Dieses Protokoll verwendet CRISPR-Cas9, um Knock-out- oder Knock-In-Linien zu erstellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es einfach und effizient ist, vor allem für Anfänger Forscher zu folgen. Bei Zellpassaging, behandeln Sie über Nacht kultivierte Zellen mit zwei Millilitern von 0,25% Trypsin EDTA pro Platte bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten.
Wenn die Zellen von den Plattenböden angehoben wurden, neutralisieren Sie die enzymatische Reaktion mit zwei Milliliterzellkulturmedium und übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches Rohr. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet in fünf Millilitern Frischzellenkulturmedium zum Zählen wieder auf. Dann samen 1,8 mal 10 bis die fünften Zellen in einem Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte für DieNachtkultur bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid.
Fügen Sie für die Transfektion der Zellen ein geeignetes Volumen des Transfektionsmixes, der die entsprechende Konzentration von CRISPR-Plasmid enthält, dem entsprechenden Volumen des Transfektionsreagenzes gemäß dem experimentellen Design und den Anweisungen des Herstellers hinzu. Nachdem Sie den Transfektionsmix für den empfohlenen Zeitraum bei Raumtemperatur inkubiert haben, fügen Sie die Lösung tropfenweise zu den Zellen hinzu. Dann wirbeln Sie die Platte vorsichtig, um sie zu mischen und legen Sie die Platte in einem befeuchteten 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid.
Am Ende der Transfektion 150 Mikroliter Trypsin-EDTA hinzufügen, um die Zellen zu dissoziieren, wie gerade gezeigt und die abgetrennten Zellen durch Zentrifugation gesammelt werden. Setzen Sie das Pellet in 2% fetalem Rinderserum in PBS wieder auf und filtern Sie die Zellen durch ein 30-Mikrometer-Netzsieb in eine fünf Milliliter fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder FACS-Röhre. Verwenden Sie dann die nicht transfizierten Zellen, um ein negatives Kontrolltor auf das Durchflusszytometer zu setzen und die transfizierten Zellen nach dem Fluoreszenzmarker auf dem CRISPR-Plasmid zu sortieren, das für die Transfektion in ein Rohr mit 100 Mikroliterzellkulturmedium verwendet wird.
Wenn alle transfizierten Zellen gesammelt wurden, pellet die Zellen durch Zentrifugation mit maximaler Geschwindigkeit und setzt das Pellet in 300 Mikroliter Zellkulturmedium wieder auf. Samen 200 Mikroliter Zellen in einem Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und ermöglichen die Zellen für ein paar Tage in einem 37 Grad Celsius Inkubator zu erholen. Pellet die restlichen 100 Mikroliter sortierter Zellen mit maximaler Geschwindigkeit für fünf Minuten und extrahieren Sie die genomische DNA aus dem resultierenden Pellet nach Standard-DNA-Extraktionsprotokollen.
Als nächstes fügen Sie 10 Mikroliter Polymerase-Kettenreaktionspuffer, einen Mikroliter Desoxynukleotid-Mix, 2,5 Mikroliter benutzerdefinierter Reverseprimer, 0,5 Mikroliter DNA-Polymerase, zwei bis fünf Mikroliter der extrahierten genomischen DNA-Vorlage und genügend doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die Reaktion auf ein Endvolumen von 50 Mikrolitern zu bringen. Führen Sie das Gemisch auf einem thermischen Cycler aus und lösen Sie die Reaktion auf einem 2%Agarose-Gel mit 1X TAE Puffer nach Standardprotokollen. Verwenden Sie ein sauberes, scharfes Skalpell, um das Polymerase-Ketten-Reaktionsprodukt zu verbrauchen und die DNA mit einem Gel-Extraktionskit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen.
Messen Sie die Konzentration des Produkts mit einem Spektralphotometer bei einer Absorption von 260 Nanometern. Bereiten Sie einen Assay-Mix vor, der 200 Nanogramm der isolierten DNA, zwei Mikroliter T7-Endonuklease-I-Reaktionspuffer und genügend doppelt destilliertes Wasser enthält, um das endige Volumen der Mischung auf 19 Mikroliter zu bringen. Reanneal das Polymerase-Kettenreaktionsprodukt in einem thermischen Cycler an den angegebenen Parametern und mischen Sie fünf Einheiten T7 Endonuklease I mit dem reannealed Produkt für eine 50-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius.
Am Ende der Inkubation, lösen Sie die verdaute DNA auf einem 2,5%Agarose-Gel mit 1X TAE Puffer, und bilde das Gel auf einem geeigneten Gel-Bildgebungssystem. Öffnen Sie das Gelbild in ImageJ, und zeichnen Sie ein rechteckiges Feld um das Band so nah wie möglich an seiner Grenze. Klicken Sie auf Analysieren und Festlegen von Messungen, um zu bestätigen, dass die Flächen,mittelgrauen Werte und integrierten Dichteoptionen aktiviert sind.
Klicken Sie auf OK, und wählen Sie Analysieren und Messen aus. Der Mittlere oder Rohintensitätsdichtewert ist bezeichnend für die Bandintensität. Wenn die kulturtransfizierten Zellen beginnen, konfluent zu werden, lösen Sie sie mit Trypsin-EDTA, wie gezeigt, und säen Sie die Zellen spärlich in einer 100-Millimeter-Gewebekulturschale, um genügend Raum für einzelne Kolonien zu lassen, um zu wachsen, bevor sie die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen.
Wenn die Kolonien zu bilden beginnen, verwenden Sie ein Mikroskop mit einer Vier X Vergrößerung, um die einzelnen Kolonien für den Transfer in einzelne Brunnen einer 24-Well-Platte mit 500 Mikroliter Zellkulturmedium pro Brunnen zu pflücken. Achten Sie darauf, dass Ihr Tipp die umliegenden Kolonien nicht berührt, um das Mischen von Kolonien in einzelnen Brunnen zu verhindern oder aus einem Gebiet mit spärlichem Koloniewachstum zu pflücken. Wenn alle Klone gepflückt wurden, legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator, bis die Kulturen konfluent werden.
Da unverdaute Plasmide super-coiled sind, neigen sie dazu, schneller zu laufen als ihre linearisierten Gegenstücke. Um festzustellen, ob die Oligonukleotide erfolgreich in das CRISPR-Plasmid-Rückgrat geklont wurden, wird Kolonie-PCR durchgeführt und die positiven Klone werden geimpft, bevor die Plasmide extrahiert und zur Sanger-Sequenzierung gesendet werden. Das fluoreszierende Signal kann bei erfolgreicher Abgabe der Plasmide leicht unter dem Mikroskop visualisiert werden, so dass die transfizierten Zellen nach Durchflusszytometrie sortiert werden können.
Ein T7-Endonuklease-I-Test wird durchgeführt, um die Spalteffizienz der genomischen DNA zu überprüfen, wie aus den Intensitäten der Bänder berechnet, die auf einem Agarose-Gel beobachtet wurden. Wenn ein homologiegesteuertes reparaturbasiertes Experiment eine Restriktionsstelle am Zielort einbezieht, kann ein Polymorphismus-Assay für Restriktionsfragmentlängen mit einem entsprechenden Restriktionsenzym durchgeführt werden. Um weiter zu validieren, ob ein Protein-Codierungsgen erfolgreich inaktiviert wurde, kann ein Western-Blot durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass kein zielgerichtetes Protein vorhanden ist.
Durch das Sortieren der Zellen nach der Transfektion werden die Zellen ohne eingearbeitete Plasmide eliminiert, wodurch der Prozentsatz der Zellen, die in späteren Stadien als Knock-out- oder Knock-in-Gen gescreent werden, erhöht wird. Mit der Entwicklung dieser Technik sind wir nun in der Lage, Knock-out-Zelllinien zu produzieren, um die Genfunktion und Knock-in-Zelllinien zu untersuchen, um spezifische Krankheiten zu modellieren, um ihren Mechanismus zu verstehen.
