactions of an important pathobiont with the host at different phases of disease progression. This model can also serve as an important tool for identifying potential therapeutic targets against secondary pneumococcal pneumonia in susceptible hosts.

A Mouse Model for the Transition of Streptococcus pneumoniae from Colonizer to Pathogen upon Viral Co-Infection Recapitulates Age-Exacerbated Illness

This paper describes a novel mouse model for the transition of pneumococcus from an asymptomatic colonizer to a disease-causing pathogen during viral infection. This model can be readily adapted to study polymicrobial and host-pathogen interactions during the different phases of disease progression and across various hosts.

Um modelo de camundongo para a transição de Streptococcus pneumoniae de colonizador para patógeno após coinfecção viral recapitula a doença exacerbada pela idade

Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) is an asymptomatic colonizer of the nasopharynx in most individuals but can progress to a pulmonary and systemic ...

Experimental Model to Evaluate Resolution of Pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to high morbidity and mortality. Currently, there are no pre-clinical models that recapitulate the complexity of human ARDS. However, infectious models of pneumonia (PNA) can replicate the main pathophysiological features of ARDS. Here, we describe a model of PNA induced by the intratracheal instillation of live Streptococcus pneumoniae and Klebsiella pneumoniae in C57BL6 mice. In order to evaluate and characterize the model, after inducing injury, we carried out serial measurements of body weight and bronchoalveolar lavage (BAL) for measuring markers of lung injury. Additionally, we harvested lungs for cell count and differentials, BAL protein quantification, cytospin, bacterial colony-forming unit counts, and histology. Lastly, high dimensional flow cytometry was performed. We propose this model as a tool to understand the immune landscape during the early and late resolution phases of lung injury.

This manuscript describes the establishment of an infectious model of pneumonia in mice and the respective characterization of injury resolution along with methods for growing bacteria and intratracheal instillation. A novel approach using high-dimensional flow cytometry to evaluate the immune landscape is also described.

Modelo experimental para avaliar a resolução da pneumonia

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) causes acute lung injury, characterized by rapid alveolar damage and severe hypoxemia. This, in turn, leads to ...

Estabelecendo um modelo Lung-on-Chip para estudos de infecção respiratória

Immunocompetent Alveolus-on-Chip Model for Studying Alveolar Mucosal Immune Responses

We introduce an advanced immunocompetent lung-on-chip model designed to replicate the human alveolar structure and function. This innovative model employs a microfluidic-perfused biochip that supports an air-liquid interface mimicking the environment in the human alveoli. Tissue engineering is used to integrate key cellular components, including endothelial cells, macrophages, and epithelial cells, to create a representative tissue model of the alveolus. The model facilitates in-depth examinations of the mucosal immune responses to various pathogens, including viruses, bacteria, and fungi, thereby advancing our understanding of lung immunity. The primary goal of this protocol is to provide details for establishing this alveolus-on-chip model as a robust in vitro platform for infection studies, enabling researchers to closely observe and analyze the complex interactions between pathogens and the host's immune system within the pulmonary environment. This is achieved through the application of microfluidic-based techniques to simulate key physiological conditions of the human alveoli, including blood flow and biomechanical stimulation of endothelial cells, alongside maintaining an air-liquid interface crucial for the realistic exposure of epithelial cells to air. The model system is compatible with a range of standardized assays, such as immunofluorescence staining, cytokine profiling, and colony-forming unit (CFU)/plaque analysis, allowing for comprehensive insights into immune dynamics during infection. The Alveolus-on-chip is composed of essential cell types, including human distal lung epithelial cells (H441) and human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) separated by porous polyethylene terephthalate (PET) membranes, with primary monocyte-derived macrophages strategically positioned between the epithelial and endothelial layers. The tissue model enhances the ability to dissect and analyze the nuanced factors involved in pulmonary immune responses in vitro. As a valuable tool, it should contribute to the advancement of lung research, providing a more accurate and dynamic in vitro model for studying the pathogenesis of respiratory infections and testing potential therapeutic interventions.

Autor em destaque: Desenvolvendo um modelo microfluídico de pulmão em chip para estudo aprofundado da resposta imune humana e mecanismos de infecção

Lung-on-chip models surpass traditional 2D cultures by mimicking the air-liquid interface and endothelial cell perfusion, simulating blood flow and nutrient exchange crucial for lung physiology studies. This enhances lung research relevance, offering a dynamic, physiologically accurate environment to advance the understanding and treatment of respiratory infections.

Modelo Alveolus-on-Chip Imunocompetente para Estudo das Respostas Imunes da Mucosa Alveolar

We introduce an advanced immunocompetent lung-on-chip model designed to replicate the human alveolar structure and function. This innovative model employs ...

Modelo murino aspiração orofaríngea da Pneumonia bacteriana associada e hospitalares

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