Die Autoren möchten beim Aufbau der hier beschriebenen Methoden und G. Gagliardi und M. Garita für ihre kritischen Lektüre Goureau Team für ihre Beiträge danken. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), die Netzhaut Frankreich Association und der Technologietransfer Unternehmen SATT Lutech. Es wurde auch im Rahmen der LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) unterstützt durch die ANR programmintern Investissements Avenir (ANR-11-IDEX-0004-02) durchgeführt.

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen folgt den Richtlinien des Institut De La Vision forschungsethikkommission. Das Institut De La Vision wurde die Manipulation des menschlichen Probe gemäß der aktuellen französischen Verordnung zugelassen. Handhabung der Proben folgt Patientendaten Schutz im Einklang mit den Grundsätzen von Helsinki und nationalen Regelungen nach der ethischen Genehmigung des "Comité de Protection des Personnes (CPP) Ile V".
1. Vorbereitung der Kultur, Medien und Gerichte
<ol><li>
Kultur, Medien
	<ol>
<li>Verwenden Sie iPSC Medium, ein chemisch definiertes Medium pluripotente Stammzelle-Kultur im Feeder-freien Bedingungen16gewidmet. 500 mL Medium gemäß Protokoll des Herstellers vorbereiten.</li>
		<li>Verwendung basale iPSC (Bi) Medium definiert die iPSC chemisch Medium ohne Fibroblasten-Wachstumsfaktor 2 (FGF2) oder transformierende Wachstumsfaktor Beta (TGFß).</li>
		<li>Bereiten Sie 500 mL Bi Medium ergänzt mit Zuschlag von 1 % N2 (BiN2 Mittel), 10 Einheiten/mL Penicillin und 10 mg/mL von Streptomycin.</li>
		<li>Bereiten Sie 500 mL proneuronaler N2-basierte Medium (ProN2 Mittel), bestehend aus DMEM:Nutrient Mischung f-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamin), 1 % MEM nichtessentiellen Aminosäuren, Zuschlag von 1 % N2, 10 Einheiten/mL Penicillin und 10 mg/mL von Streptomycin vor.</li>
		<li>Bereiten Sie proneuronaler B27-basierte Medium (ProB27 Mittel) bestehend aus DMEM:Nutrient Mischung f-12 (DMEM/F12, 1:1, L-Glutamin), 1 % MEM nichtessentiellen Aminosäuren, 2 % B27 ergänzen, 10 Einheiten/mL Penicillin und 10 mg/mL von Streptomycin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur-Schiff-Vorbereitung
	<ol>
<li>
Für die menschlichen iPSC-Kultur
		<ol>
<li>Bereiten Sie 10 mL einer Vitronectin Lösung mit 5 μg/mL Vitronectin mit 1 X PBS-Puffer vor. Fügen Sie in 10 mL 1 X PBS 100 µL der Stammlösung aufgetauten Vitronectin (100 X).</li>
			<li>2 mL der Lösung pro 6 cm Kulturschale entspricht 0,5 µg/cm2Vitronectin zu verteilen. 1 h bei Raumtemperatur (RT) inkubieren. Entfernen Sie die Vitronectin-Lösung durch Absaugen mit einem Vakuum-Aspiration-System oder eine 5-mL-Pipette.</li>
			<li>4 mL iPSC Medium pro 6 cm Schale hinzugeben.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Gerichte in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 30 min vor Gebrauch.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Für die menschlichen iPSC gewonnenen RPE (HiRPE) Zellkultur</li>
		<li>Verwenden Sie pluripotente Stammzellen qualifiziert Matrix oder Substrat zur Beschichtung von Brunnen nach Protokoll des Herstellers. Fügen Sie ausreichend Matrix oder Substrat für das Wachstum der gesamten Fläche. Legen Sie beispielsweise 300 µL der Matrix pro Bohrloch in 24-Well-Platte und 3 mL Matrix in einem t-25 cm2 Kolben.</li>
		<li>Inkubieren Sie die beschichteten Kulturgefäße für ein Minimum von 1 h bei 37 ° c Entfernen Sie die Matrix mit Vakuum-Absaugsysteme oder eine 5-mL-Pipette.</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL des ProN2 Mediums pro Bohrloch auf 24-Well-Platten und das Kulturgefäß in den Inkubator für ein Minimum von 30 min bis warm und equilibrate das Medium zurück. Für t-25 cm2 Fläschchen siehe Punkt 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Wartung und Erweiterung der menschlichen iPSCs
<ol><li>
Aufrechterhaltung der menschlichen iPSCs
	<ol>
<li>Bereiten Sie 3 mL iPSC Medium in einer 15 mL Tube vor und halten Sie es für mindestens 15 Minuten vor der Verwendung bei RT. Bereiten Sie eine beschichtete 6-cm-Schüssel, wie in 1.2.1 beschrieben.</li>
		<li>Auftauen eine kryogene Stichprobe von menschlichen iPSCs aus einem flüssigen Stickstoff-Tank oder ein-150 ° C Gefrierschrank durch Inkubation in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 s.</li>
		<li>Desinfizieren Sie sorgfältig die kryogene Fläschchen mit einer Desinfektionslösung Spray. Übertragen Sie die aufgetauten menschlichen iPSCs von der Cryotube auf der 15 mL Tube mit 3 mL iPSC Medium bei RT vorgewärmt</li>
		<li>Zentrifuge das Rohr auf 110 X g für 3 min. Überstands durch Absaugen mit einem Vakuum-Aspiration-System oder eine 5-mL-Pipette entfernen</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit 1 mL der iPSC Medium aus der Vitronectin-beschichtete 6 cm Kulturschale mit einer 2 mL-Pipette und übertragen die Zellen wieder in die Schale. Das Gericht in den Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 24 h vor dem Ändern des Mediums zurück. Hinweis: Ein ROCK-Hemmer, z. B. Y-27632 bei 10 µM, kann auf das iPSC-Medium in der 6-cm-Kultur-Gerichte, Apoptose zu reduzieren hinzugefügt werden.</li>
		<li>Verändern Sie das Medium täglich und weitergeben Sie der menschlichen iPSCs jede Woche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Der menschliche iPSCs passagierung
	<ol>
<li>Übergeben Sie der menschlichen iPSC an einer 70-80 %-Mündung, klassisch nach 7 Tagen in der Kultur.</li>
		<li>Bereiten Sie 6 cm Gerichte für die passagierung wie unter Punkt 1.2.1 beschrieben. Das iPSC-Medium aus der Gerichte mit konfluierende iPSCs entfernen und Hinzufügen von 2 mL einer Dissoziation-Lösung für 6 min bei RT Hinweis: Die Inkubationszeit hängt die iPSC-Klone. Versuchen Sie eine 6 min Inkubation als Start.</li>
		<li>Entfernen Sie die Dissoziation-Lösung mit Vakuum-Absaugsysteme oder eine 5-mL-Pipette, und fügen Sie 2 mL iPSC Medium bei RT Aufschwemmen der iPSC-Kolonien vorgewärmt durch sie nach oben und unten 5-10 X mit einer 1.000 µL Pipette pipettieren. Achtung: Vermeiden Sie einzelne Zelle Dissoziation von übermäßigen pipettieren.</li>
		<li>30 bis 200 µL resuspendierte Zelle Klumpen in einer neuen 6-cm-Kulturschale zu übertragen. Die Gerichte in der Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für mindestens 24 h vor dem Ändern des Mediums zurück. Hinweis: Das Volumen der resuspendierte Zelle Klumpen benötigt für die passagierung richtet sich nach der iPSC-Klone.</li>
		<li>Verändern Sie das Medium täglich und weitergeben Sie der menschlichen iPSCs jede Woche.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Generation der Netzhaut Organellen
<ol><li>Starten Sie die iPSC-Differenzierung nach dem Protokoll schematisiert in Figur 1A , wenn die Kolonien einen Zusammenfluss von 60-70 % (Abbildung 1 b) erreichen.</li>
	<li>4 mL Bi Medium pro 6-cm Schüssel vorbereiten. Das Bi-Medium auf 37 ° c warm Verändern Sie das iPSC-Medium Bi Medium. Beachten Sie dieses Mal als Tag 0 (D0).</li>
	<li>Bei D2 wechseln Sie die Kulturen in der Bi-Medium zu einem BiN2 Medium, zuvor bei 37 ° c erwärmt Verändern Sie alle 2-3 Tage das Medium.</li>
	<li>Emergente Self bildende retinale Organellen durch Neuroepithelium Knospen, zu identifizieren, wie in Abbildung 1 dargestellt -1E. Hinweis: Diese frühen retinalen Organellen, entspricht in ihrer Entwicklungsphase Optik Cup, können manuell für nachgeschaltete Experimente isoliert werden.</li>
</ol>(4) die Reifung der Netzhaut Organellen
<ol><li>Bereiten Sie am D28, 6-Well-Platten mit 4 mL/Well des ProB27 Mediums zunächst mit 10 ng/mL des FGF2 ergänzt (Abb. 1A). Hinweis: Fügen Sie FGF2 hinzu, unmittelbar vor die Medien zu den Platten hinzugefügt werden. Achtung: Filtern Sie FGF2 nicht.</li>
	<li>Die retinalen Strukturen manuell von der 6-cm-Gerichte zu erholen. Um dies zu tun, isolieren Sie die Strukturen machen senkrechte Rillen mit der Nadel um die Gliazellen Knospe zu, wie in Abbildung 1Egezeigt, und lösen Sie die Organellen durch Kratzen sie vorsichtig mit der Nadel.</li>
	<li>10-15 Organellen mit einer 1.000 µL Pipette abzusaugen und in einem einzigen Brunnen von der 6-Well-Platte mit ProB27 Medium zu übertragen.</li>
	<li>Halten Sie die Netzhaut Organellen in schwimmenden Kulturbedingungen in ProB27 Medium in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 2-3 Tage. Hinweis: Behandeln Sie die Organellen mit FGF2 bis D35.</li>
	<li>D35 nehmen Sie die Hälfte des Mediums und fügen Sie frisches vorgewärmte ProB27-Medium bei 37 ° C ohne FGF2.</li>
	<li>Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 2-3 Tage während der Zeit erforderlich, um die gewünschte retinalen Zelltypen nach der Entstehung des retinalen Zelltypen zu erhalten, wie in Abbildung 2dargestellt.</li>
</ol>5. Erzeugung und Verstärkung der menschlichen iPSC gewonnenen RPE (HiRPE) Zellen
<ol><li>
Generation von menschlichen HiRPE Zellen
	<ol>
<li>Die iPSCs in Abgrenzung zu engagieren, wenn die Kolonien einen Zusammenfluss von 60-70 %, nach dem Protokoll schematisiert in Abbildung 3Aerreichen.</li>
		<li>4 mL pro 6-cm-Schüssel Bi Medium vorzubereiten und das Bi-Medium bei 37 ° c warm Verändern Sie das iPSC-Medium Bi Medium. Beachten Sie dieses Mal als Tag 0 (D0).</li>
		<li>Bei D2 wechseln Sie die Kulturen Mittel-und Bi BiN2 Medium zuvor bei 37 ° c erwärmt Verändern Sie alle 2-3 Tage das Medium.</li>
		<li>D28 ändern Sie das Medium zu einem frischen ProN2 Medium zuvor bei 37 ° C erwärmt, wie in Abbildung 3Adargestellt. Hinweis: Dieser Schritt kann nach der organoide Ernte in Schritt 4 beschrieben erfolgen.</li>
		<li>Ändern Sie das ProN2 Medium alle 2-3 Tage.</li>
		<li>D42 erkennen Sie emergent HiRPE Zellen durch die Beobachtung der pigmentierten Flecken wie in Abb. 3 bgezeigt. Hinweis: Die Pigmentierung von HiRPE Zellen erscheint zwischen D35, D56 je nach iPSC-Klone.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verstärkung der HiRPE Zellen
	<ol>
<li>Am D42 bereiten Sie eine 24-Well-Platte zuvor beschichtet mit der Matrix wie in Schritt 1.2.2 beschrieben und enthält 1 mL des ProN2 Mediums pro Bohrloch vor. Platzieren Sie die Platte für 15 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 vor Gebrauch.</li>
		<li>Die HiRPE-Patches manuell von der 6-cm-Schüssel zu erholen. Um Patches zu isolieren, machen Sie eine senkrecht Rasterung mit der Nadel um die pigmentierten Epithel und lösen Sie das Blatt durch kratzen es vorsichtig mit der Nadel zu. 10 pigmentierte Flecken mit einer 1.000 µL Pipette abzusaugen und in einem einzigen gut 24-Well-Platte zu übertragen.</li>
		<li>Halten Sie die HiRPE-Patches in ProN2 Medium in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h vor dem Ändern des Mediums. Beachten Sie diese HiRPE Zelle Passage als 0 (hiRPEp0). Verändern Sie das Medium alle 2-3 Tage mit ProN2 Medium.</li>
		<li>Übergeben Sie die hiRPEp0 Zellen, wenn die Zellen konfluierende sind.<ol>
<li>Entfernen Sie das Medium mit Vakuum-Absaugsysteme und waschen Sie jeweils gut 1 X mit 1 mL PBS mit einer 5 mL-Pipette zu.</li>
			<li>Entsorgen Sie die PBS mit Vakuum-Absaugsysteme, fügen Sie 200 µL pro Bohrloch von 0,25 % Trypsin und mindestens 15 min. im Inkubator bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie 800 µL des ProB27 Mediums, die Trypsin zu inaktivieren. Hinweis: Die Verwendung des ProN2 Mediums zu stoppen die Trypsin-Aktivität wird nicht empfohlen.</li>
			<li>Trennen Sie das Blatt der HiRPE Zellen durch pipettieren es rauf und runter. Legen Sie die Zellsuspension in einer 15 mL Tube und für 5 min bei 110 X g zentrifugieren. Hinweis: Eine zusätzliche Wäsche kann mit ProN2 Medium zu entfernen, die Überschreitung des ProB27 Mediums erfolgen.</li>
			<li>Entfernen Sie den überstand und sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL ProN2-Medium bei 37 ° c vorgewärmt Zählen Sie die Zellen mit einer Zelle Zähler.</li>
			<li>1,25 Millionen Zellen und legen Sie sie in einem Matrix-beschichtete t-25 cm2 Kolben (siehe Punkt 2.2.2), enthält 5 mL ProN2-Medium bei 37 ° c vorgewärmt Beachten Sie diese HiRPE Zelle Passage als 1 (hiRPEp1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Halten Sie die HiRPE Zellen im ProN2 Medium in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h vor dem Ändern des Mediums.</li>
		<li>Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Wenn die hiRPEp1 Zellen Zusammenfluss erreichen, führen Sie den nächsten Durchgang oder Kryokonservierung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. die Kryokonservierung von Retinal Organellen und HiRPE Zellen
<ol><li>
Für die gesamte Netzhaut Organellen
	<ol>
<li>Wählen Sie 5 bis 20 retinale Organellen mit einem transferpipette und legen Sie sie in einem kryogenen Fläschchen. Jedes überschüssige Medium mit einer 1.000 µL Pipette zu entfernen, ohne Berührung der Organellen am unteren Ende der Röhre und fügen Sie 250 µL kalter Kryokonservierung Medium (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Frieren Sie den Fläschchen in einem Isopropanol-basierte Einfrieren Behälter bei-80 ° C für mindestens 4 Std. Transfer die gefrorenen Fläschchen zu einem-150 ° C Gefrierschrank oder flüssigem Stickstoff-Tank für langfristige Lagerung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE Zellen
	<ol>
<li>Distanzieren Sie in der Passage 1 die HiRPE Zellen wenn die Zellen konfluierende sind. Hinweis: Eine Kryokonservierung von hiRPEp0 Zellen wird nicht empfohlen.</li>
		<li>Aspirieren Sie das Medium aus der t-25 cm2 Flasche mit Vakuum-Absaugsysteme und waschen Sie es 1 X mit 3 mL PBS mit einer 5 mL-Pipette.</li>
		<li>Entfernen Sie die PBS mit Vakuum-Absaugsysteme, fügen Sie 1 mL Trypsin 0,25 % und mindestens 15 min. im Inkubator bei 37 ° c inkubieren Fügen Sie 5 mL des ProB27 Mediums, die Trypsin-Aktivität zu stoppen. Hinweis: Die Verwendung des ProN2 Mediums, Trypsin zu inaktivieren wird nicht empfohlen.</li>
		<li>Trennen Sie das Blatt der HiRPE Zellen durch nach oben und unten mit einer 10 mL-Pipette pipettieren. Zählen Sie die Zellen mit Zelle Zähler. Legen Sie die Zellsuspension in einer 15 mL Tube und für 5 min bei 110 X g zentrifugieren. Hinweis: Eine zusätzliche Wäsche kann mit ProN2 Medium zu entfernen, die Überschreitung des ProB27 Mediums erfolgen.</li>
		<li>Aspirieren Sie des Überstands mit Vakuum-Aspiration und Aufschwemmen Sie sanft Zellen um 2 Millionen Zellen in 250 µL der Kryokonservierung Medium zu erhalten.</li>
		<li>250 µL Zellsuspension pro kryogenen Fläschchen zu übertragen. Die Fläschchen in einem Isopropanol-basierte Einfrieren Behälter bei-80 ° C für mindestens 4 Stunden einfrieren.</li>
		<li>Übertragen Sie die gefrorenen Fläschchen auf-150 ° C Gefrierschrank oder ein flüssiger Stickstoff-Tank für die Langzeitspeicherung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) Auftauen von Retinal Organellen und HiRPE Zellen
<ol><li>
Auftauen der gesamten Netzhaut Organellen
	<ol>
<li>Warm ProB27-Medium bei 37 ° C (2 mL wird für jedes kryogenen Fläschchen verlangt werden).</li>
		<li>Tauen Sie aus dem flüssigen Stickstoff-Tank oder-150 ° C Gefrierschrank eine kryogene Fläschchen mit retinalen Organellen in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 S. desinfizieren die kryogene Fläschchen vorsichtig mit einer Desinfektionslösung Spray auf.</li>
		<li>Öffnen Sie das Fläschchen und 1 mL vorgewärmten ProB27 Medium. Übertragen Sie die Organellen auf einen 1,5 mL-Tube mit einer transferpipette.</li>
		<li>Entfernen Sie das Medium sanft ohne Berührung der retinalen Strukturen an der Unterseite des Rohres pipettieren. Waschen Sie die Organellen 1 mehr Zeit mit 1 mL des Mediums vorgewärmten ProB27.</li>
		<li>Aspirieren der Organellen mit einem transferpipette und legen Sie sie in 1 auch von einer 6-Well-Platte mit ProB27 Medium vorgewärmt und in einem Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2equilibriert. Hinweis: Platzieren Sie 10-15 retinale Organellen pro Bohrloch einer 6-Well-Platte.</li>
		<li>Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 2-3 Tage während der Zeit benötigt um die gewünschte retinalen Zelltypen nach ihrer Entstehung zu erhalten, wie in Abbildung 2beschrieben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auftauen von HiRPE Zellen
	<ol>
<li>Warm ProN2-Medium bei 37 ° C (8 mL wird für jedes kryogenen Fläschchen verlangt werden).</li>
		<li>Aus dem flüssigen Stickstoff-Tank oder-150 ° C Gefrierschrank Auftauen einer kryogenen Stichprobe von hiRPEp1 Zellen durch eine Inkubation in einem Wasserbad bei 37 ° C für 30 S. desinfizieren die kryogene Ampulle sorgfältig mit Desinfektionslösung Spray.</li>
		<li>Öffnen Sie die Tube und fügen Sie 1 mL vorgewärmten ProN2 Medium und übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 15 mL Röhrchen mit 2 mL vorgewärmten ProN2 Medium. Für 5 min bei 110 X g zentrifugieren.</li>
		<li>Entfernen Sie den überstand und sanft Aufschwemmen der Zelle Pellet in 2 mL ProN2-Medium bei 37 ° c vorgewärmt</li>
		<li>Zählen Sie die Zellen mit einer Zelle Zähler.</li>
		<li>1,25 Millionen Zellen nehmen und legen Sie sie in der Matrix-beschichtete t-25 cm2 Kolben (siehe Punkt 2.2.2), enthält 5 mL ProN2-Medium bei 37 ° c vorgewärmt Beachten Sie in diesem Stadium die Passage als 2 (hiRPEp2).</li>
		<li>Halten Sie die hiRPEp2-Zellen in ProN2 Medium in die Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2 für 48 h vor dem Ändern des Mediums.</li>
		<li>Wechseln Sie das Medium alle 2-3 Tage. Wenn die HiRPE Zellen Zusammenfluss erreichen, führen Sie den nächsten Durchgang oder Kryokonservierung. Hinweis: Nach 2 Wochen in Kultur, können 8 Millionen HiRPE Zellen für weitere Experimente gesammelt werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium.">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li></ol>

Sacha Reichman, Olivier Goureau und José-Alain Sahel sind Erfinder auf angemeldete Patente im Zusammenhang mit der Erzeugung von netzhautzellen aus menschlicher pluripotenter Stammzellen.

Dieses Protokoll beschreibt die RPE-Zellen und Netzhaut Organellen mit retinalen Routinggruppenconnectors und Photorezeptoren, aus menschlicher pluripotenter Stammzellen im Xeno frei und Feeder Bedingungen produzieren. Kompatibel mit der Good Manufacturing Practice (GMP), die Methode kultiviert hier vorgestellten ermöglicht eine große Produktion von iPSC-abgeleitete netzhautzellen RPE Zellen Routinggruppenconnectors und Photorezeptoren für die Entwicklung der stammzellbasierte Therapien und Medikamenten Entdeckung-Ans...

Die Netzhaut ist Bestandteil des zentralen Nervensystems (ZNS) und hat eine begrenzte Kapazität, spontan nach einer traumatischen Verletzung oder Krankheiten zu regenerieren. Daher führen degenerative Pathologien verursachen definitive retinalen Zellverlust, wie Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), Retinitis Pigmentosa (RP), Glaukom und Diabetische Retinopathie, in der Regel zur irreversiblen Erblindung. Rettung der degenerierten Netzhaut ist eine große Herausforderung für die stammzellbasierte Therapien mit dem Ziel, ersetzen Sie die beschädigten oder verloren gegangene Zellen eine der vielversprechendsten Ansätze1,2,3 sind. Pluripotente Stammzellen als menschlicher embryonaler Stammzellen (WSR) Zellen oder Mensch-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben die Fähigkeit, auf unbestimmte Zeit in Kultur erweitert werden, und sie haben das Potenzial, alle Arten von Zellen zu produzieren. Fortschritte im Verständnis der retinalen Entwicklung und die Verbesserung der in-vitro- Protokolle für menschlichen iPSC Differenzierung führten zu der Generation von retinalen Organellen7,8,9, 10,11,12. Alle wichtigen retinalen Zellen, einschließlich der retinalen Ganglienzellen (Routinggruppenconnectors), Photorezeptoren und Netzhaut pigmentiert (RPE) Epithelzellen, haben erfolgreich unterschieden von menschlichen WSR und iPSCs4,5, 6. basierend auf der SFEB (serumfreien Kultur Embryoid Körper-wie Aggregate)-Methode, entwickelt von Eiraku Et Al. 13, erhalten Sie zur Bildung von retinalen Organellen von ESC oder iPSC abgeleitet Embryoid Körper-ähnlichen Aggregaten in definierten extrazelluläre Matrix Komponenten7,10,14. Aber diese Protokolle sind kompliziert, erfordert eine große Anzahl von Schritten nicht immer kompatibel mit der Großserienfertigung von Zellen für therapeutische Ansätze oder Drogen-Screening. So, die Wahl der Methode, menschliche netzhautzellen zu produzieren ist von entscheidender Bedeutung und die Methode muss robuste, skalierbare und effizient sein.
Hier, beschreiben basierend auf unseren vorherigen Veröffentlichung15, wir alle notwendigen Schritte für eine einfache und effiziente Generation von netzhautzellen durch Netzhaut organoide Self Bildung von anhaftenden menschlichen iPSCs in einem Feeder frei und Xeno Zustand gepflegt. Ausgehend von routinemäßigen Kulturen der anhaftende menschliche iPSCs, erfordert dieses Protokoll nur eine einfache aufeinanderfolgenden Medium ändern, um die Erzeugung von iPS-gewonnenen RPE (HiRPE) Zellen und neuroretinale Strukturen in 4 Wochen zu ermöglichen. Nach einer manuellen Isolierung HiRPE erweitert werden kann und die Netzhaut Strukturen können gezüchtet werden, als schwimmende Organellen wo sind die retinale Vorläuferzellen in alle retinale Zelltypen in einer sequentiellen Reihenfolge Einklang mit der in-Vivo -Mensch zu unterscheiden Retinogenesis. Zu guter Letzt für Forschung Fortschritt oder Übersetzung klinischer beschreiben wir eine Kryokonservierung Methode ermöglicht die langfristige Lagerung der gesamten Netzhaut Organellen und HiRPE Zellen ohne Beeinträchtigung ihrer phänotypischen Eigenschaften und Funktionalität.

<table><tbody><tr><td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td>Coating</td></tr><tr><td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>Coating</td></tr><tr><td>Essential 8 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>medium</td></tr><tr><td>Essential 6 Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>medium</td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>supplement</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>supplement</td></tr><tr><td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>supplement CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>medium</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140035</td><td>supplement</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>antibiotic</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>dissociation solution</td></tr><tr><td>Cryostem Freezing Media</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D</td><td>Cryopreservation medium</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Xeno free</td></tr><tr><td>AGANI needle 23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td>Needle</td></tr><tr><td>Flask 25 cm&amp;sup2; Tissue Culture Treated</td><td>Falcon</td><td>353109</td><td>T-25 cm&amp;sup2;</td></tr><tr><td>24 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>24-well plate</td></tr><tr><td>6 well plate Tissue Culture Treated</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>6-well plate</td></tr></tbody></table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

Die Produktion von spezialisierten Zellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein leistungsstarkes Tool, um neue Ansätze für die regenerative Medizin zu entwickeln. Die Verwendung von Human-induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) ist besonders attraktiv für Neurodegenerative Krankheit Studien, einschließlich retinale Dystrophien, wo mark iPSC-abgeleitete retinalen zellmodelle einen großen Schritt nach vorn zu verstehen und zu bekämpfen Blindheit. In diesem Artikel beschreiben wir eine einfache und skalierbare Protokoll zu generieren, Reifen und Tiefgefrieren retinale Organellen. Basierend auf mittlere ändern, der Hauptvorteil dieser Methode ist es, mehrere zu vermeiden und zeitaufwändigen Schritte häufig in eine geführte Differenzierung der iPSCs erforderlich. Imitiert die frühen Phasen der retinalen Entwicklung durch aufeinander folgende Veränderungen der definierten Medien auf anhaftende menschlichen iPSC Kulturen, dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Erzeugung von selbst-Bildung neuroretinale Strukturen und Netzhaut pigmentiert (RPE) Epithelzellen in eine reproduzierbare und effiziente Weise in 4 Wochen. Diese Strukturen mit retinale Vorläuferzellen (RPCs) können für die weitere Reifung in einem schwimmenden Kultur Zustand ermöglicht die Differenzierung von RPCs in sieben retinalen Zelltypen im Erwachsenen menschlichen Netzhaut leicht isoliert werden. Darüber hinaus beschreiben wir schnelle Methoden für die Kryokonservierung von retinalen Organellen und RPE-Zellen für die langfristige Lagerung. Die hier beschriebenen Methoden werden miteinander kombiniert, zu produzieren und bank menschlichen iPSC-abgeleitete retinalen Zellen oder Gewebe für Grundlagenforschung und klinische Forschung nützlich.

Der erste Schritt zur menschlichen iPSC Differenzierung im Feeder-freien Bedingungen16 angebaut ist zum Herunterfahren Selbsterneuerung Maschinen mit Bi-Medium um zu ermutigen, eine spontane Differenzierung (Abbildung 1A). Dann, bei D2, das Bi-Medium wird ergänzt mit eine N2-Ergänzung zur differenzierenden iPSCs Zellen in Richtung der neuronalen und Netzhaut Linien führen. Dieser Prozess führt zum Auftreten von neuroretinale Knospe...

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Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K Aufrufe.  Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France. Die Produktion von spezialisierten netzhautzellen aus pluripotenten Stammzellen ist ein Wendepunkt in der Entwicklung der Stammzell-Therapie für Erkrankungen der Netzhaut. Der vorliegende Beitrag beschreibt eine einfache Methode für eine effiziente Erzeugung von retinalen Organellen und retinalen Pigment Epithel für Grund-, translationalen und klinischen Forschung.

Serie: Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...

Feeder-Free Adaptation, Culture and Passaging of Human IPS Cells using Complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem cells has created a valuable new source of pluripotent cells for drug discovery, cell therapy, and basic research.
GIBCO media and reagents have been at the forefront of pluripotent stem cell research for years. Knockout DMEM supplemented with Knockout Serum Replacement is the media of choice for embryonic stem cell growth and now iPS cell culture 3-9. This gold standard media system can now be used for feeder-free culture with the addition of Knockout SR Growth Factor Cocktail.
Traditional human ES and iPS cell culture methods require the use of mouse or human fibroblast feeder layers, or feeder-conditioned medium. These culture methods are labor-intensive, hard to scale and it is difficult to maintain hiPS cells undifferentiated due to the undefined conditions. Invitrogen has developed Knockout SR Growth Factor Cocktail to allow you to easily transition your hiPS cell cultures to feeder-free while still maintaining your use of Knockout SR.

The following protocol provides instruction for adapting human induced Pluripotent Stem (iPS) Cells to feeder-free culture using complete KnockOut Serum Replacement Feeder-Free medium (KSR-FF). Once adapted, instructions for continual maintenance are also provided.

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

The discovery in 2006 that human and mouse fibroblasts could be reprogrammed to generate iPS cells 1-3 with qualities remarkably similar to embryonic stem ...

Biologie

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority of RP patients have progressive photoreceptor degeneration leading to peripheral vision loss, night blindness, and finally, total blindness. To date, thousands of mutations in more than 90 genes have been reported to be associated with RP. Currently, there are few animal models available for all the affected genes and different types of mutations, which largely hampers the deciphering of the mechanisms underlying the gene/mutation pathology and limits treatment and drug development. Patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids (ROs) have provided a better system to model the human early-onset disease than cells and animals. In order to study RP, those patient-derived 3D retinal organoids were utilized to recapitulate the clinical phenotypes of RP. In the RP patient-derived ROs, Rhodopsin mislocalization was clearly displayed. Compared with other animal models, patient iPSC-derived retinal organoid models more closely recapitulated RP features and represent an ideal approach for investigating the disease pathogenesis and for drug development.

In this protocol, retinitis pigmentosa patient induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived 3D retinal organoids were generated. Those organoids successfully recapitulated some clinical phenotypes of the retinitis pigmentosa disease.

Retinitis pigmentosa (RP) is a rare and inherited retinal degenerative disease with a prevalence of approximately 1/4,000 people worldwide. The majority ...

Generation of Retinal Organoids from Healthy and Retinal Disease-Specific Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative therapies. This protocol describes a simpler, robust, and stepwise method of generating retinal organoids in a hybrid culture system consisting of adherent monolayer cultures during the first 4 weeks of retinal differentiation till the emergence of distinct, self-organized eye field primordial clusters (EFPs). Further, the doughnut-shaped, circular, and translucent neuro-retinal islands within each EFP are manually picked and cultured under suspension using non-adherent culture dishes in a retinal differentiation medium for 1-2 weeks to generate multilayered 3D optic cups (OC-1M). These immature retinal organoids contain PAX6+ and ChX10+ proliferating, multipotent retinal precursors. The precursor cells are linearly self-assembled within the organoids and appear as distinct radial striations. At 4 weeks after suspension culture, the retinal progenitors undergo post-mitotic arrest and lineage differentiation to form mature retinal organoids (OC-2M). The photoreceptor lineage committed precursors develop within the outermost layers of retinal organoids. These CRX+ and RCVRN+ photoreceptor cells morphologically mature to display inner segment-like extensions. This method can be adopted for generating retinal organoids using human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). All steps and procedures are clearly explained and demonstrated to ensure replicability and for wider applications in basic science and translational research.

This protocol describes an efficient method of differentiating hiPSCs into eye field clusters and generating neuro-retinal organoids using simplified culture conditions involving both adherent and suspension culture systems. Other ocular cell types, such as the RPE and corneal epithelium, can also be isolated from mature eye fields in retinal cultures.

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Pluripotent stem cells can generate complex tissue organoids that are useful for in vitro disease modeling studies and for developing regenerative ...

Verbesserte 3D-Differenzierung der neuronalen Netzhaut von menschlichen embryonalen Stammzellen

Generating Neural Retina from Human Pluripotent Stem Cells

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of retinopathy. Unfortunately, ethical barriers hinder the collection of evidence from humans. Recently, numerous studies have shown that human pluripotent stem cells (PSCs) can be differentiated into retinal organoids (ROs) using different induction protocols, which have enormous potential in retinopathy for disease modeling, drug screening, and stem cell-based therapies. This study describes an optimized induction protocol to generate neural retina (NR) that significantly reduces the probability of vesiculation and fusion, increasing the success rate of production until day 60. Based on the ability of PSCs to self-reorganize after dissociation, combined with certain complementary factors, this new method can specifically drive NR differentiation. Furthermore, the approach is uncomplicated, cost-effective, exhibits notable repeatability and efficiency, presents encouraging prospects for personalized models of retinal diseases, and supplies a plentiful cell reservoir for applications such as cell therapy, drug screening, and gene therapy testing.

Autor im Rampenlicht: Einfache und effiziente Produktion von neuronalen Netzhaut-Organoiden für die Modellierung von Krankheiten

The present protocol describes an optimized 3D neural retina induction system that reduces the adhesion and fusion of retinal organoids with high repeatability and efficiency.

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Retinopathy is one of the main causes of blindness worldwide. Investigating its pathogenesis is essential for the early diagnosis and timely treatment of ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

Definierten Xeno-frei und Feeder-freie Kulturbedingungen für die Generation der menschlichen iPSC-abgeleitete Retinal Zellmodellen

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Feeder-freie Adaption, Kultur und Passagierung der Menschenrechte iPS-Zellen mit Komplett KnockOut Serum Ersatz Feeder-freiem Medium

Generation of Human Patient iPSC-derived Retinal Organoids to Model Retinitis Pigmentosa

Erzeugung retinaler Organoide aus gesunden und netzhautspezifischen, human-induzierten pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Erzeugung neuronaler Netzhaut aus humanen pluripotenten Stammzellen

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen