Diese Arbeit wurde von NIH/NHGRI R00 HG006922 NIH/NHGRI R01 HG008974, j.g. und Huntsman Cancer Institute unterstützt. J.B.C. wurde von NIH Trainingsprogramm in Genetik T32GM007464 unterstützt.

<ol>
	<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li><li>Roadmap Epigenomics, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+analysis+of+111+reference+human+epigenomes.">Integrative analysis of 111 reference human epigenomes.</a> Nature. 518 (7539), 317-330 (2015).</li><li>Andersson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+atlas+of+active+enhancers+across+human+cell+types+and+tissues.">An atlas of active enhancers across human cell types and tissues.</a> Nature. 507 (7493), 455-461 (2014).</li><li>Perry, M. W., Boettiger, A. N., Bothma, J. P., Levine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shadow+enhancers+foster+robustness+of+Drosophila+gastrulation.">Shadow enhancers foster robustness of Drosophila gastrulation.</a> Curr Biol. 20 (17), 1562-1567 (2010).</li><li>Lam, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partially+redundant+enhancers+cooperatively+maintain+Mammalian+pomc+expression+above+a+critical+functional+threshold.">Partially redundant enhancers cooperatively maintain Mammalian pomc expression above a critical functional threshold.</a> PLoS Genet. 11 (2), e1004935 (2015).</li><li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo.">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).</li><li>Savic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoter-distal+RNA+polymerase+II+binding+discriminates+active+from+inactive+CCAAT/+enhancer-binding+protein+beta+binding+sites.">Promoter-distal RNA polymerase II binding discriminates active from inactive CCAAT/ enhancer-binding protein beta binding sites.</a> Genome Res. 25 (12), 1791-1800 (2015).</li><li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9.">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li><li>Cheng, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+activation+of+endogenous+genes+by+CRISPR-on,+an+RNA-guided+transcriptional+activator+system.">Multiplexed activation of endogenous genes by CRISPR-on, an RNA-guided transcriptional activator system.</a> Cell Res. 23 (10), 1163-1171 (2013).</li><li>Hilton, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenome+editing+by+a+CRISPR-Cas9-based+acetyltransferase+activates+genes+from+promoters+and+enhancers.">Epigenome editing by a CRISPR-Cas9-based acetyltransferase activates genes from promoters and enhancers.</a> Nat Biotechnol. , (2015).</li><li>Kearns, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+annotation+of+native+enhancers+with+a+Cas9-histone+demethylase+fusion.">Functional annotation of native enhancers with a Cas9-histone demethylase fusion.</a> Nat Methods. 12 (5), 401-403 (2015).</li><li>Thakore, P. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+epigenome+editing+by+CRISPR-Cas9+repressors+for+silencing+of+distal+regulatory+elements.">Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements.</a> Nat Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).</li><li>Groner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KRAB-zinc+finger+proteins+and+KAP1+can+mediate+long-range+transcriptional+repression+through+heterochromatin+spreading.">KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading.</a> PLoS Genet. 6 (3), e1000869 (2010).</li><li>Qi, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repurposing+CRISPR+as+an+RNA-guided+platform+for+sequence-specific+control+of+gene+expression.">Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.</a> Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).</li><li>Fulco, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+mapping+of+functional+enhancer-promoter+connections+with+CRISPR+interference.">Systematic mapping of functional enhancer-promoter connections with CRISPR interference.</a> Science. 354 (6313), 769-773 (2016).</li><li>Joo, J. Y., Schaukowitch, K., Farbiak, L., Kilaru, G., Kim, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulus-specific+combinatorial+functionality+of+neuronal+c-fos+enhancers.">Stimulus-specific combinatorial functionality of neuronal c-fos enhancers.</a> Nat Neurosci. 19 (1), 75-83 (2016).</li><li>Xie, S., Duan, J., Li, B., Zhou, P., Hon, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Engineering+and+Analysis+of+Combinatorial+Enhancer+Activity+in+Single+Cells.">Multiplexed Engineering and Analysis of Combinatorial Enhancer Activity in Single Cells.</a> Mol Cell. 66 (2), 285-299 (2017).</li><li>Carleton, J. B., Berrett, K. C., Gertz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+Enhancer+Interference+Reveals+Collaborative+Control+of+Gene+Regulation+by+Estrogen+Receptor+alpha-Bound+Enhancers.">Multiplex Enhancer Interference Reveals Collaborative Control of Gene Regulation by Estrogen Receptor alpha-Bound Enhancers.</a> Cell Syst. 5 (4), 333-344 (2017).</li><li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes.">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li><li>Ayer, D. E., Laherty, C. D., Lawrence, Q. A., Armstrong, A. P., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mad+proteins+contain+a+dominant+transcription+repression+domain.">Mad proteins contain a dominant transcription repression domain.</a> Mol Cell Biol. 16 (10), 5772-5781 (1996).</li><li>Alland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+for+N-CoR+and+histone+deacetylase+in+Sin3-mediated+transcriptional+repression.">Role for N-CoR and histone deacetylase in Sin3-mediated transcriptional repression.</a> Nature. 387 (6628), 49-55 (1997).</li><li>Konermann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+control+of+mammalian+endogenous+transcription+and+epigenetic+states.">Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states.</a> Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).</li><li>Rennoll, S. A., Scott, S. A., Yochum, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+repression+of+AXIN2+and+MYC+gene+expression+using+designer+TALEs.">Targeted repression of AXIN2 and MYC gene expression using designer TALEs.</a> Biochem Biophys Res Commun. 446 (4), 1120-1125 (2014).</li><li>Stampfel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulators+form+diverse+groups+with+context-dependent+regulatory+functions.">Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions.</a> Nature. 528 (7580), 147-151 (2015).</li><li>Perez-Pinera, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+gene+activation+by+CRISPR-Cas9-based+transcription+factors.">RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors.</a> Nat Methods. 10 (10), 973-976 (2013).</li><li>Heigwer, F., Kerr, G., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-CRISP:+fast+CRISPR+target+site+identification.">E-CRISP: fast CRISPR target site identification.</a> Nat Methods. 11 (2), 122-123 (2014).</li><li>Parsi, K. M., Hennessy, E., Kearns, N., Maehr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+an+Inducible+CRISPR-dCas9-KRAB+Effector+System+to+Dissect+Transcriptional+Regulation+in+Human+Embryonic+Stem+Cells.">Using an Inducible CRISPR-dCas9-KRAB Effector System to Dissect Transcriptional Regulation in Human Embryonic Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. , 221-233 (2017).</li><li>Romanienko, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Vector+with+a+Single+Promoter+for+In+Vitro+Transcription+and+Mammalian+Cell+Expression+of+CRISPR+gRNAs.">A Vector with a Single Promoter for In Vitro Transcription and Mammalian Cell Expression of CRISPR gRNAs.</a> PLoS One. 11 (2), e0148362 (2016).</li><li>Smith, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+RNAi+and+CRISPR+technologies+by+large-scale+gene+expression+profiling+in+the+Connectivity+Map.">Evaluation of RNAi and CRISPR technologies by large-scale gene expression profiling in the Connectivity Map.</a> PLoS Biol. 15 (11), e2003213 (2017).</li><li>Liu, X. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editing+DNA+Methylation+in+the+Mammalian+Genome.">Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome.</a> Cell. 167 (1), 233-247 (2016).</li><li>O'Geen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dCas9-based+epigenome+editing+suggests+acquisition+of+histone+methylation+is+not+sufficient+for+target+gene+repression.">dCas9-based epigenome editing suggests acquisition of histone methylation is not sufficient for target gene repression.</a> Nucleic Acids Res. 45 (17), 9901-9916 (2017).</li><li>Amabile, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritable+Silencing+of+Endogenous+Genes+by+Hit-and-Run+Targeted+Epigenetic+Editing.">Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing.</a> Cell. 167 (1), 219-232 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und flexible Methode für sezieren Enhancer-Funktion bei der endogenen genomischen Lokus ohne physisch verändern die DNA-Sequenz. Zwar ähnlich im Konzept zuvor veröffentlichten CRISPR-Störungen-Protokolle mit dCas9-KRAB27, unterscheidet Enhancer-i sich diese Protokolle auf 3 Arten. Erstens nutzt Enhancer-i die SIN3A interagierende Domäne von MAD120 Enhancer Deaktivierung zu erreichen. Enhancer Deaktivierung kann gerettet werden, mit HDAC-Inhibitoren, was darauf hindeutet, dass der primäre Mechanismus der Deaktivierung HDAC angewiesen ist. Im Gegensatz zu CRISPR Störungen mit dCas9-KRABBE führen Enhancer-i nicht zur Ablagerung von H3K9me3. Dies dürfte die Enhancer-i stützt sich auf vorübergehende Einführung des Leitfadens, die RNAs, Transfektion mit den Zellen geerntet an 3 Tagen veröffentlichen. CRISPR Störungen wird eine Zunahme der H3K9me3 um 7 Tage Post Transduktion12beobachtet. Das Enhancer-i-Protokoll sieht schließlich eine Strategie, um mehrere Websites gleichzeitig Ziel und überwachen Sie die Effizienz des Zielens. Mosaik-Seq17dCas9-KRABBE wird verwendet, um mehrere Enhancer gleichzeitig, aber diese Technik stützt sich auf einzelne Zelle RNA Sequenzierung, Ausdruck Veränderungen zu erkennen und viele Gene (z. B. Östrogen-responsive Gene) unentdeckt aufgrund der geringen Empfindlichkeit der einzelligen RNA-FF Enhancer-i bietet eine zuverlässige Methode um Enhancer einzeln und in Kombination für jedes Gen zu untersuchen.
Der wichtigste Schritt der Enhancer-i ist Transfektion, die für die Zell-Linie von Interesse optimiert werden soll. Dieses Protokoll setzt auf Puromycin Behandlung für transfizierte Zellen zu bereichern, aber es ist möglich, dass Co transfecting Guide RNAs mit einem fluoreszierenden Proteins und Sortierung für fluoreszierende Zellen mittels Durchflusszytometrie erweisen eine bessere Methode der Anreicherung für einige Zelle Typen. Es wird empfohlen, Überwachung der Ausdruck der Guide RNAs und SID4x-dCas9-KRABBE durch qPCR zu beheben und Transfektion zu bestätigen. Wenn Richtmengen RNA niedrig sind (Zyklus Schwelle > 30), Benutzer können auch erwägen alternative Anleitung RNA Produktionsstrategien wie in Vitro Transkription28. Es ist auch möglich, dass trotz der hohen gRNA, Guide RNA Ausrichtung des SID4x-dCas9-KRABBE-Proteins ist ineffizient, können notwendig sein, in welchem Fall Auswahl verschiedener RNA-Sequenzen führen. Durch ChIP-Seq Fusionsprotein mit Chromatin von Enhancer-i behandelt Zellen ausführen, kann die Effizienz des Zielens überwacht werden. Wenn high-Signal des SID4x-dCas9-KRABBE in der Region von Interesse ist, und kein Ausdruck Änderungen in seiner vermeintlichen Zielgen werden erkannt, trägt die Region wahrscheinlich nicht zum Ausdruck, dass gen unter den untersuchten Bedingungen bei.
Eine mögliche Einschränkung der Enhancer-i ist, dass Ziel Effekte ansammeln können, wenn zu viele Seiten gleichzeitig gezielt eingesetzt werden. Nichtsdestotrotz haben CRISPR Störungen Strategien für Knockdown weniger Ziel-Effekte als RNAi29, besonders wenn eine polyklonale Zell-Linie mit dem Ausdruck dCas9-KRAB verwendet wird. Während wir off-Target genomische Bindung des SID4X-dCas9-KRABBE gesehen haben, wenn Sie 10 Seiten gleichzeitig auf, haben wir keine Veränderungen der Genexpression durch diese Bindung Ereignisse identifiziert. Da einige Enhancer mehrere Veranstalter bzw. andere Geschmacksverstärker kontaktieren können, ist es möglich, dass viele Gene Ausdruck bei der Ausrichtung der einzelnen Enhancer, ändern können, aber es unklar ist, ob diese Form der Genregulation üblich ist. Um zu bestätigen, dass der Ausdruck Veränderungen werden beobachtet durch Ausrichtung auf eine bestimmte Enhancer und nicht Ziel Effekte, können Benutzer Enhancer-i mit zwei unterschiedliche Sätze von nicht überlappenden Guide RNAs die gleiche Region durchführen. Darüber hinaus kann die genetische Löschung der Region mit Nuklease-kompetente Cas9 weiter seine Auswirkungen auf die Genexpression bestätigen.
Als Enhancer-i Funktionen durch Histon Deacetylation ist es möglich, dass seine Deaktivierung Fähigkeiten auf Geschmacksverstärker beschränken, die spürbare Histon Acetylierung verfügen. Es gibt eine Vielzahl von alternativen repressiven Fusionen, die möglicherweise effektiver bei Ausrichtung auf spezifische Enhancer. DNA-Methyltransferase Fusionen zu dCas9 können zur Genexpression bei distalen Enhancer30gezielt zu reduzieren, aber diese Unterdrückung ist oft nicht flüchtig. Eine andere repressive Fusion nutzt die Freund GATA1 (FOG1) Domäne, wodurch Histon H3 Lysin 27 Trimethylation und unterdrückt Genexpression auf Ebenen ähnlich wie dCas9-KRABBE in einer Vielzahl von Zelle Linien und Promotoren31. Interessanterweise reduziert hinzufügen mehr Kopien von FOG1 zu dCas9 das repressive Potential an Promotoren, was darauf hindeutet, dass eine einzelne Kopie der SID-Domäne möglicherweise mehr Enhancer Deaktivierung als die 4 Kopien derzeit in Enhancer-i verwendet. Es ist möglich, dass einige Loci von dual targeting durch unterschiedliche Kombinationen der oben genannten dCas9 Fusionen profitieren können. Zum Beispiel kann stabile langfristige Unterdrückung durch gleichzeitige Transduktion von dCas9-DNMT3a und dCas9-KRAB32erreicht werden. Die meisten dieser repressiven Fusionen haben nur auf einen einzigen Nenner zu einem Zeitpunkt gezielt, und es bleibt unklar, welche am effektivsten zu manipulieren gleichzeitig mehrere Enhancer ist.
Enhancer-i, während eine geeignete Methode für die Untersuchung von Kombinationen der Enhancer für eine Handvoll Genen, ist noch etwas im Durchsatz begrenzt, wenn der Benutzer wünscht, vermeintliche Enhancer für Hunderte von Genen zu studieren. Zukünftige Anwendungen dieser Technik werden Imaging-basierte Technologien um mehrere Gene in mehrere Proben gleichzeitig zu quantifizieren integrieren. Wichtiger ist, sind diese Technologien kompatibel mit direkte Nachweis der RNA-Moleküle aus lysate, wodurch die Notwendigkeit für zeitaufwändige RNA Isolierung. Diese Anpassungen werden das Verhör von größeren Mengen von Enhancer erleichtern.

Groß angelegte Projekte wie ENCODE1, Fahrplan Epigenomics2und FANTOM-Sequenzierung3 haben festgestellt, dass Millionen von vermeintlichen Enhancer innerhalb des menschlichen Genoms über Hunderte von Zelltypen. Schätzungen gehen davon aus, dass jeder Veranstalter mit durchschnittlich 4,9 Enhancer Associates und jede Enhancer durchschnittlich 2,4 Gene3 Kontakte, darauf hindeutet, dass gen-Expression oft das Ergebnis der Integration von mehreren verteilten regulatorischer Wechselwirkungen ist. Eine verbleibende Herausforderung ist zu definieren, nicht nur wie die einzelnen Enhancer zur Genexpression, beitragen, sondern wie sie kombinieren, um den Ausdruck beeinflussen. Gentechnische Ansätze werden häufig verwendet, um Beziehungen zwischen Enhancer in Modellorganismen Drosophila4 Mäuse5identifizieren. Diese Experimente sind jedoch zeitaufwendig und niedrigen Durchsatz für die Untersuchung von mehreren Enhancer an mehreren Genen.
Ein Ansatz für das Studium Enhancer-Funktion auf einer großen Skala umfasst massiv parallelen Reporter Assays. Diese Tests ermöglichen die gleichzeitige Vorführung von Tausenden von DNA-Sequenzen für ihre Fähigkeit, den Ausdruck von einem Reporter-gen6fahren. Während dieser Tests gezeigt haben, dass DNA-Sequenz allein ausreichen kann, um gen Verordnung Informationen7vermitteln, kommen sie mit den Einschränkungen von außerhalb des Kontexts native Chromatin durchgeführt wird und mit einem heterologen Promotor. Darüber hinaus ist die Größe der DNA-Sequenz in massiv parallelen Reporter Assays analysiert in der Regel weniger als 200 Basenpaaren, die gewünschte umliegenden Sequenz ausschließen können. Wichtig ist, wie Reporter-Assays nur die Aktivität einer Sequenz zu einem Zeitpunkt Messen, nehmen nicht berücksichtigt die komplexen Beziehungen sie, die zwischen Enhancer bestehen können. So massiv parallelen Reporter Assays informativ über die intrinsischen Aktivität einer DNA-Sequenz können zwar sein, sie nicht unbedingt der Funktion dieser DNA-Sequenz im Rahmen des Genoms mitteilen.
Vor kurzem haben entwickelte CRISPR/Cas9 Werkzeuge8 erleichtert das Studium der Genregulation wie sie für die Löschung der Enhancer an die endogenen Locus ermöglichen. Jedoch mehrere Enhancer gleichzeitig löschen, genomische Instabilität führen kann, und es ist zeitaufwendig, zu aufeinander folgenden Enhancer Löschungen in einer einzelnen Zelle Linie zu erzeugen. Darüber hinaus neue genomischen Sequenz entsteht an der Stelle der Löschung nach Reparatur, und diese Sequenz kann regulatorischen Funktion gewinnen. Eine alternative Version des Cas9 wurde entwickelt, speziell für modulierende Genexpression, unter Berufung auf Verschmelzungen von Aktivierung9,10 oder11,12 Domänen der Nuklease-defizienten Form des Cas9 zu unterdrücken (dCas9). Diese Schmelzverfahren Proteine sind ideal für das Studium mehrere Loci gleichzeitig, da sie nicht physisch die DNA-Sequenz verändern, und stattdessen Epigenetik modulieren um eine regulatorische Region zu befragen. Die am weitesten verbreitete repressive Fusion ist KRABBE, die Rekruten den KAP1 Co Repressor Komplex, Förderung der Ablagerung von Repression-assoziierten Histone H3 Lysin 9 Trimethylation (H3K9me3)13. dCas9-KRABBE, auch bekannt als CRISPR Störungen14, wurde für ihren Beitrag zur Gen Ausdruck15,16, Ziel- und Bildschirm einzelne Enhancer verwendet. jedoch wurde es nicht für mehrere Bereiche gleichzeitig gezielt optimiert. Eine Version von multiplex CRISPR-Störungen für Enhancer, Mosaik-Seq17, verwendet einzelne Zelle RNA-Seq als ein Auslesen, aber diese Technologie ist teuer und nur geeignet für die Untersuchung von stark exprimierten Genen aufgrund der geringen Sensitivität der Einzelzelle RNA-Seq.
Wir wollten eine CRISPR Interferenz basierende Methode für kombinatorische Enhancer-Funktion im Rahmen einer transcriptional Antwort auf Östrogen sezieren zu entwickeln. Etwa die Hälfte der Östrogen-responsive Gene enthalten mindestens 2 Enhancer durch Östrogen-Rezeptor Alpha (ER) gebunden, in der Nähe18, was darauf hindeutet, dass mehrere Enhancer können an die Östrogen-Antwort Teilnahme, und das Verständnis die rechtliche Logik erfordern würde Ausrichtung auf gleichzeitig mehrere Enhancer. Wie ausgangsstudien mit CRISPR Störungen bei Promotoren vorgeschlagen, dass nicht alle Veranstalter gleichermaßen auf KRAB-vermittelten Repression19reagieren, begründete wir, dass die Zugabe von einer deutlichen repressiven Domäne dCas9 die Deaktivierung des erleichtern können diverse Enhancer. Wir entschieden uns für die Sin3a Interaktion Domain von Mad1 (SID)20 führt auf die Rekrutierung von Histon Deacetylases21, die Acetyl-Gruppen auf Histone zu entfernen, die transkriptionelle Aktivität zugeordnet sind. Wichtig ist, die SID der Domäne war effektiv bei der Reduzierung der Genexpression bei dCas922 und Geschichten23verschmolzen, und Sin3a hat gezeigt, dass ein potenter repressiven Co-Faktor in einer Vielzahl von Enhancer Sequenz Kontexten24werden. Wir verwendet, SID4x-dCas9-KRABBE (Enhancer-i) um 10 verschiedene Enhancer, an der ER gebunden und ER Bindungsstellen (Stabilisierungen), die notwendig sind für die Östrogen transcriptional Antwort bei 4 Genen18zu identifizieren. Wir gezielt auch die Kombinationen der Enhancer, die Standorte zu identifizieren, die in der Produktion von Östrogen transcriptional Antwort kooperieren. Wir fanden, dass bis zu 50 Seiten möglicherweise gleichzeitig mit Veränderungen der nachweisbaren Genexpression ausgerichtet werden können. Mit ChIP-Seq und RNA-Seq, haben wir bewiesen, dass Enhancer-i eine hochspezifische Technik für mehrere Enhancer gleichzeitig zu studieren.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte bei der Durchführung von Enhancer-i, eine flexible Technik, die die funktionelle Studie von mehreren Enhancer gleichzeitig in einer Gewebekultur-Umgebung ermöglicht. Enhancer-i ist hoch korreliert mit genetischen löschen sondern bietet vorübergehende Deaktivierung, das Histon Deacetylases (HDACs) abhängig ist. Durch die Bereitstellung von Guide RNAs über Transiente Transfektion im Gegensatz zu stabilen Integration über virale Vektoren, vermeidet dieses Protokolls Ablagerung und potentielle Verbreitung von H3K9me3. Dieses Protokoll Details Guide RNA-Design und Klonen über Gibson Versammlung, die Transfektion von guide RNAs mit Lipofektion, und die Analyse der resultierenden Genexpression von qPCR ändert. Wir berücksichtigen auch die Methoden zur Bewertung der Spezifität des Zielens Enhancer-i auf der Ebene des Genoms und Transkriptom. Während diese Technik entwickelt wurde, um zu studieren Genregulation durch ER Enhancer in menschlichen Krebszelllinien gebunden, es gilt für die Zerlegung von jedem Säugetier Enhancer.

<table><tbody><tr><td>ZR 96-well Quick-RNA Kit</td><td>Zymo Research</td><td>R1053</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green RNA-to-CT 1-Step</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>AflII restriction enzyme</td><td>NEB</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>NEB</td><td>M0531L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621L</td><td></td></tr><tr><td>FuGENE HD</td><td>Promega</td><td>E2312</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4013</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RLT Plus</td><td>Qiagen</td><td>1053393</td><td></td></tr><tr><td>b-estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2758</td><td></td></tr><tr><td>Human: Ishikawa cells</td><td>ECACC</td><td>99040201</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac rabbit polyclonal</td><td>Active Motif&amp;nbsp;</td><td>39133</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3 rabbit polyclonal</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>FLAG mouse monoclonal</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>ER alpha rabbit polyclonal</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-544</td><td></td></tr><tr><td>pGL3-U6-PGK-Puro plasmid</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>51133</td><td>Shen et al., 2014</td></tr><tr><td>gRNA_cloningVector plasmid</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>41824</td><td>Mali et al., 2013</td></tr><tr><td>AflII U6 puromycin plasmid</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>106404</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>SID4X-dCas9-KRAB plasmid</td><td>Addgene&amp;nbsp;</td><td>106399</td><td>Carleton et al., 2017</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10977-023</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KAPA Stranded mRNA-Seq Kit, with KAPA mRNA Capture Beads</td><td>Kapa Biosytems</td><td>KK8420</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease and Phosphatase Inhibitor Mini Tablets</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin Selective Antibiotic (G418 Sulfate) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131035</td><td></td></tr><tr><td>LB Broth</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10855001</td><td></td></tr><tr><td>Quick-DNA Miniprep Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D3020</td><td></td></tr><tr><td>Quick-Load Purple 2-Log DNA Ladder</td><td>NEB</td><td>N0050S</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of enhancer function using multiplex crispr-based enhancer interference in cell lines

Mehreren Enhancer häufig Regeln eines bestimmten Gens, doch für die meisten Gene, es bleibt unklar, welche Enhancer für die Genexpression notwendig sind und wie diese Enhancer kombinieren, um eine transcriptional Antwort zu produzieren. Da Millionen von Enhancer identifiziert wurden, sind Hochdurchsatz-Werkzeuge notwendig, Enhancer-Funktion auf einer genomweiten Skala bestimmen. Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Enhancer-Funktion auch die Abgabe von genetischen Deletionen mit Nuklease-kompetente Cas9, aber es ist schwierig, die kombinatorische Effekte von mehreren Enhancer mit dieser Technik zu studieren, wie mehrere aufeinander folgende klonalen Zelllinien werden muss generiert. Hier präsentieren wir Ihnen Enhancer-i, eine CRISPR Interferenz basierende Methode, die für funktionelle Verhör von mehreren Enhancer gleichzeitig ihre endogenen Loci ermöglicht. Enhancer-i nutzt zwei repressiven Domänen mit Nuklease-defizienten verschmolzen Cas9, SID und KRABBE, Enhancer Deaktivierung über Histon Deacetylation an gezielte Loci zu erreichen. Dieses Protokoll nutzt Transiente Transfektion von Guide RNAs, vorübergehende Inaktivierung von Zielregionen zu ermöglichen und ist besonders effektiv bei der induzierbare transkriptionelle Reaktionen auf Reize in Gewebekultur Einstellungen blockieren. Enhancer-i ist hochspezifisch, sowohl in seiner genomischen targeting und seine Auswirkungen auf die globalen Genexpression. Aus diesem Protokoll erzielten Ergebnisse helfen um zu verstehen, ob ein Enhancer ist zur Genexpression, das Ausmaß des Beitrags und wie der Beitrag von anderen nahe gelegenen Enhancer betroffen ist.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows im Protokoll beschrieben. Um festzustellen, dass die Beiträge von ER-gebundenen Enhancer in der Nähe von Östrogen-regulierten Gens MMP17, hat 3 Bindungsstellen in der Nähe im Sinne von ChIP-Seq (Abbildung 2A) und RNAs leiten wurden für jede Region entwickelt. Design Guide RNAs, ein 600-900 bp Fenster rund um jede ER-Sequenz wurde Bindungsstelle von Interesse ausgewählt und ein Führer-RNA-Design-Programm. Resultierenden Guide Sequenzen RNA mit 0-2 vorausgesagt vom Zielwert, die Seiten des menschlichen Genoms mit BLAT ausgerichtet waren. Vier nicht-überlappende guide RNAs, die durch ChIP-Seq definierten Bereichs überspannt und DNaseI Überempfindlichkeit wurden ausgewählt, für die Ausrichtung (Abb. 2 b). Zusätzliche Sequenz (Tabelle 1) wurde hinzugefügt, um jedem Ende Erleichterung der nachgeschalteten Klonen und die daraus resultierenden bestellte waren 59 Nukleotid-Fragmente. Bei der Ankunft war Guide RNAs verdünnt und gebündelt durch die Website und eine kurze PCR wurden durchgeführt, um Homologie Regionen vor der Gibson-Montage hinzufügen. Abbildung 2 zeigt die erwarteten Guide RNA Produkt nach einer kurzen PCR unter Verwendung der "U6_internal" Zündkapseln (Tabelle 1), die an jedem Ende der 59 Länge 20 Basenpaaren Sequenz hinzufügen guide RNA Fragment, was in einer Länge von ~ 100-Sequenz. Anschluss an Gibson Vollversammlung diese Anleitung RNA-Pools verwandelten sich in Bakterien und Plasmid Minipreps waren am nächsten Tag vorbereitet. Abb. 2D zeigt Ergebnisse aus einem Enhancer Dissektion Experiment, wo mehrere Enhancer in der Nähe MMP17 allein ausgerichtet sind und in Kombination mit Enhancer-i. Seiten gezielt durch Enhancer-i sind mit einem schwarzen Sechseck gekennzeichnet. Guide RNA Plasmide Ausrichtung auf den angegebenen Seiten wurden in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert. Zwei Tage später änderte sich die Medien und Puromycin wurde hinzugefügt, um für transfizierte Zellen anzureichern. Am folgenden Tag wurden die Zellen geerntet, nach einem 8 h 10 nM Estradiol Behandlung. RNA wurde isoliert und eine einstufige qPCR erfolgte. In diesem Beispiel sind Seiten 1 und 2 erforderlich für eine vollständige Östrogene Antwort des MMP17, während Seite 3 nicht unter diesen Bedingungen (Abb. 2D, Fahrspuren Ii-iv) beiträgt. Wenn nur die Seiten 2 oder 3 aktiv sind (vi und Vii), die Östrogen-Reaktion ist ähnlich wie wenn keine Standorte sind aktiv (Viii), was darauf hindeutet, dass diese Seiten nicht selbständig beitragen. Seite 1 kann ein Ausdruck von selbst (V) beitragen, aber die größte Aktivität wird gesehen, wenn die Seiten 1 und 2 aktiv sind (iv).
10-Enhancer in der Nähe von 4 verschiedenen Genen gleichzeitig bearbeiten (Abbildung 3A), führen komplexe Pools von RNAs mit 42 Enhancer-Guides und 16 Veranstalter Guides generiert wurden. Anleitung RNS Oligos wurden vor der ersten Guide RNA Verlängerung PCR (Schritt 3.3) zusammengefasst und daraus resultierende PCR-Produkte wurden gereinigt und in Kombination mit der leeren Puromycin U6 klonen Vektor mit Gibson Assembly. Anschluss an die Vollversammlung Gibson wurden mehrere unabhängige Transformationen durchgeführt und vernickelt. Die Platten wurden in LB geschabt und erlaubt zu wachsen, für 2-4 h vor Maxiprep. Abbildung 3 b zeigt repräsentative Reduktionen in der Genexpression von qPCR wenn diese Anleitung RNA Pools waren in einer Östrogen-beraubt Ishikawa Zelllinie stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRAB transfiziert und behandelt wie beschrieben (Abb. 2D). Reduzierungen von Enhancer-i sind ähnlich denen, die durch die Ausrichtung des Projektträgers des vermeintlichen Zielgens. Abbildung 3 zeigt die Auswirkungen der Verdünnung des Guide RNAs auf Reduzierung der Östrogen-Antwort mit Enhancer-i. Eine 01:50, die Verdünnung eines Guide RNA-Pools, die Ausrichtung der Enhancer in der Nähe von G0S2 noch deutliche Reduzierung der Genexpression ergibt, was darauf hindeutet, dass Enhancer-i verwendet werden kann bis zu 50 Seiten auf einmal. Jedoch kann die Deaktivierung, verdünnt werden, darauf hinweist, dass Hunderte von Websites können nicht gleichzeitig ausgerichtet werden, es sei denn, empfindlichere Nachweisverfahren beschäftigt sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig1.jpg"> Abbildung 1: Protokoll für Multiplex-Enhancer Dissektion mit Enhancer-i. schematische Guide RNAs (rot und blau) sind mit e-knackig und ausgewählten Genom der UCSC Browser gestaltet. Vier Guide RNAs sind gewählt, die die Regionen von Interesse (Transkription Faktor Bindungsstellen definiert durch ChIP-Seq) umspannen. Guide RNA-Oligonukleotide, die von der Region von Interesse (rot und blau) gebündelt haben durchlaufen eine PCR um Homologie Regionen (Orange) vor der Gibson Montage und Transformation hinzuzufügen. Daraus resultierende Plasmid-Pools sind über Lipofektion in Zelllinien stabil mit dem Ausdruck SID4X-dCas9-KRABBE oder in Wildtyp Zellen in Verbindung mit SID4X-dCas9-KRAB Plasmid transfiziert. Guide RNA Plasmid Becken können individuell transfiziert werden, um eine Seite zu einem Zeitpunkt oder in Kombination mit mehreren Standorten gleichzeitig gezielt ansprechen. Transfizierte Zellen sind mit Antibiotika zu bereichern für Zellen mit Guide RNAs behandelt. ~ 72 h Post Transfektion sind die Zellen geerntet. Nukleinsäuren extrahiert werden können, für qPCR, RNA-Seq oder ChIP-Seq <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig2.jpg"> Abbildung 2. Führen RNA Design und Enhancer Dissektion für MMP17. (A) Genom Browser Screenshot von ER Alpha-gebundenen Enhancer (grau) in der Nähe von zielgerichtet sein MMP17. Diese Zahl wurde von Carleton, Et Al. modifiziert 18. (B) Guide RNA entwirft für die 3 Seiten18verbindlich. Die Bindungsstelle für ER definiert durch ChIP-Seq ist das Ziel und die 4 Guide RNAs Fliese in dieser Region. Die DNaseI Empfindlichkeit Signal, das die Bindungsstelle erstreckt, kann auch zur Zielsequenz für Guide RNA Design definieren. ChIP-Seq und DNaseI HS Daten stammen aus Ishikawa Zellen behandelt mit 10 nM Estradiol für 1 h (C) repräsentative Guide RNA Sequenzen, die montagebereit Gibson, eine kurze PCR Homologie Regionen hinzufügen unterzogen worden sind. (D) Relative Expression von MMP17 über qPCR nach Ausrichtung der einzelnen Regionen mit Enhancer-i und eine 8-h10 nM Estradiol Behandlung gemessen. Ausdruck ist relativ CTCF und Ausdruck Ebene der MMP17 in den Zellen nicht mit Estradiol behandelt. Kontrolle Guide RNAs der Veranstalter des Ziel IL1RN. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p < 0,01 und einzelne Sternchen geben p < 0,05 in ein gepaarter t-Test. Diese Zahl wurde von Carleton, geändert Et Al. 18. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57883/57883fig3.jpg"> Abbildung 3. Ausrichtung auf mehrere Enhancer in der Nähe von verschiedenen Genen gleichzeitig mit gebündelt Enhancer-i. (A) schematische Darstellung der Bindungsstellen und Promotoren in gepoolten Enhancer-i ausgerichtet werden. (B) die Auswirkungen auf Ausdruck qPCR gemessen, nachdem E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen mit Enhancer-i Plasmid Pool (grün), Promoter-i Plasmid Pool (blau) oder Kontrolle gRNAs (weiß)18transfiziert. Eine signifikante Reduktion bei aller Gene wird mit Enhancer-i beobachtet. Diese Zahl wurde modifiziert von Carleton, Et Al. 18. (C) die Effekte auf G0S2 Ausdruck Ebenen nach E2 Behandlung auf Ishikawa Zellen transfiziert mit unterschiedlichen Mengen an Guide RNAs gezielt G0S2. Eine signifikante Reduktion kann man schon mit kleinen Beträgen Guide RNA (01:50 Verdünnung), darauf hindeutet, dass bis zu 50 Seiten kann gleichzeitig ausgerichtet. Alle Fehlerbalken darzustellen SEM, doppelte Sternchen geben p < 0,01 und einzelne Sternchen geben p < 0,05 in ein gepaarter t-Test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57883/57883fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Name</td>
			<td>Sequenz</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_F</td>
			<td>TTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_internal_R</td>
			<td>GACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_F</td>
			<td>CCAATTCAGTCGACTGGATCCGGTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>U6_PCR_R</td>
			<td>AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCA</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_F</td>
			<td>GCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>gRNA_qPCR_R</td>
			<td>AAAAAGCACCGACTCGGTGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_F</td>
			<td>GTGACCGAGGGAATGAGAAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>dCas9_qPCR_R</td>
			<td>AGCTGCTTCACGGTCACTTT</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_F</td>
			<td>AGAAGAGAAAGGTGGAGGCC</td>
		</tr>
<tr>
<td>pAC95_PCR_R</td>
			<td>CGTCACCGCATGTTAGAAGG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_F</td>
			<td>CAATAGAAACTGGGCTTGTCG</td>
		</tr>
<tr>
<td>SID4X_PCR_R</td>
			<td>TCGTGCTTCTTATCCTCTTCC</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1. Primer für RNA Verlängerung und Sequenzierung, qPCR und Erkennung des Fusionsproteins verwendet.

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Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Dissektion der Enhancer-Funktion mit Multiplex CRISPR-basierte Enhancer Einmischung in Zell-Linien

Multiple enhancers often regulate a given gene, yet for most genes, it remains unclear which enhancers are necessary for gene expression, and how these ...

dissection-enhancer-function-using-multiplex-crispr-based-enhancer

Research

JoVE Journal

Genetics

9.2K Aufrufe.  University of Utah. Dieses Protokoll beschreibt die erforderlichen Schritte zum Entwerfen und ausführen gemultiplexten Ausrichtung der Enhancer mit deaktivieren Fusionsproteins SID4X-dCas9-KRABBE, auch bekannt als Enhancer Störungen (Enhancer-i). Dieses Protokoll ermöglicht die Identifizierung von Enhancer, die Genexpression regulieren und erleichtert das Sezieren von Beziehungen zwischen Enhancer Regulierung ein gemeinsames Zielgen.

Serie: Dissection of Enhancer Function Using Multiplex CRISPR-based Enhancer Interference in Cell Lines

Efficient Generation of hiPSC Neural Lineage Specific Knockin Reporters Using the CRISPR/Cas9 and Cas9 Double Nickase System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human cells has been low, which prevents the generation of human cell lines at a desired rate. The past two years have witnessed a rapid progression on improving efficiency of genetic manipulation by genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system. This manuscript describes a protocol for generating lineage specific human induced pluripotent stem cell (hiPSC) reporters using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination. Procedures for obtaining necessary components for making neural lineage reporter lines using the CRISPR/Cas system, focusing on construction of targeting vectors and single guide RNAs, are described. This protocol can be extended to platform establishment and mutation correction in hiPSCs.

Genome editing tools such as the CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas (CRISPR-associated) system have greatly improved gene targeting efficiency in human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). This manuscript describes a protocol for generating lineage specific hiPSC reporter using CRISPR/Cas system assisted homologous recombination.

Effiziente Erzeugung von hiPSC Neural Lineage Spezifische Knockin Reporter Mit den CRISPR / Cas9 und Cas9 Doppel Nickase-System

Gene targeting is a critical approach for characterizing gene functions in modern biomedical research. However, the efficiency of gene targeting in human ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Genome Editing and Directed Differentiation of hPSCs for Interrogating Lineage Determinants in Human Pancreatic Development

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding human development and dissecting disease mechanisms in a dish. To capitalize on this potential application requires efficient genome-editing tools to generate hPSC mutants in disease-associated genes, as well as in vitro hPSC differentiation protocols to produce disease-relevant cell types that closely recapitulate their in vivo counterparts. An efficient genome-editing platform for hPSCs named iCRISPR has been developed through the TALEN-mediated targeting of a Cas9 expression cassette in the AAVS1 locus. Here, the protocols for the generation of inducible Cas9 hPSC lines using cells cultured in a chemically defined medium and a feeder-free condition are described. Detailed procedures for using the iCRISPR system for gene knockout or precise genetic alterations in hPSCs, either through non-homologous end joining (NHEJ) or via precise nucleotide alterations using a homology-directed repair (HDR) template, respectively, are included. These technical procedures include descriptions of the design, production, and transfection of CRISPR guide RNAs (gRNAs); the measurement of the CRISPR mutation rate by T7E1 or RFLP assays; and the establishment and validation of clonal mutant lines. Finally, we chronicle procedures for hPSC differentiation into glucose-responsive pancreatic &#946;-like cells by mimicking in vivo pancreatic embryonic development. Combining iCRISPR technology with directed hPSC differentiation enables the systematic examination of gene function to further our understanding of pancreatic development and diabetes disease mechanisms.

Protocols to generate hPSC mutant lines using the iCRISPR platform and to differentiate hPSCs into glucose-responsive &#946;-like cells are described. Combining genome editing technology with hPSC-directed differentiation provides a powerful platform for the systematic analysis of the role of lineage determinants in human development and disease progression.

Genome Editing und gerichteten Differenzierung von hPSCs zur Abfrage Lineage Bestimmungsfaktoren im Bereich Human Pancreatic Entwicklung

Interrogating gene function in self-renewing or differentiating human pluripotent stem cells (hPSCs) offers a valuable platform towards understanding ...

Genetik

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often located distally from the regulated gene in intergenic regions or even within the body of another gene. The position independent nature of enhancer activity makes it difficult to match enhancers with the genes they regulate. Deletion of an enhancer region provides direct evidence for enhancer activity and is the gold standard to reveal an enhancer's role in endogenous gene transcription. Conventional homologous recombination based deletion methods have been surpassed by recent advances in genome editing technology which enable rapid and precisely located changes to the genomes of numerous model organisms. CRISPR/Cas9 mediated genome editing can be used to manipulate the genome in many cell types and organisms rapidly and cost effectively, due to the ease with which Cas9 can be targeted to the genome by a guide RNA from a bespoke expression plasmid. Homozygous deletion of essential gene regulatory elements might lead to lethality or alter cellular phenotype whereas monoallelic deletion of transcriptional enhancers allows for the study of cis-regulation of gene expression without this confounding issue. Presented here is a protocol for CRISPR/Cas9 mediated deletion in F1 mouse embryonic stem (ES) cells (Mus musculus129 x Mus castaneus). Monoallelic deletion, screening and expression analysis is facilitated by single nucleotide polymorphisms (SNP) between the two alleles which occur on average every 125 bp in these cells.

Experimental validation of enhancer activity is best approached by loss-of-function analysis. Presented here is an efficient protocol that uses CRISPR/Cas9 mediated deletion to study allele-specific regulation of gene transcription in F1 ES cells which contain a hybrid genome (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Generieren von CRISPR / Cas9 Mediated monoallelic Löschungen Enhancer-Funktion in embryonalen Stammzellen der Maus zu studieren

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Genom-Bearbeitung in Säugetieren Zelllinien mit CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding sites for transcriptional regulators to modulate gene expression. Alterations of CREs have been implicated in various diseases including cancer. While promoters and enhancers have been the primary CREs for studying gene regulation, very little is known about the role of silencer, which is another type of CRE that mediates gene repression. Originally identified as an adaptive immunity system in prokaryotes, CRISPR/Cas9 has been exploited to be a powerful tool for eukaryotic genome editing. Here, we present the use of this technique to delete an intronic silencer in the human RUNX1 gene and investigate the impacts on gene expression in OCI-AML3 leukemic cells. Our approach relies on electroporation-mediated delivery of two preassembled Cas9/guide RNA (gRNA) ribonucleoprotein (RNP) complexes to create two double-strand breaks (DSBs) that flank the silencer. Deletions can be readily screened by fragment analysis. Expression analyses of different mRNAs transcribed from alternative promoters help evaluate promoter-dependent effects. This strategy can be used to study other CREs and is particularly suitable for hematopoietic cells, which are often difficult to transfect with plasmid-based methods. The use of a plasmid- and virus-free strategy allows simple and fast assessments of gene regulatory functions.

Investigation of the Transcriptional Role of a RUNX1 Intronic Silencer by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in Acute Myeloid Leukemia Cells

Direct delivery of preassembled Cas9/guide RNA ribonucleoprotein complexes is a fast and efficient means for genome editing in hematopoietic cells. Here, we utilize this approach to delete a RUNX1 intronic silencer and examine the transcriptional responses in OCI-AML3 leukemic cells.

Untersuchung der Transkriptionsrolle eines RUNX1 Intronic Schalldämpfers durch CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein in akuten myeloischen Leukämiezellen

The bulk of the human genome (~98%) is comprised of non-coding sequences. Cis-regulatory elements (CREs) are non-coding DNA sequences that contain binding ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

Immunologie und Infektion

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among traditional technologies, RNA interference suffers from partial target abrogation and the requirement for life-long treatments. In contrast, artificial nucleases can impose stable gene inactivation through induction of a DNA double strand break (DSB), but recent studies are questioning the safety of this approach. Targeted epigenetic editing via engineered transcriptional repressors (ETRs) may represent a solution, as a single administration of specific ETR combinations can lead to durable silencing without inducing DNA breaks.
ETRs are proteins containing a programmable DNA-binding domain (DBD) and effectors from naturally occurring transcriptional repressors. Specifically, a combination of three ETRs equipped with the KRAB domain of human ZNF10, the catalytic domain of human DNMT3A and human DNMT3L, was shown to induce heritable repressive epigenetic states on the ETR-target gene. The hit-and-run nature of this platform, the lack of impact on the DNA sequence of the target, and the possibility to revert to the repressive state by DNA demethylation on demand, make epigenetic silencing a game-changing tool. A critical step is the identification of the proper ETRs&#39; position on the target gene to maximize on-target and minimize off-target silencing. Performing this step in the final ex vivo or in vivo preclinical setting can be cumbersome.
Taking the CRISPR/catalytically dead Cas9 system as a paradigmatic DBD for ETRs, this paper describes a protocol consisting of the in vitro screen of guide RNAs (gRNAs) coupled to the triple-ETR combination for efficient on-target silencing, followed by evaluation of the genome-wide specificity profile of top hits. This allows for reduction of the initial repertoire of candidate gRNAs to a short list of promising ones, whose complexity is suitable for their final&#160;evaluation in the therapeutically relevant setting of interest.

In Vitro Selection of Engineered Transcriptional Repressors for Targeted Epigenetic Silencing

Here, we present a protocol for the in vitro selection of engineered transcriptional repressors (ETRs) with high, long-term, stable, on-target silencing efficiency and low genome-wide, off-target activity. This workflow allows for reducing an initial, complex repertoire of candidate ETRs to a short list, suitable for further evaluation in therapeutically relevant settings.

In vitro Auswahl von modifizierten Transkriptionsrepressoren für gezieltes epigenetisches Silencing

Gene inactivation is instrumental to study gene function and represents a promising strategy for the treatment of a broad range of diseases. Among ...

Biotechnik

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

Generierung von Genomic Löschungen in Säugerzelllinien über CRISPR / Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Biologie

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

CRISPR-Gen-Editing-Tool für die MicroRNA-Cluster-Netzwerkanalyse

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...