저자는 그들의 중요 한 독서에 대 한 여기에 설명 된 방법 및 G. Gagliardi M. Garita의 설치 하는 동안 그들의 입력에 대 한 Goureau의 팀의 일원을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 ANR에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), 망막 프랑스 협회와 기술 이전 회사 SATT Lutech. 그것은 또한 Investissements d'Avenir 프로그램 (ANR-11-IDEX-0004-02) 내에서 ANR에서 지 원하는 LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65)의 프레임에서 수행 되었다.

이 문서에 설명 된 프로토콜 인 라 드 비전의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 인 드 라 비전 현재 프랑스 규칙에 따르면 인간의 표본 조작을 허용 되었습니다. 표본 처리는 "위원회 회의 드 보호 des Personnes (CPP) Ile-de-France V의" 윤리적인 승인 후 헬싱키의 신조에 따라 환자 데이터 보호 및 국가 규정을 따른다.
1입니다. 문화 미디어 및 요리 준비
<ol><li>
문화 미디어
	<ol>
<li>IPSC 매체, 피더 무료 조건16pluripotent 줄기 세포 문화에 전념 화학적으로 정의 된 매체를 사용 합니다. 제조 업체의 프로토콜에 따라 매체의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>사용 기저 iPSC (Bi) 매체는 iPSC 화학적으로 섬유 아 세포 성장 인자 2 (FGF2) 또는 변형 시키는 성장 인자 Beta (TGFß) 없이 매체를 정의합니다.</li>
		<li>1% n 2 보충 (BiN2 매체), 보충 하는 양방향 매체의 500 mL를 준비, 페니실린과 스의 10 mg/mL의 10 단위/mL.</li>
		<li>Proneural n 2 기반 매체 (ProN2 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산, 1% n 2 보충, 페니실린, 10 단위/mL 고 10 mg/mL 스의 구성의 500 mL를 준비 합니다.</li>
		<li>Proneural B27 기반 매체 (ProB27 매체) DMEM:Nutrient 혼합물 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1 %MEM 불필요 한 아미노산의 구성 준비, 2 %B27 보충, 페니실린의 10 단위/mL와 10 mg/mL의 스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
문화 선박 준비
	<ol>
<li>
인간의 iPSC 문화에 대 한
		<ol>
<li>1 x PBS에 vitronectin의 5 μ g/mL를 포함 하는 vitronectin 솔루션의 10 mL를 준비 합니다. 1 x PBS의 10 ml, 해 동된 vitronectin 재고 솔루션 (100 x) 100 µ L를 추가 합니다.</li>
			<li>0.5 µ g/c m2에 해당 하는 6 cm 문화 접시 당 vitronectin 솔루션의 2 개 mL를 배포 합니다. 실 온 (RT)에서 1 시간을 위해 그것을 품 어. 포부 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 vitronectin 솔루션을 제거 합니다.</li>
			<li>6 cm 접시 당 iPSC 매체의 4 mL를 추가 합니다.</li>
			<li>사용 하기 전에 30 분의 최소 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에서 요리를 품 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>IPSC 파생 RPE (hiRPE) 세포 문화에 대 한</li>
		<li>만능 줄기 세포 자격 매트릭스 또는 기판에 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜에 따라 웰 스 코트. 충분 한 매트릭스 또는 기판 전체 성장 표면 영역을 커버를 추가 합니다. 예를 들어 잘 24-잘 접시와 T-25 cm2 플라스 크에 매트릭스의 3 mL 당 매트릭스의 300 µ L를 넣어.</li>
		<li>37 ° c.에서 1 h의 최소 코팅된 문화 혈관을 품 어 진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 매트릭스를 제거 합니다.</li>
		<li>24-잘 접시에 잘 당 ProN2 매체의 1 mL을 추가 하 고 따뜻하고 매체 equilibrate 30 분의 최소 인큐베이터에 문화 선박을 반환 합니다. T-25 cm2 플라스 크, 단계 5.2 참조.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 유지 보수 및 확장의 인간의 Ipsc
<ol><li>
인간의 Ipsc의 유지 보수
	<ol>
<li>15 mL 튜브에서 iPSC 매체의 3 mL를 준비 하 고 사용 하기 전에 15 분의 최소 RT에서 그것을 유지. 1.2.1에 설명 된 대로 코팅된 6 cm 접시를 준비 합니다.</li>
		<li>액체 질소 탱크 나는-150 ° C 냉동 고에서 인간의 Ipsc의 극저온 샘플 30 37 ° C에서 물 욕조에 부 화에 의해 해 동 s.</li>
		<li>신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병 소독. 실시간에서 미리 예 열 하는 iPSC 매체의 3 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에는 cryotube에서 해 동된 인간의 Ipsc를 전송</li>
		<li>원심 분리기 튜브 110 x g에서 3 분에 대 한 포부는 진공 포부 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 여는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>IPSC 2 mL 피 펫을 사용 하 여 6 cm 문화 vitronectin 코팅 접시에서 매체의 1 mL와 함께 셀 펠 릿을 resuspend 하 고 다시 접시에 셀을 전송. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: 10 µ M에 Y-27632 등 록 억제제 apoptosis를 줄이기 위해 6 cm 문화 요리에서 iPSC 매체에 추가할 수 있습니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인간의 Ipsc의 뿌리고
	<ol>
<li>고전적인 7 일 후에 문화는 70-80% 합류에 인간의 iPSC를 전달 합니다.</li>
		<li>1.2.1 단계에서 설명한 대로 뿌리고 6 cm 요리 준비. Confluent Ipsc와 요리에서 iPSC 매체를 제거 하 고 실시간에서 6 분 분리 솔루션의 2 개 mL를 추가 참고: 보육 시간 iPSC 클론에 따라 달라 집니다. 시작으로 6 분 외피를 보십시오.</li>
		<li>진공 흡입 시스템 또는 5 mL 피 펫을 사용 하 여 분리 솔루션을 제거 하 고 iPSC 매체의 2 mL 미리 따뜻하게 실시간 Resuspend에서 iPSC 식민지 1000 µ L 피 펫과 그들을 5-10 x 위아래로 pipetting 추가. 주의: 과도 한 pipetting에서 단일 셀 분리를 하지 마십시오.</li>
		<li>새로운 6 cm 문화 접시에 resuspended 세포 덩어리의 30 ~ 200 µ L를 전송 합니다. 매체를 변경 하기 전에 최소 24 시간에서 37 ° C, 5% CO2 셀 문화 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: resuspended 셀 덩어리를 뿌리고에 필요한 양의 iPSC 클론에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>매일 매체를 변경 하 고 통과 인간의 Ipsc 매주.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다. 망막 Organoids 세대
<ol><li>그림 1A 에서 도식화 식민지 60-70% 합류 (그림 1B)에 도달 하는 프로토콜에 따라 iPSC 차별화를 시작 합니다.</li>
	<li>6 cm 접시 당 Bi 매체의 4 mL를 준비 합니다. 37 ° c 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
	<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 BiN2 중간, 37 ° c.에 이전 예 열 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
	<li>그림 1C 와 같이 긴급 자체 형성 망막 organoids neuroepithelium 싹에 의해 식별 -1E. 참고:이 초기 망막 organoids, 시 컵에 그들의 발달 단계에서 해당 수동으로 다운스트림 실험에 대 한 격리 수 있습니다.</li>
</ol>4입니다. 망막 Organoids의 성숙
<ol><li>D28에서 6 잘 플레이트 포함 ProB27 매체 10 ng/mL FGF2의 처음 보충의 4 mL/잘 준비 (그림 1A). 참고: 추가 FGF2 즉시 미디어 판에 추가 됩니다. 주의: FGF2 필터링 하지 않습니다.</li>
	<li>6 cm 요리에서 망막 구조를 수동으로 복구 합니다. 이렇게 하려면 그림 1E, 같이 neuroepithelial 새싹 주위 바늘 수직 강선을 만드는 구조를 분리 하 고 부드럽게 바늘 긁는 organoids을 분리 합니다.</li>
	<li>10-15 organoids 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 ProB27 매체를 포함 하는 6 잘 플레이트의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
	<li>37 ° C, 5% CO2에서 셀 문화 인큐베이터에서 ProB27 매체에 부동 문화 조건에서 망막 organoids를 유지. 매체의 2-3 일 마다 변경 합니다. 참고: D35까지 FGF2와 organoids을 취급 합니다.</li>
	<li>D35에 매체의 절반을 제거 하 고 신선한 prewarmed ProB27 매체 FGF2 없이 37 ° C에 추가.</li>
	<li>매체의 절반 그림 2에서 같이 망막 세포 유형의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
</ol>5. 세대 및 증폭의 인간의 iPSC 파생 RPE (hiRPE) 셀
<ol><li>
인간 hiRPE 세포의 생성
	<ol>
<li>차별화에 관여는 Ipsc 식민지 그림 3A에서도식화 하는 프로토콜에 따라 60-70%의 합류를 도달할 때.</li>
		<li>쌍방향 매체의 6 cm 접시 당 4 mL를 준비 하 고 37 ° c.에 양방향 매체를 따뜻한 쌍방향 매체 iPSC 매체를 변경 합니다. 0 (D0)로이 시간 note</li>
		<li>D2, 스위치 문화 Bi 매체에 이전 37 ° c.에 따뜻하게 BiN2 매체에 모든 2-3 일 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>D28에 이전 그림 3A에서 같이 37 ° C에서 예 열 신선한 ProN2 매체에 매체를 변경 합니다. 참고:이 단계는 4 단계에서 설명한 organoid 따기 후 해질 수 있다.</li>
		<li>2-3 일 마다 ProN2 매체를 변경 합니다.</li>
		<li>그림 3B에서와 같이 D42에서 안료 패치의 관측에 의해 긴급 hiRPE 세포를 식별 합니다. 참고: hiRPE 세포의 염색 D35 iPSC 클론에 따라 D56 사이 나타납니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 세포의 증폭
	<ol>
<li>D42에 이전 단계 1.2.2에서에서 설명한 대로 매트릭스와 코팅 잘 당 ProN2 매체의 1 mL를 포함 하는 24-잘 접시를 준비 합니다. 사용 하기 전에 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 15 분 동안 접시를 놓습니다.</li>
		<li>6 cm 접시에서 hiRPE 패치를 수동으로 복구 합니다. 패치를 격리 하려면 안료 상피 주위 바늘 수직 줄무늬를 확인 하 고 부드럽게 바늘 긁 적 하 여 시트를 분리 합니다. 10 안료 패치 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 발음 하 고 24-잘 접시의 단일 우물에 그들을 전송.</li>
		<li>매체를 변경 하기 전에 ProN2 매체는 셀 문화 인큐베이터에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 hiRPE 패치 하십시오. 0 (hiRPEp0)으로이 hiRPE 셀 통로 note. 매체 ProN2 매체와 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
		<li>셀 confluent 때 hiRPEp0 세포를 전달 합니다.<ol>
<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 매체를 제거 하 고 각 잘 1 x 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 1 mL로 씻어.</li>
			<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 버리고 0.25 %trypsin 당 200 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 비활성화 된 트립 신을 ProB27 매체의 800 µ L를 추가 합니다. 참고: 트립 신 활동을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
			<li>HiRPE 셀의 위쪽 및 아래쪽 pipetting으로 해리. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거 하는 추가 세척을 할 수 있습니다.</li>
			<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend 셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
			<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 1 (hiRPEp1)로이 hiRPE 셀 통로 note.</li>
		</ol>
</li>
		<li>계속 hiRPE 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPEp1 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 망막 Organoids 및 hiRPE 셀의 cryopreservation
<ol><li>
전체 망막 organoids에 대 한
	<ol>
<li>5 ~ 20 망막 organoids 전송 피펫으로 사용 하 여 선택 하 고 극저온 유리병에 넣어. 튜브의 하단에 organoids를 건드리지 않고 1000 µ L 피 펫과 초과 모든 매체를 제거 하 고 차가운 cryopreservation 매체의 250 µ L 추가 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>고정 4 h. 전송의 최소-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에서 튜브-150 ° C 냉장고 또는 액체 질소 탱크 장기 저장을 위해 냉동된 튜브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀에 대 한
	<ol>
<li>통로 1에 셀 confluent 때 hiRPE 세포 분열. 참고: hiRPEp0 셀의 cryopreservation 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>T-25 cm2 플라스 크 진공 포부 시스템을 사용 하 여에서 중간 발음 하 고 그것을 씻어 5 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS의 3 mL 1 x.</li>
		<li>진공 흡입 시스템을 사용 하 여 PBS를 제거, 0.25 %trypsin 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 인큐베이터에서 15 분의 최소 그것을 품 어 트립 신 활동을 ProB27 매체의 5 mL를 추가 합니다. 참고: 비활성화 트립 신을 ProN2 매체의 사용이 권장 하지 않습니다.</li>
		<li>10 mL 피 펫을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 hiRPE 셀의 시트를 분리. 셀 카운터와 셀을 계산 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 놓고 110 x g에 5 분 동안 원심. 참고: 추가 세척 ProN2 매체 ProB27 매체의 초과 제거를 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>진공 포부를 사용 하 여 상쾌한 발음 하 고 부드럽게 cryopreservation 매체의 250 µ L에 2 백만 세포를 세포를 resuspend.</li>
		<li>극저온 유리병 당 세포 현 탁 액의 250 µ L를 전송 합니다. 최소 4 h-80 ° C에서 소 프로 파 놀 기반 냉동 컨테이너에 튜브를 고정 합니다.</li>
		<li>-150 ° C 냉동 고 또는 장기 저장을 위한 액체 질소 탱크에 냉동된 튜브를 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 해빙 망막 Organoids 및 hiRPE 세포의
<ol><li>
전체 망막 organoids의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProB27 매체 (2 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 저온 유리병 포함 37 ° C에서 물 욕조에 망막 organoids 30 s. 소독 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 신중 하 게 저온 유리병을 녹여.</li>
		<li>유리병을 열고 미리 데워 진된 ProB27 매체의 1 mL를 추가 합니다. 전송 피 펫 1.5 mL 튜브에는 organoids를 전송.</li>
		<li>튜브의 하단에 망막 구조를 건드리지 않고 pipetting으로 매체를 부드럽게 제거 합니다. 워시는 organoids 1 1 mL와 함께 더 많은 시간 미리 데워 진된 ProB27 매체의.</li>
		<li>전송 피펫으로와 organoids를 발음 하 고 미리 예 열 하 고 37 ° C, 5% CO2배양 기에 equilibrated ProB27 매체를 포함 하는 6-잘 접시의 1에 넣어. 참고: 6 잘 플레이트의 당 10-15 망막 organoids를 배치 합니다.</li>
		<li>매체의 절반 그림 2에 설명 된 대로 그들의 출현에 따라 원하는 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한 시간 동안 2-3 일 마다 변경 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
HiRPE 셀의 해빙
	<ol>
<li>37 ° C에서 따뜻한 ProN2 매체 (8 mL 각 극저온 유리병에 필요한 것).</li>
		<li>액체 질소 탱크 또는-150 ° C 냉장고에서 해 동 hiRPEp1 세포의 극저온 샘플 37 ° C에 물 목욕으로 외피에 의해 30 s. 소독에 대 한 신중 하 게 살 균 제 솔루션 스프레이 사용 하 여 저온 유리병.</li>
		<li>튜브를 열고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 1 mL를 추가 하 고 미리 데워 진된 ProN2 매체의 2 개 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 110 x g에 5 분 동안 원심.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 부드럽게 37 ° c.에 미리 예 열 ProN2 매체의 2 mL에 셀 펠 릿 resuspend</li>
		<li>셀 카운터로 셀을 계산 합니다.</li>
		<li>1.25 백만 셀 하 고 매트릭스 코팅 T-25 cm2 플라스 크에 넣어 (단계 2.2.2 참조) 37 ° c.에 미리 따뜻하게 ProN2 매체의 5 mL를 포함 하 이 단계에서 2 (hiRPEp2) 통로 note.</li>
		<li>계속 hiRPEp2 셀 셀 문화 인큐베이터에서 ProN2 매체에서 48 h에 대 한 37 ° C, 5% CO2 매체를 변경 하기 전에.</li>
		<li>2-3 일 마다 미디어를 변경 합니다. HiRPE 셀 합류에 도달, 다음 통로 또는 cryopreservation 수행 합니다. 참고: 2 주 후에 문화, 8-10 백만 hiRPE 셀 추가 실험에 대 한 수집할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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B., Collin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF-1+Signalling+plays+an+important+role+in+the+formation+of+three+dimensional+laminated+neural+retina+and+other+ocular+structures+from+human+embryonic+stem+cells.">IGF-1 Signalling plays an important role in the formation of three dimensional laminated neural retina and other ocular structures from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 33, 2416-2430 (2015).</li><li>Gonzalez-Cordero, A., Kruczek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recapitulation+of+human+retinal+development+from+human+pluripotent+stem+cells+generates+transplantable+populations+of+cone+photoreceptors.">Recapitulation of human retinal development from human pluripotent stem cells generates transplantable populations of cone photoreceptors.</a> Stem Cell Reports. 9, 820-837 (2017).</li><li>Eiraku, M., Takata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture.">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472, 51-56 (2011).</li><li>Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+retinal+development+with+human+embryonic+and+induced+pluripotent+stem+cells.">Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 16698-16703 (2009).</li><li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions.">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li><li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li><li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium.">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li><li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina.">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li></ol>

Sacha Reichman, 올리비에 Goureau, 그리고 호세 알랭 Sahel 중인 인간 만능 줄기 세포에서 망막 세포의 생성에 관련 된 특허 발명에 있습니다.

이 프로토콜 RPE 세포 및 망막 organoids, 망막 RGCs 및 대뇌, 이종와 피더 조건에서 인간의 pluripotent 줄기 세포에서 생산 하는 방법을 설명 합니다. 여기 좋은 제조 관행 (GMP) 과정, 재배 하는 방법 호환 RPE 세포, RGCs, 그리고 줄기 세포 기반 요법 및 약물의 개발에 대 한 대뇌 iPSC 파생 된 망막 세포의 큰 생산 수 발견은 망막 퇴행 성 질환의 미래 처리를 위한 접근 한다. 전체 망막 organoids 또는 hiRPE 셀의 cryopreservation는 또한 가장 큰 장점은 수립 중간 세포 은행에 줄기 세포 기반 치료에서 차후 사용을 위해 중요 한 단계를 제공 합니다.
차별화의 특정 단계에서 큰 주식 종류의 특정 망막 세포의 생산 미래 임상 번역에 필요한 것입니다. 이와 관련, CD73 포지티브 포토 리셉터 일어나 3 개월에서 세대 이식 호환 셀 인구18, 동결 해 동 망막에서 이러한 미 성숙한 대뇌를 생성 하는 가능성으로 설명 organoids15 강화 치료 목적을 위해 이러한 세포를 사용 하는 희망. 망막 색소 상피에 관한 체 외에서 증식 하는 hiRPE 세포의 기능 그들을 은행에 큰 셀 제작 가능 중요 한 것은, 해 동된 인간 iPSC 파생 RPE 세포 자신의 RPE phenotype과 유지 기능, 따라서 영양 인자 분 비 또는 포토 리셉터 외부 세그먼트 먹어서15, 그들의로 대 한 전략을 심사에 대 한 용이성을 검증 미래의 치료 접근입니다.
IPSC 파생 망막 organoids7,,89,10,11,12,15 에서 변화 하는 세대에 대 한 프로토콜의 다양 한 있다 효율성 및 견고성 (embryoid 몸 처럼 대 부착 셀 집계) 방법 문화. 여기 설명 하는 방법을 부착 인간의 Ipsc에서 시작 하 고 재현할 수 효능, 적응성, 그리고 인간의 iPSC 라인15의 넓은 범위에 적용을 보여 줍니다. 혈 청 무료 미디어의 연속 된 변화에 따라이 프로세스를 차별화 가이드 시스템의 내장 신호를 이용 하 여 망막 개발의 주요 단계를이. 이 프로토콜의 중요 한 장점은 배아 체 대형의 부재 이며 미래의 GMP 준수 망막 세포 제조 셀 치료 파생 상품을 생산 하는 프로토콜에 대 한 매트릭스의 추가. 이 방법에서는, 망막 organoid 생성 및 성숙의 효율에 차이가 xenogeneic 아니 xenogeneic 문화 조건 안 셀 치료 시스템 (CTS) 보충제를 사용 하 여 독점적으로 재조합 공식화, 사이 발견 또는 인간 답게 된 구성 요소입니다.
망막 차별화 방법의 성공은 크게 인간의 iPSC 문화의 품질에 따라 달라 집니다. 재활 방법 망막 세포8, 인간의 Ipsc의 분화 효율 영향을 주지 않습니다 그러나 그들의 stemness 상태 수 필요가 있다. 짧게, 정기적으로 재배 인간의 Ipsc 한다 감 별 법의 어떤 표시 든 지 보여주지 않습니다. 식민지는 겹치지 않아야 하 고 그들의 독특한 원형 형태를 표시 해야 합니다. 비록 망막 차별화의 효율성은 클론 종속 c m2 당 2 개의 망막 구조의 최소 수 선택 D28에서 1 6 cm 접시에 대 한 50-60 neuroretinal 구조에 해당. 부동 문화 조건에서 망막 organoid 성숙에 대 한 구조 융합 및 중간 overconsumption 방지 잘 당 구조의 수를 제한 합니다. 이러한 문화 조건에서 망막 organoids 수 수 maturated는 광범위 한 시간 늦은 망막 세포 유형 얻을 하는 데 필요한.
앞으로 찾고, 망막 organoids 생성 된 생체 외에서 이 방법으로 모델 망막 질병에 강력한 도구 구성 합니다. 환자 전용 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 그들의 분자 및 세포 메커니즘의 탐사에 의해 더 복잡 한 또는 유전 질병을 이해 하 사용 됩니다. 이 모델은 특히 높은 처리량 검열, 세포와 유전자 치료, 또는 게놈 망막 dystrophies에 대 한 혁신적인 치료법 개발에 접근, 편집을 통해 약물 발견에 적합 될 것입니다.

망막 중앙 신경 시스템 (CNS)의 중요 한 부분이 이며 자발적으로 외상 성 부상이 나 질병에 따라 다시 생성 제한 된 용량을 하고있다. 따라서, 연령 관련 황 반 변성 (AMD), 망막 화 (RP), 녹 내장, 당뇨병 성 망막 증 등 확실 한 망막 세포 손실의 원인이 퇴행 성 병 리는 일반적으로 돌이킬 수 없는 실명으로 이어질. 퇴 화 된 망막 구조를 손상 또는 분실 된 세포를 대체 하는 것을 목표로 하는 줄기 세포 기반 요법 가장 유망한 접근1,,23중 하나는 주요 도전 이다. 인간 배아 줄기 세포 (ESCs) 세포로 만능 줄기 세포 또는 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 문화, 무한정 확장 될 수 있고 그들은 모든 종류를 생산 하는 잠재력을가지고. 망막 개발에 대 한 우리의 이해에 생체 외에서 의 개선 발전 인간의 iPSC 차별화 망막 organoids7,,89의 세대에서 결과 대 한 프로토콜 10,,1112. 망막 신경 절 세포 (RGCs), 대뇌, 그리고 망막 안료 상피 (RPE) 세포를 포함 하 여 주요 망막 세포의 모든 인간의 ESCs와 Ipsc4,5, 에서 성공적으로 분화 된 6. Eiraku 그 외 여러분 에 의해 개발 된 SFEB (embryoid 몸 같은 집계의 혈 청 무료 문화) 방법에 따라 13, 망막 organoids의 자기 형성 ESC 또는 iPSC 파생 embryoid 몸 같은 집계 정의 된 세포 외 매트릭스 구성 요소7,10,14에서 얻을 수 있습니다. 하지만 이러한 프로토콜 치료 접근 또는 약물 검사에 대 한 많은 호환 되지 않습니다 항상 셀의 큰 생산 단계를 요구 하는 복잡 한. 따라서, 인간의 망막 세포를 생산 하는 방법의 선택이 중요 하 고 메서드가 확장 가능한, 강력 하 고 효율적인 필요.
우리 우리의 이전 게시15을 기반으로, 여기, 부착 인간의 Ipsc 급지대와 이종 조건에 재배에서 망막 organoid 자기 형성을 통해 망막 세포의 간단 하 고 효율적인 생성에 대 한 각 단계 설명 해 서. 부착 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에서 시작 해 서,이 프로토콜만 간단한 연속 매체 4 주에 iPS 파생 RPE (hiRPE) 세포와 neuroretinal 구조 둘 다의 생성을 허용 하도록 변경 해야 합니다. 수동 격리 후 hiRPE를 확장할 수 있습니다. 있으며 망막 구조 망막 조상 세포 vivo에서 인간 일치 순차적으로 모든 망막 세포 유형으로 분화 할 수 있는 organoids를 부동으로 경작 될 수 있습니다. retinogenesis입니다. 마지막으로, 연구 발전 또는 임상 번역, 우리 그들의 phenotypic 특성 및 기능에 영향을 주지 않고 전체 망막 organoids 및 hiRPE 세포의 장기 저장 수 cryopreservation 메서드를 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A14700</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Vitronectin (VTN-N) Recombinant Human Protein, Truncated</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A27940</td>
			<td>Coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1517001</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 6 Medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1516401</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Supplement</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1370701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-2 Supplement (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17502048</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement (50X), serum free</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>17504044</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1486701</td>
			<td>supplement CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11320074</td>
			<td>medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellStart CTS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1014201</td>
			<td>Matrix CTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltrex hESC-Qualified, Ready-To-Use, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A1569601</td>
			<td>Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentle Cell Dissociation Reagent</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>7174</td>
			<td>dissociation solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostem Freezing Media</td>
			<td>clinisciences</td>
			<td>05-710-1D</td>
			<td>Cryopreservation medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2)</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>FGF2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibroblast growth factor 2 (FGF2) animal free</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>AF-100-18B</td>
			<td>FGF2 Xeno free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AGANI needle 23G</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*2332R1</td>
			<td>Needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flask 25 cm&#178; Tissue Culture Treated</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353109</td>
			<td>T-25 cm&#178;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td>24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate Tissue Culture Treated</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3516</td>
			<td>6-well plate</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

defined xeno-free and feeder-free culture conditions for the generation of human ipsc-derived retinal cell models

만능 줄기 세포에서 특수 세포의 생산 재생 의학에 대 한 새로운 접근을 개발 하는 강력한 도구를 제공 합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 사용은 어디 iPSC 파생 된 망막 세포 모델 이해 하 고 실명을 싸울 중요 한 단계를 앞으로 표시 neurodegenerative 질병 연구, 망막 dystrophies를 포함 하 여 특히 매력적 이다. 이 논문에서는, 우리 생성, 성숙, 망막 organoids cryopreserve을 간단 하 고 확장 가능한 프로토콜을 설명 합니다. 변화 하는 매체에 따라,이 방법의 주요 장점은 여러 방지 이며 Ipsc의 가이드 차별화에 필요한 일반적으로 시간이 많이 걸리는 단계. 부착 인간의 iPSC 문화에 정의 된 미디어의 연속적인 변화에 의해 망막 개발의 초기 단계를 흉내 낸,이 프로토콜 자체 neuroretinal 구조에 망막 안료 상피 (RPE) 세포 형성의 동시 발생을 사용 하는 4 주에 재현 하 고 효율적인 방식 으로입니다. 성인 인간의 망막에 7 망막 세포 유형으로 Rpc의 차별화를 활성화 부동 문화 상태에서 더 성숙 망막 조상 세포 (Rpc)을 포함 하는 이러한 구조 쉽게 격리 될 수 있습니다. 또한, 우리 망막 organoids의 cryopreservation 빠른 방법 및 RPE 세포 장기 저장에 대 한 설명합니다. 함께 결합, 여기에 설명 된 방법을 생산 하 고 인간의 iPSC 파생 된 망막 세포 또는 조직 모두 기본 및 임상 연구에 대 한 은행 유용 있을 것입니다.

급지대 무료 조건16 에서 인간의 iPSC 차별화에 대 한 첫 번째 단계는 자기 갱신 기계 자발적인 차별화 (그림 1A)를 장려 하기 위해 양방향 매체를 사용 하 여 종료입니다. 다음, Bi 매체 보완에 D2, 신경 및 망막 혈통으로 차별화 Ipsc 셀 가이드는 N2 보완. 이 프로세스 리드 D28 주위에 neuroretinal 꽃 봉 오리의 모습 (그림 1C - 1E). 자기 형성 neuroretinal 구조 그림 1E 에서 볼 수 있듯이 바늘을 사용 하 여 격리 될 수 있습니다 및 ProB27 매체 (그림 1 층)을 사용 하 여 부동 문화 조건에서 망막 organoids의 성숙 수 있도록 문화 접시에 전송. 하나를 신경 망막의 성장과 발전, FGF2 1 주일 (그림 1A) 매체에 추가 됩니다.
D28에서 신흥 망막 구조 공동 PAX6, RAX, 및 VSX215키 전사 요소를 표현 하는 망막 조상 세포 주로 포함 됩니다. 이러한 창시자 인간 망막 발달와 일치 진화론 보존된 출생 순서에 떠 있는 문화 조건에서 망막 세포 유형의 7 개의 주요 클래스를 일으키 다. QRT-PCR 및 immunohistochemistry 이전 Reichman 외 에 설명에 따라 15, 그림 2 에 광범위 한 곡선 표시 체 외에서 성숙 과정 동안 망막 세포 발생 초기와 후반을 태어난의 파도. 따라서, 문화 시간 셀 종류는 organoids에 정의합니다.
더 이상 확대를 위한 hiRPE 세포의 고립이 셀 채색의 시각화를 허용 하기 때문에 착 색은 지각할 수 있는 경우에 수행할 수 있습니다. 이 방법에서는, ProN2 매체 RPE 세포15의 착 색에 D42 데 D28에서 사용 됩니다.
인간의 iPSC 클론에 따라 안료 패치 검출 될 수 있다 망막 구조;의 자기 형성 전후 D28에서 ProN2 매체의 사용 후 대부분 1 개 또는 2 주 그러나 (그림 3A, B). HiRPE 셀 통로 0에 고립 된 헝겊 조각에서 확장의 대표적인 밝은 필드 이미지 그림 3C 와 3D에 표시 됩니다. 그런 다음, hiRPE 셀 통로 4, 상피 엽 전환 (응급) 없이 그들의 RPE 표현 형을 유지까지 확장할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 응급 Y-27632, 또한 셀 번호 구절17의 증가 수와 같은 바위 억제제의 사용으로 예방할 수 있습니다. 녹고 후 hiRPE 세포의 장기 문화는 성숙 하 고 기능성 상피15을 얻기 위해 여기에 설명 된 조건에서 쉽게 수행할 수 있습니다. 주 52 클래식 cuboidal 조약돌 형태학에서 성숙 hiRPEp2 세포의 예는 그림 3E에 그림입니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57795/57795fig1.jpg"> 그림 1: 생성 및 부착 인간의 Ipsc에서 망막 organoids의 성숙. (A) 분화 프로토콜 망막 organoids의 생성을 허용. (B) 인간 Ipsc D0에서. (C) neuroretinal 상피 D15에서 신흥. (D) d 22에서 자기 형성 신경 망막 같은 구조. (E) 여기, neuroretinal 버드는 바늘을 사용 하 여 격리 됩니다. (F) D35에서 문화 상태를 부동에 망막 organoids의 대표 이미지. 스케일 바 = 200 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57795/57795fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57795/57795fig2.jpg"> 그림 2: 파도 인간의 iPSC 파생 된 망막의 세포 생성. 약어: 망막 조상 세포 (Rpc), 망막 신경 절 세포 (RGCs), 수평 세포 (호), amacrine 세포 (오전), 뮐러 glial 세포 (MGCs), 양극 세포 (Bp), 및 대뇌 (홍보) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57795/57795fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57795/57795fig3.jpg"> 그림 3: 생성 및 인간의 iPSC 파생 RPE의 증폭. (A) 인간의 hiRPE 세포의 생성을 허용 하는 분화 프로토콜의 그림. (B) 단계 대조 이미지 보여주는 착 패치 주 6 (W6) 부착 인간의 Ipsc 차별화에서 신흥. (C) hiRPEp0 셀 안료 패치 수확 후 1 주일 (W1)를 재배. (D) hiRPEp0 세포 주 6에서 (W6) 안료 패치 따기 후. (E) A 후에 녹고, hiRPEp2 셀의 대표 이미지는 52 주 (W52) ProN2 매체에 대 한 재배. 스케일 바 = 200 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57795/57795fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

정의 된 이종 무료 및 급지대 무료 문화 세대의 인간 iPSC 파생 된 망막 세포 모델에 대 한

전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.2K 조회수.  Sorbonne Université, INSERM, CNRS, F-75012 Paris, France. 전문된 망막 세포 pluripotent 줄기 세포의 생산은 망막 질환 줄기 세포 기반 치료의 발전에 있는 전환 점을. 현재 종이, 변환, 기본 및 임상 연구에 대 한 organoids 망막과 망막 색소 상피의 효율적인 생성을 위한 간단한 방법을 설명합니다.

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

연구

발생학

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

인간 다 능성 줄기 세포에서 멜라닌 세포의 공급이없는 유도

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust methods for the large-scale production of functional cell types, including cardiomyocytes. Here we demonstrate that the temporal manipulation of WNT, TGF-&#946;, and SHH signaling pathways leads to highly efficient cardiomyocyte differentiation of single-cell passaged hPSC lines in both static suspension and stirred suspension bioreactor systems. Employing this strategy resulted in ~ 100% beating spheroids, consistently containing &#62; 80% cardiac troponin T-positive cells after 15 days of culture, validated in multiple hPSC lines. We also report on a variation of this protocol for use with cell lines not currently adapted to single-cell passaging, the success of which has been verified in 42 hPSC lines. Cardiomyocytes generated using these protocols express lineage-specific markers and show expected electrophysiological functionalities. Our protocol presents a simple, efficient and robust platform for the large-scale production of human cardiomyocytes.

Here, we present a robust, fast and scalable cardiomyocyte differentiation protocol for human pluripotent stem cells (hPSCs). Cardiomyocytes derived using this large-scale method can provide sufficient cell numbers for their effective use in human cardiovascular disease modeling, high-throughput drug screening, and potentially clinical applications.

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

This protocol provides a method for the collection of mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) derived from serum (fetal bovine serum, FBS)- and feeder (mouse embryonic fibroblasts, MEFs)-free conditions for a cell-free approach. It may be applicable for the treatment of aging and aging-associated diseases.

무 혈청의 수집 및 공급 장치없이 마우스 배아는 세포 자유로운 접근을위한 세포 조절 중간 줄기

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via their strong adherence to tissue culture plastic and then further expanded in vitro, most commonly using fetal bovine serum (FBS). Since FBS can cause MSCs to become immunogenic, its presence in MSC cultures limits both clinical and experimental applications of the cells. Therefore, studies employing chemically defined xeno-free (XF) media for MSC cultures are extremely valuable. Many beneficial effects of MSCs have been attributed to their ability to regulate inflammation and immunity, mainly through secretion of immunomodulatory factors such as tumor necrosis factor-stimulated gene 6 (TSG6) and prostaglandin E2 (PGE2). However, MSCs require activation to produce these factors and since the effect of MSCs is often transient, great interest has emerged to discover ways of pre-activating the cells prior to their use, thus eliminating the lag time for activation in vivo. Here we present protocols to efficiently activate or prime MSCs in three-dimensional (3D) cultures under chemically defined XF conditions and to administer these pre-activated MSCs in vivo. Specifically, we first describe methods to generate spherical MSC micro-tissues or &#39;spheroids&#39; in hanging drops using XF medium and demonstrate how the spheres and conditioned medium (CM) can be harvested for various applications. Second, we describe gene expression screens and in vitro functional assays to rapidly assess the level of MSC activation in spheroids, emphasizing the anti-inflammatory and anti-cancer potential of the cells. Third, we describe a novel method to inject intact MSC spheroids into the mouse peritoneal cavity for in vivo efficacy testing. Overall, the protocols herein overcome major challenges of obtaining pre-activated MSCs under chemically defined XF conditions and provide a flexible system to administer MSC spheroids for therapies.

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or 'spheroids' of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

제노없는 조건에서 3-D 문화의 생산과 치료 중간 엽 줄기의 관리 / 기질 세포 (MSC) 타원체 뇌관

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue. 
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, "Brains in a dish," that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro. 
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.

Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells, represent a unique type of undifferentiated cells with promise in tissue engineering and for reprogramming into iPSC for future pediatric interventions and stem cell banking. The protocol presented here describes an optimized procedure for extracting and culturing primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells and generating episomal induced pluripotent stem cells from these cells in fully chemically defined culture conditions utilizing human recombinant vitronectin and the E8 medium. Characterization of the new lines by applying stringent methods &#8211; flow cytometry, confocal imaging, teratoma formation and transcriptional profiling &#8211; is also described. The newly generated lines express markers of embryonic stem cells &#8211; Oct3/4A, Nanog, Sox2, TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 &#8211; while being negative for the SSEA-1 marker. The stem cell lines form teratomas in scid-beige mice in 6-8 weeks and the teratomas contain tissues representative of all three germ layers. Transcriptional profiling of the lines by submitting global expression microarray data to a bioinformatic pluripotency assessment algorithm deemed all lines pluripotent and therefore, this approach is an attractive alternative to animal testing. The new iPSC lines can readily be used in downstream experiments involving the optimization of differentiation and tissue engineering.

This protocol describes the reprogramming of primary amniotic fluid and membrane mesenchymal stem cells into induced pluripotent stem cells using a non-integrating episomal approach in fully chemically defined conditions. Procedures of extraction, culture, reprogramming, and characterization of the resulting induced pluripotent stem cells by stringent methods are detailed.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...