1. Ausdruck und Isolation von Zielproteinen mit einem Insekt Zelle Baculovirus-vermittelten Expressionssystem
<ol><li>Direktional Klonen Sie PCR-Produkte von Zielproteinen von Stubenfliegen Blunt beendet.<ol>
<li>Design-PCR Primer grün fluoreszierenden Proteins (GFP) und das Haus fliegen MdαE7 gen basierend auf ihre Sequenzen und die besonderen Anforderungen des gewählten Vektors (Tabelle 1).</li>
		<li>Verwenden Sie ein Lektorat, thermostabile DNA-Polymerase und Primer aus Schritt 1.1.1 150 µL-PCR-Reaktion (30 µL Puffer Reaktion, 3 µL 10 mM dNTPs, 1,5 µL DNA-Polymerase, 6 µL Haus fliegen Schablone DNA, 7,5 µL vorwärts Grundierung durchführen 7,5 µL des rückwärts-Primer, mit Wasser zu einem Endvolumen 150 µL). Erhitzen die PCR-Reaktion auf 98 ° C für 30 s, gefolgt von 35 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 53 ° C für 30 s und 72 ° C für 60 s, und dann eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 2 min).<ol>
<li>Führen Sie eine 1 % Agarose-Gel mit 150 µL des PCR-Produktes.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Die Ziel DNA-Fragmente aus dem Agarose-mit einem scharfen, sauberen Skalpell Gel Verbrauchsteuern: 1317 bp für MdαE7 und 858 bp für GFP. Reinigen Sie die DNA mit im Handel erhältlichen Gel Extraktion Kit nach Herstellerangaben-Protokolls (Table of Materials). Die gereinigte DNA in 15 µL destilliertes Wasser auflösen.</li>
		<li>Führen Sie eine 1 % Agarose-Gel mit 1 µL gereinigte DNA-Integrität zu überprüfen. Verwenden Sie ein anderes 1 µL gereinigte DNA-Konzentrationen mit dem Spektralphotometer messen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ein Eintrag Plasmid für Zielproteine zu konstruieren<ol>
<li>Richten Sie das Klonen Reaktion. Mix frisch gereinigte DNA-Produkte aus Schritt 1.1.3 und handelsüblichen Eintrag Vektoren mit AttL-Websites (Table of Materials) in einem Molverhältnis von 1:1 (0,5-2 µL frische PCR-Produktes bei 70-200 ng/µL Konzentrationen: 0,5 µL Vektor). Dann fügen Sie 1 µL einer handelsüblichen Salzlösung (1,2 M NaCl2 und 0,06 M MgCl2) und fügen Sie Wasser zu einem Endvolumen von 6 µL. vorsichtig mischen und in 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Übertragen 4 µL des Klonens Reaktionsprodukte in Schritt 1.2.1 in 50 µL chemisch kompetenten E. Coli Zellen. Inkubation auf Eis für 30 min. Hitzeschock Zellen für 30 s im Wasserbad 42 ° C ohne schütteln.</li>
		<li>Setzen Sie den Schlauch wieder in Eis für eine weitere 2 min. Fügen Sie 250 µL Raumtemperatur S.O.C. Medium (2 % Tryptone; 0,5 % Hefeextrakt; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2; 10 mM MgSO4; 20 mM Glukose). Inkubation bei 37 ° C für 1 h mit sanft schütteln.</li>
		<li>Verbreiten von 50-200 µL der Bakterienkultur im Schritt 1.2.3 auf den selektiven LB-Platten (1 g Tryptone; 1 g NaCl; 0,5 g Hefeextrakt 1,5 g Agar in 100 mL destilliertem Wasser gelöst. Autoklaven und 0,1 % von 50 mg/mL Kanamycin hinzufügen). Brüten Sie LB-Platten für 16 h bei 37 ° C für das koloniewachstum.</li>
		<li>Wählen Sie 5 bis 10 Kolonien und wieder auszusetzen Sie einzeln in 5 µL destilliertes Wasser.</li>
		<li>Führen Sie PCR durch Zugabe von 5 µL Reaktion Puffer, 0,5 µL 10 mM dNTPs, 0,25 µL DNA-Polymerase, 1 µL der suspendierten Kolonien, 1,25 µL 10 µM M13 vorwärts Grundierung, 1,25 µL 10 µM-rückwärts-Primer des Zielgens und Wasser zu Endvolumen von 25 µL. Erhitzen der PCR Reaktion auf 98 ° C für 30 s, gefolgt von 35 Zyklen von 98° C für 10 s, 53 ° C für 30 s und 72 ° C für 60 s, und dann eine letzte Verlängerung bei 72 ° C für 2 min (Tabelle 1).</li>
		<li>Re Kultur 3 µL der suspendierten Kolonien aus Schritt 1.2.5 in TB Medien (100 mL Phosphatpuffer mit 0,17 M KH2PO4 und 0,72 M K2HPO4 mit 450 mL Basis Brühe 6 g Tryptone, 12 g Hefe und 2 mL-haltigem medium Glycerin, sterilisiert, mit 0,1 % 50 mg/mL Kanamycin) für 16 h extrahieren hochreine Plasmid-DNA nach Protokoll des Herstellers.</li>
		<li>Einsatz 200 ng/µL hochreine Plasmid aus Schritt 1.2.7 für kommerzielle Sanger Sequenzierung mit vorwärts- und Primern M13. Überprüfen Sie die korrekte Einführung des Zielgens in Vektor basierend auf der Reihenfolge Karte vom Hersteller bereitgestellt.</li>
		<li>Speichern Sie die Sequenz verifiziert hochreine Plasmid DNA-Proben von MdαE7 und GFP bei-20 ° C. Hinweis: Dies sind die Eintrag Plasmid DNA-MdαE7 und GLP.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Erstellen eines rekombinanten Baculovirus Durchführung Lambda Rekombination (LR) Reaktion.<ol>
<li>Mischen Sie jeweils 1 µL von 300 ng/µL Eintrag Plasmid DNA der GFP, MdαE7 aus Schritt 1.2.7 oder Eintrag Plasmid DNA von Chloramphenicol-Acetyltransferase-gen (CAT) durch die Zelle Transfektion Kit mit 5 µL der im Handel erhältlichen (mit AttL Seiten) zur Verfügung gestellt C-Begriff lineare DNA (mit AttR Seiten) in 250 µL PCR-Röhrchen. Fügen Sie zu einem Gesamtvolumen von 8 µL TE-Puffer. Hinweis: Die Reaktionen der GFP und Katze dienten als Kontrollgruppe.</li>
		<li>Fügen Sie 2 µL der handelsüblichen Lambda Rekombination (LR) Enzym-Mix (Table of Materials) in jeder Mischung aus Schritt 1.3.1, die LR-Reaktion zu katalysieren. Vorsichtig mischen Sie und inkubieren Sie bei 25 ° C über Nacht (≈16 h). Hinweis: Die LR-Reaktion erleichtert die Rekombination eine AttL-haltigen Eintrag Plasmid DNA mit einem AttR-haltigen C-Begriff lineare DNA, eine AttB-haltigen mit dem Ausdruck ihrer Virus zu generieren. Dieser Schritt liefert der rekombinanten Baculovirus für jedes Zielprotein.</li>
		<li>Verdünnen Sie 1 µL LR Reaktionsprodukte aus Schritt 1.3.2 20 X. Führen Sie PCR unter Verwendung eines Polyhedrin vorwärts Grundierung und V5-rückwärts-Primer (Tabelle 1). Verwenden Sie 5 µL des PCR-Produkte auf einem 1 % Agarosegel um die Qualität zu überprüfen. Abbildung 1 zeigt ein Beispiel für die LR Reaktionsprodukt von MdαE7 gen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig1.jpg"> Abbildung 1: Beispiel-Ergebnisse der MdαE7 LR Reaktion durch PCR-Analyse. Verdünnen Sie 2 µL der LR Reaktion 200-fach und verwenden Sie 2 µL der Verdünnung mit Polyhedrin forward Primer und V5-rückwärts-Primer, um eine 25 µL PCR durchzuführen. Verwenden Sie 5 µL des PCR-Produkte um 1 % Agarosegel überprüfen die Qualität der LR Reaktion auszuführen. ein
<ol start="4"><li>Transfizieren Sf9 Insektenzellen<ol>
<li>Kultur Sf9 Insektenzellen mit 5 mL der vollständige Zelle Wachstum mittlerer (serumfreien Medium mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS)) T25 behandelt Fläschchen bei 27 ° c.</li>
		<li>Entfernen Sie den überstand und bündig unten angebracht Zellen mit 3 mL komplette Frischzellen Wachstumsmedium. Übertragen Sie 0,5 mL neu suspendierten Zellen in einem neuen T25 behandelt Kolben. 4,5 mL komplette Wachstumsmedium hinzugeben. 3-4 Tage bis zur nächsten Übertragung bei 27 ° C inkubieren.</li>
		<li>Samen 2 mL der Log-Phase Wachstum Insekt Sf9 Zellen Kultur (≈3.0-5.0 × 106 Zellen) gleichmäßig auf die Zellkultur gut. Können Sie Zellen für mindestens 3 h bei Raumtemperatur in der Haube zu befestigen.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Zellhaftung durch die Beobachtung mit einem inversen Phase Mikroskop bei 250 X. Das Zellkulturmedium entfernen und ersetzen mit 2 mL Graces Insekt Medium.</li>
		<li>Transfektion Mischung A Lösung (8 µL der im Handel erhältlichen Zelle Infektion Reagenz (Table of Materials) mit 100 µL Graces Insekt Medium) und Transfektion Mischung B Lösung von jedem Zielgen (9 µL LR Reaktionsprodukte aus Schritt 1.3 vorbereiten mit 100 µL unsupplemented Grace Insekt Medium) in 1,5 mL Zentrifugieren Röhren, beziehungsweise.</li>
		<li>Mischen Sie vorsichtig Transfektion Mischung A und B zusammen durch Tippen auf die Rohre. Inkubation bei Raumtemperatur für 35 min in der Kapuze.</li>
		<li>Fügen Sie die Mischung gleichmäßig aus Schritt 1.4.6 tropfenweise auf die gesetzten Zellen aus Schritt 1.4.4. Brunnen mit Bändern verschließen und über Nacht bei 27 ° C inkubieren.</li>
		<li>2 mL Graces Insekt Medium mit 2 mL komplette Wachstumsmedium zu ersetzen. Fügen Sie 100 µM Ganciclovir in jedem Bohrloch negativ gegen nicht-rekombinante Baculovirus auswählen. Versiegeln Sie Brunnen mit Klebeband und inkubieren Sie bei 27 ° C für 72 h.</li>
		<li>Sammeln Sie 72 h Post Infektion Zellkulturmedium aus jedem Brunnen und übertragen Sie auf 1,5 mL Zentrifuge Röhren. Zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 5 min bei 4 ° C, Zellen oder großen Schmutz zu entfernen.</li>
		<li>Übertragen Sie den überstand in neuen 1,5 mL Zentrifuge Röhren. Bei 4 ° C mit vor Licht geschützt aufbewahren. Hinweis: Dies sind P1 Virus auf lagerlösungen für jedes Zielgen.</li>
		<li>Verstärken Sie den niedrigen Titer P1 virale bestand (1 × 105-1 × 106 Pfu/mL), eine hohe Titer P2 virale Aktie (5 × 107-1 × 108 Pfu/mL).</li>
		<li>Samen 2 mL der Log-Phase Wachstum Insekt Sf9 Zellen Kultur (≈3.0-5.0 × 106 Zellen) gleichmäßig auf die Zellkultur gut. Können Sie Zellen für mindestens 3 h bei Raumtemperatur in der Haube zu befestigen.</li>
		<li>Impfen Sie 5 µL P1 Virus Aktien erwarb Schritt 1.4.10 in der Zelle bzw. auch der Schritt 1.4.12, ausgesät. Fügen Sie 100 µM Ganciclovir in jede Vertiefung. Versiegeln Sie Brunnen zu und inkubieren Sie bei 27 ° C für 72 h.</li>
		<li>P2-Virus Stammlösungen der 72 h Post Infektion zu sammeln. Bei 4 ° C mit vor Licht geschützt aufbewahren. Hinweis: Dies sind P2 Virus auf lagerlösungen für jedes Zielgen.</li>
		<li>(Optional) Wiederholen Sie die Schritte 1.4.12-1.4.14 mit 5 µL P2 Virus Lager P3 Virus Stammlösungen zu sammeln. Hinweis: Dies sind P3 Virus auf lagerlösungen für jedes Zielgen.</li>
		<li>Speichern Sie alle konstruierten Baculovirus bei 4 ° C mit Lichtschutz. Hinweis: Die GFP und CAT-gen wurden diente als Kontrollgruppe. Abbildung 2 zeigten die Zellen wenn in verschiedenen Verstärkung Phasen von GFP-rekombinante Baculovirus infiziert.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig2.jpg"> Abbildung 2: Beispiel für infizierte Anzeichen für Sf9 Zellen in verschiedenen Baculovirus Verstärkung Phasen. Die Abbildung zeigt GFP-rekombinante Baculovirus Zellen unter Tageslicht und fluoreszierende Licht. In der Phase der P1-Infektion ist das Verhältnis der Infektion gering. In der Phase der Infektion der P2 war das Verhältnis der Infektion deutlich verbessert. In der Phase der P3-Infektion fast alle Zellen zeigten Symptome der Loslösung von Kultur Zellplatte, erhöht der Zelle Durchmesser sowie die Einstellung des Zellwachstums. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58106/58106fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="5"><li>Groß angelegte Ausdruck der Zielproteine in Sf9 Insektenzellen<ol>
<li>Kultur 10 mL Log Phase Wachstum Sf9 Insektenzellen mit vollständigen Wachstumsmedium in T25 unbehandelten Flaschen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL P2 Virus-Stammlösung (erhältlich im Schritt 1.4.14) um Zellkulturen im Schritt 1.5.1 für 72 h zu infizieren.</li>
		<li>72 h Post Infektion Zellkulturmedium zu sammeln. Zentrifuge bei 1.500 x g für 5 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Überstand und waschen Pellets zweimal mit 1 mL 0,1 M-PBS-Puffer (pH 7,5) zu verwerfen.</li>
		<li>Zelle Pellets mit 1 mL Insekt Zelle Proteingewinnung & Lyse Puffer (Table of Materials) vollständig zu lösen. Fügen Sie 10 % Glycerin in Zelle Lysis. Sofort bei-80 ° c Lagern</li>
		<li>Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1-1.5.5 mit P2 Virus Stammlösung CAT Proteine als die Kontrollgruppe dienen. Hinweis: Wiederholen Sie Schritt 1.5 in dreifacher Ausführung für unterschiedliche Protein Präparate.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) eine zellbasierte MTT Zytotoxizität Assay
<ol><li>Kultur 5 mL Log Phase Wachstum (1,5 bis 2,5 × 106 Zellen/mL) Sf9 Insektenzellen mit vollständigen Wachstumsmedium in T25 unbehandelten Flaschen.</li>
	<li>Fügen Sie 25 µL P1 Virus-Stammlösung (erhältlich im Schritt 1.4.14) um Zellkulturen in Schritt 2.1 für 48 h mit sanft schütteln bei 27 ° c zu infizieren.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mM standard Stammlösungen Permethrin in Acetonitril. Verwenden Sie Acetonitril, bis 6,25 mM, 50 mM, 25 mM und 12,5 mM durch Zugabe von 500 µL, 250 µL, 125 µL und 62,5 µL Permethrin Stammlösung in einem Gesamtvolumen von 1.000 µL bzw. zu verdünnen.</li>
	<li>Samen Sie gleichmäßig 200 µL des infizierten Zellkulturen aus Schritt 2.2 mit 300 µL kompletten Wachstumsmedium in 24-Well-Platte bei einer Dichte von 2 × 105 Zellen/mL ergänzt.</li>
	<li>Fügen Sie 4 µL Permethrin Standardlösungen (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM und 50 mM) in jede Vertiefung 400 µM und 100 µM, eine Endkonzentration 50 µM und 200 µM bzw. zu machen. Fügen Sie nur 4 µL Acetonitril in Vertiefungen für Zelle Lebensfähigkeit Berechnungen (Abbildung 3).</li>
	<li>Versiegeln Sie Platten mit Bändern zu und inkubieren Sie bei 27 ° C für 48 h mit Lichtschutz.</li>
	<li>5 mg/mL MTT (Thiazolyl blau Tetrazolium Bromid) Reagenz gelöst in Puffer vorzubereiten (2,0 g NaCl, KCl 0,05 g, 0,36 g NaH2PO4∙2H2O, 0,28 g NaH2PO4, 0,05 g KH2PO4 in 200 mL aufgelöst destilliertem Wasser, pH 7,5).</li>
	<li>2.6 Schritt nach 48 h Inkubation entfernen Sie Zellkulturmedium ohne Berührung der unteren fraktionslosen Zellschicht. Fügen Sie 200 µL MTT Reagenz in Schritt 2.7 in jede Vertiefung. Inkubation bei 37 ° C für 4 h bis dunkel violette Formazan Ausscheidungen in jede Vertiefung (Abbildung 3) gebildet.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C für 4 h bis dunkel violette Formazan Form in jedes gut ausfällt. Fügen Sie 500 µL von DMSO, Ausscheidungen (Abbildung 3) vollständig zu lösen.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58106/58106fig3.jpg"> Abbildung 3: Beispiel für MTT Ergebnisse. Nach 48 h post Infektion mit Virus-Stammlösung P1 CAT rekombinante Baculovirus Lösung gleichmäßig 500 µL Samenzellen CAT-gen in einer 24-Well Zellplatte Kultur zum Ausdruck zu bringen. Jeweils fügen Sie 4 µL Permethrin an eine andere Dosis (6,25 mM, 12,5 mM, 25 mM und 50 mM hinzu) in jeder Zeile die Endkonzentration an 400 µM und 100 µM, 50 µM und 200 µM vornehmen. Die Steuerelement-Reihe wurde mit Acetonitril nur behandelt und gekennzeichnet als CK in der Platte. (A) nach 48 h Inkubation bei 27 ° C verwerfen das Zellkulturmedium auf der oberen Ebene und ersetzen mit 200 µL gelb gefärbten MTT Reagenzien. Dann bei 37 ° C für 48 h dunkel lila farbigen Reduzierung Form ausfällt in jedes gut darauf hinweist, dass die Überlebens-Zellen in der Lage, die gelbe Farbe metabolisierenden inkubieren Sie MTT Reagenzien in den dunklen lila farbigen Niederschlag. (B) 500 µL DMSO Lösungsmittel wurde hinzugefügt, in jede Vertiefung den gebildeten Niederschlag aufzulösen. Der Extinktion Wert jedes gut war röntgenologisch Spektralphotometer bei 540 nm. Wie Permethrin Konzentrationen zu erhöhen, wird die Farbe allmählich ändern von dunkelrot, Hellrot, was darauf hindeutet, dass die Zelle künstliche schrittweise verringert wurden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58106/58106fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<ol start="10"><li>Übertragen Sie 200 µL des gelösten Lösung in 96-Well-Platte. Messwerte der Extinktion bei 540 nm mit einer Mikrotestplatte Reader (Table of Materials).</li>
	<li>Berechnen Sie Zellviabilität durch Vergleichen der Werte der Extinktion von Permethrin behandelt Zellen mit denen der nur Acetonitril behandelt Zellen.</li>
	<li>Wiederholen Sie für die Kontrollgruppe alle Schritte mit P2-Virus-Stammlösung von Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT) rekombinante Baculovirus erwarb Schritt 1.4.</li>
	<li>Wiederholen Sie 4 Mal für verschiedene Virus-Vorbereitungen.</li>
</ol>3. in-vitro- metabolische Assay
<ol><li>Bereiten Sie 100 mM standard Stammlösungen Permethrin in Acetonitril. Verwenden Sie Acetonitril, um 50 mM, 25 mM, 12,5 mM und 6,25 mM zu verdünnen. Erkennen Sie die entsprechenden Peakfläche unter jede Konzentration mittels HPLC. Erstellen und Berechnen der Standardkurve Permethrin anhand der Peakfläche mit verschiedenen Permethrin Konzentrationen.</li>
	<li>Messen der proteinkonzentrationen in Schritt 1.5 mit Bradford Methoden21.</li>
	<li>Bereiten Sie 700 µL Stoffwechselreaktion mit 40 µM Permethrin Standard und 1 mg von Proteinen, die in Schritt 1.5 in 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) aufgelöst. Inkubation bei 30 ° C für 2 h mit sanft schütteln. Vor Licht schützen.</li>
	<li>Die Reaktion durch Zugabe von 700 µL eiskaltem Acetonitril zu stillen. Inkubation bei 30 ° c für weitere 30 min. mit sanft schütteln. Vor Licht schützen.</li>
	<li>Zentrifugieren der Reaktionsmischung bei 16.000 x g für 2 min bei Raumtemperatur. Sammeln Sie die überstand und Filter durch einen 0,45 µm-Membran. Übertragen Sie die Filtration in ultraclean braunen Glasfläschchen für HPLC-Analytik.</li>
	<li>Ausführen der HPLC unter optimalen chromatographischen Bedingungen (Mobile Phase A: 90 % Acetonitril und 10 % Wasser; Die Mobile Phase B: 5 % Acetonitril angepasst auf pH 2,3 mit 85 % Phosphorsäure). Farbverlauf eluieren mit einer Durchflussmenge von 1 mL/min und Maßnahme bei einer Wellenlänge von 232 nm.</li>
	<li>Berechnen Sie die Erschöpfung Prozentsatz der Permethrin durch den Vergleich mit Reaktionen ohne Protein Probe hinzugefügt.</li>
	<li>Verwenden Sie CAT-Protein in Schritt 1.5.6 erhaltenen als Kontrolle dienen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte mit verschiedenen Protein-Präparaten im Schritt 1.5.7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+house+flies+from+the+United+States:+Resistance+levels+and+frequency+of+pyrethroid+resistance+alleles.">Insecticide resistance in house flies from the United States: Resistance levels and frequency of pyrethroid resistance alleles.</a> Pesticide Biochemistry and Physiology. 107 (3), 377-384 (2013).</li><li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+whole+transcriptomal+linkage+analysis+of+gene+co-regulation+in+insecticide+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">A whole transcriptomal linkage analysis of gene co-regulation in insecticide resistant house flies, Musca domestica.</a> BMC Genomics. 14, 803 (2013).</li><li>Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insecticide+resistance+in+mosquitoes:+impact,+mechanisms,+and+research+directions.">Insecticide resistance in mosquitoes: impact, mechanisms, and research directions.</a> Annual Review of Entomology. 60, 537-559 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+profiling+and+genetic+study+reveal+amplified+carboxylesterase+genes+implicated+in+temephos+resistance,+in+the+Asian+tiger+mosquito+Aedes+albopictus.">Transcriptome profiling and genetic study reveal amplified carboxylesterase genes implicated in temephos resistance, in the Asian tiger mosquito Aedes albopictus.</a> e0003771. 9, e0003771 (2015).</li><li>Grigoraki, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+gene+amplifications+associated+with+insecticide+resistance+in+Aedes+albopictus:+Geographical+distribution+and+evolutionary+origin.">Carboxylesterase gene amplifications associated with insecticide resistance in Aedes albopictus: Geographical distribution and evolutionary origin.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 11, e0005533 (2017).</li><li>Wheelock, C., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30, 75-83 (2005).</li><li>Feng, X., Li, M., Liu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxylesterase+genes+in+pyrethroid+resistant+house+flies,+Musca+domestica.">Carboxylesterase genes in pyrethroid resistant house flies, Musca domestica.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 92, 30-39 (2018).</li><li>Mosmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cellular+growth+and+survival:+application+to+proliferation+and+cytotoxicity+assays.">Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays.</a> J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).</li><li>Jarvis, D. 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J., Minor, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+viability+assays.">Cell viability assays.</a> Assay Guidance Manual. , (2013).</li><li>Wheelock, C. E., Shan, G., Ottea, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+carboxylesterases+and+their+role+in+the+metabolism+of+insecticides.">Overview of carboxylesterases and their role in the metabolism of insecticides.</a> Journal of Pesticide Science. 30 (2), 75-83 (2005).</li><li>Li, X., Schuler, M. A., Berenbaum, M. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Bradford+method+for+protein+quantitation.">The Bradford method for protein quantitation.</a> The protein protocols handbook. , 15-21 (2002).</li><li>Macauley-Patrick, S., Fazenda, M. L., McNeil, B., Harvey, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+protein+production+using+the+Pichia+pastoris+expression+system.">Heterologous protein production using the Pichia pastoris expression system.</a> Yeast. 22 (4), 249-270 (2005).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. 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A., Dmitrenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pitfalls+of+the+MTT+assay:+Direct+and+off-target+effects+of+inhibitors+can+result+in+over/underestimation+of+cell+viability.">Pitfalls of the MTT assay: Direct and off-target effects of inhibitors can result in over/underestimation of cell viability.</a> Gene. 574 (2), 193-203 (2015).</li></ol>

In den letzten Jahrzehnten haben heterologen Expressionssysteme verbreitet zu äußern und große Mengen von Proteinen, so dass Biochemische und funktionelle Bestimmung und Charakterisierung der Enzyme in Vitrozu isolieren. Bisher wurden mehrere verschiedene Modellsysteme wie Escherichia coli, Pichia Pastoris, Sacccharomyces Cerevisiaeund Spodoptera Frugiperda angepasst für rekombinante Proteinexpression und die Wahl des der in-vitro- System ist entscheidend für gro...

Insektizid-Widerstand ist derzeit ein wichtiges Thema der Haus Fliegenbekämpfung weltweit1,2. Bemühungen um den Mechanismus der Insektizid Widerstand bestimmen erleichtert dieses Problem besseren zu verstehen und somit für neue Strategien, um effektiv zu verhindern oder zu minimieren die Ausbreitung der Widerstand Entwicklung3. Carboxylesterases, haben eine Menge Aufmerksamkeit für ihre Rollen in Sequestrierung und metabolisierenden Insektizide in verschiedenen Insekten4,5,6als eines der wichtigsten Entgiftung Enzyme angezogen. Unsere früheren Studie identifizierte mehrere Carboxylesterases in Stubenfliegen und ihren Ausdruck Ebenen wurden nicht nur in der resistenten Stamm ALHF konstitutiv geregelt sondern können auch induzierte zu höheren Ebenen in Reaktion auf Permethrin Behandlungen7 . Allerdings müssen die funktionale Charakterisierungen dieser Carboxylesterase Gene in metabolisierenden Insektizide noch erkundet werden.
Seit dem ersten Bericht in den frühen 1980er Jahren8wurde eine Baculovirus-vermittelten Fremdgen Expressionssystems weithin wegen seiner hohen Protein-Produktions-Leistungsfähigkeit und eukaryotic Protein Verarbeitung Funktionen9eingesetzt. Diese binären System besteht aus zwei wesentlichen Elementen: die konstruierte rekombinante Baculovirus Bereitstellung fremder Gene in den Wirtszellen und die groß angelegte Expression interessiert Proteine von Zellen durch rekombinante Baculovirus infiziert. In den letzten Jahrzehnten das Baculovirus vermittelte Zelle Ausdruck System ist weit verbreitet, Tausende von rekombinanten Proteinen, Membrane-springen Proteine im Insekt von zytosolischen Enzyme bis zu produzieren und Säugetier-Zellen10. Unsere früheren Studie äußerte erfolgreich mehrere CYP450 Enzymen in Sf9 Insektenzellen mit diesem System11. In dieser Studie wir konstruiert eine Carboxylesterase-rekombinante Baculovirus Sf9 Insektenzellen infizieren, erkundet die Zelle Toleranz gegenüber unterschiedlichen Permethrin Behandlungen und groß angelegte ausgedrückt Carboxylesterase Proteine in Vitro für funktionale Exploration. Anstatt mehrere Carboxylesterase isozymen Mischungen von Insekten Homogenates wie von früheren Studien12,13angenommen, dieses Insekt Zelle Baculovirus-vermittelten Ausdruck System ermöglicht die Konkretisierung und Isolierung von gezielten Proteine für bessere Charakterisierung ihrer biochemischen und strukturellen Eigenschaften.
Tetrazoliumsalz Salz basierende Assays (MTT) ist ein Hochdurchsatz-kolorimetrischen Verfahren entwickelt und optimiert, um die Zellviabilität messen. Dieser Test basiert auf den Mechanismus, die nur lebende Zellen in der Lage metabolisierenden gelb gefärbten MTT Reagenz zu einem dunklen lila farbigen Formazan Niederschlag, farbmetrisch analysiert werden kann sind, nachdem in organischen Lösungsmitteln14aufgelöst, 15. Einige genauere aber zeitaufwändige Methoden, z. B. Trypan blau Ausgrenzung und das Thymidin Titration Assay16,17, wurden in den letzten Jahren entwickelt. Die zellbasierte MTT-Assay wird jedoch derzeit noch als die schnellste und einfach zu bedienen-Methode anerkannt, Zellviabilität schnell erkennen. Hier verwenden wir die MTT-Assay, um Zell Toleranz gegen insektizidbehandlungen zu erkunden. Die verbesserte Toleranz der Zellen wenn mit rekombinanten Baculovirus Carboxylesterase stark infiziert unterstützt die metabolische Rollen des Carboxylesterases gegen Insektizide, die wiederum ihre Beteiligung in Insektizid Widerstand schlägt.
Darüber hinaus wurde ein in-vitro- metabolische Test auch in dieser Studie durchgeführt. Im Vergleich mit allgemeinen Carboxylesterase Tests, mit denen gemeinsame Substrate wie α-Napthyl-Acetat (α-NA) und β-Naphthyl Acetat (β-NA) hydrolytische Tätigkeit der Carboxylesterases widerspiegeln, ist die in-vitro- metabolische Studie eine genaue Weg angesehen Aktivitäten der Carboxylesterases in Richtung Insektizide18direkt zu messen. Diese Methode wurde bereits erfolgreich in verschiedene Insekten eingesetzt, mehrere Cytochrom P450s in Verbindung mit Insektizid Widerstand11,19,20zu charakterisieren. Allerdings hat diese Methode noch nicht in Carboxylesterase Studien angewendet. Mit der Verfügbarkeit von Carboxylesterase Proteine produziert durch Baculovirus-vermittelten Expressionssystems kann eine in-vitro- metabolische Untersuchung der Carboxylesterases in Richtung Permethrin, führen wir die weitere starke Beweise für die Beteiligung bieten können der Carboxylesterases in Übertragung Pyrethroid-Resistenz im Haus fliegt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Q5 High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs inc.</td>
			<td>M0491L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit, with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K240020</td>
			<td>S.O.C medium and universal M13 sequence primers were included in this kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>K210002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gateway LR Clonase II Enzyme mix for BaculoDirectTM Kits</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>11791-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td>12562-019</td>
			<td>Cellfectin transfection reagent and ganciclovir were included in this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR-CAT plasmid</td>
			<td>Invitrogen by life technology</td>
			<td></td>
			<td>Included in BaculoDirect C-Term Linear DNA Transfection Kit, concentration: 0.5 ug/uL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum, Certified</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>10082-139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf9 cells in Sf-900 III SFM</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12659017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect Cell-PE LB Insect Cell Protein Extraction &#38; Lysis Buffer</td>
			<td>G Biosciences by A Geno Technology Inc</td>
			<td>786-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sf-900 III SFM (1&#215;) Serum Free Medium Complete</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>12658-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grace&#39;s Insect Medium, unsupplemented</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>11595030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permethrin (isomers) analytical standard</td>
			<td>SUPELCO by Solutions WithinTM</td>
			<td>442748</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>67-56-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (analytical graded)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>75-05-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GHP Acrodisc 25 mm Syringe Filters with 0.45 &#956;m GHP Membrane (HPLC Certified)</td>
			<td>Pall Life Sciences</td>
			<td>21890388</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alliance Waters 2695 HPLC System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycle</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometers</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND2000CLAPTOP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional characterization of carboxylesterases in insecticide resistant house flies, musca domestica

Carboxylesterase vermittelte Stoffwechsel wird gedacht, um in Insektizid Widerstand bei verschiedenen Insekten eine wichtige Rolle spielen. Mehrere Carboxylesterase Gene wurden bis in die resistenten Haus fliegen Belastung geregelt gefunden, während ihre Rolle bei der Übertragung der Insektizid Widerstand blieb um erkundet zu werden. Hier haben wir ein Protokoll für die funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases entwickelt. Drei Beispiel-Experimenten werden dargestellt: (1) Ausdruck und Isolation von Carboxylesterase Proteinen durch ein Insekt Baculovirus-vermittelten Zellsystem Ausdruck Spodoptera Frugiperda (Sf9); (2) eine zellbasierte MTT (3-[4, 5-Dimethykthiazol-2-Yl] -2, 5-Diphenyltetrazolium-Bromid) Zytotoxizität Assay, Messen Sie die Toleranz von Insektenzellen gegenüber verschiedenen Permethrin Behandlungen; und (3) in-vitro- metabolische Studien, die metabolische Funktionen des Carboxylesterases in Richtung Permethrin zu erkunden. Die Carboxylesterase gen, die MdαE7 aus einem beständigen Haus geklont wurde Belastung ALHF fliegen und verwendet, um eine rekombinante Baculovirus für Sf9 Zellen Infektion zu konstruieren. Die Zelle künstliche gegen verschiedene Permethrin Behandlungen wurden mit dem MTT-Assay gemessen. Die verbesserte Zell Toleranz der Versuchsgruppe (MdαE7-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen) im Vergleich zu den Kontrollgruppen (CAT-rekombinante Baculovirus infiziert und GFP-rekombinante Baculovirus infizierte Zellen), permethrin in metabolisierenden Insektizide, dadurch Schutz der Zellen vor chemischen Schäden vorgeschlagenen Behandlungen die Funktionen des MdαE7. Darüber hinaus wurden Carboxylesterase Proteine in Sf9 Insektenzellen ausgedrückt und isoliert, um eine in-vitro- metabolische Studie durchzuführen. Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante in Vitro stoffwechseleffizienz des MdαE7 in Richtung Permethrin, direkt auf die Einbeziehung der Carboxylesterases in metabolisierenden Insektizide und verleiht somit Insektizid Widerstand im Haus fliegt.

Die Zellviabilität gegenüber verschiedenen Permethrin Behandlungen (MTT-Assay)
Die Zytotoxizität von Permethrin wurde im MdαE7-rekombinante Baculovirus infiziert Sf9 (Versuchsgruppe) und CAT-rekombinante Baculovirus (bereitgestellt von Baculovirus infiziert Kit) infizierte Zellen (Kontrollgruppe) untersucht. Die verstärkte Zelle Toleranzen zu Permethrin in MdαE7 mit dem Ausdruck Zellen stark unterstützen die metabolische Rol...

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Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Produktion Haus fliegen Carboxylesterase Proteine in Vitro mit einem Baculovirus vermittelte Insekt Ausdruck Zellsystem und später funktionell charakterisieren ihre Rolle bei der Metabolisierung Permethrin, dadurch konferieren pyrethroid Widerstand von zellbasierten MTT-Assay und in-vitro- metabolische Studien.

Funktionelle Charakterisierung von Carboxylesterases in Insektizid gegen Stubenfliegen, Musca Domestica

Carboxylesterase-mediated metabolism is thought to play a major role in insecticide resistance in various insects. Several carboxylesterase genes were ...

functional-characterization-carboxylesterases-insecticide-resistant

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

7.4K Aufrufe.  Auburn University. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Produktion Haus fliegen Carboxylesterase Proteine in Vitro mit einem Baculovirus vermittelte Insekt Ausdruck Zellsystem und später funktionell charakterisieren ihre Rolle bei der Metabolisierung Permethrin, dadurch konferieren pyrethroid Widerstand von zellbasierten MTT-Assay und in-vitro- metabolische Studien.

Serie: Functional Characterization of Carboxylesterases in Insecticide Resistant House Flies, Musca Domestica

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

Strukturelle Charakterisierung von Mannan Zellwand Polysaccharide in Anlagen, in denen Tempo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Forschung

Biochemie

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a high content of structural proteins. Dissected limb muscles from adult mice are physically disrupted by mechanical homogenisation, or a combination of mincing and douncing, in a hypotonic buffer before formaldehyde fixation of the cell lysate. The fixed nuclei are purified by further cycles of mechanical homogenisation or douncing and sequential filtrations to remove cell debris. The purified nuclei can be sonicated immediately or at a later stage after freezing. The chromatin can be efficiently sonicated and is suitable for chromatin immunoprecipitation experiments, as illustrated by the profiles obtained for transcription factors, RNA polymerase II, and covalent histone modifications. The binding events detected using chromatin prepared by this protocol are predominantly those taking place in the muscle fiber nuclei despite the presence of chromatin from other fiber-associated satellite and endothelial cells. This protocol is therefore adapted to study gene regulation in the adult mouse skeletal muscle.

A novel protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle adapted to the study of gene regulation in muscle fibers by chromatin immunoprecipitation is presented.

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The classic silver stains have certain drawbacks, such as high background staining, poor protein recovery, low reproducibility, a narrow linear dynamic range for quantification, and limited compatibility with mass spectrometry (MS). Now, with the use of a fluorogenic Ag+ probe, TPE-4TA, we developed a fluorescent silver staining method for the total protein visualization in polyacrylamide gels. This new stain avoids the troublesome silver reduction step in traditional silver stains. Moreover, the fluorescent silver stain demonstrates good reproducibility, sensitivity, and linear quantification in protein detection, making it a useful and practical protein gel stain.

Here, we describe a detailed protocol outlining a new fluorescent staining technique for total protein detection in polyacrylamide gels. The protocol utilizes a silver ion-specific fluorescence turn-on probe, which detects Ag+-protein complexes, and eliminates certain limitations of traditional chromogenic silver stains.

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences in a structurally similar protein, in order to determine the functional importance of these regions. Such chimeras are generated by means of a nested PCR protocol using overlapping DNA fragments and adequately designed primers, followed by their expression within a mammalian system to ensure native secondary structure and post-translational modifications. 
The functional role of a distinct region is then indicated by a loss of activity of the chimera in an appropriate readout assay. In consequence, regions harboring a set of critical amino acids are identified, which can be further screened by complementary techniques (e.g. site-directed mutagenesis) to increase molecular resolution. Although limited to cases in which a structurally related protein with differing functions can be found, chimeric proteins have been successfully employed to identify critical binding regions in proteins such as cytokines and cytokine receptors. This method is particularly suitable in cases in which the protein's functional regions are not well defined, and constitutes a valuable first step in directed evolution approaches to narrow down the regions of interest and reduce the screening effort involved.

Structurally related proteins frequently exert distinct biological functions. The exchange of equivalent regions of these proteins in order to create chimeric proteins constitutes an innovative approach to identify critical protein regions that are responsible for their functional divergence.

Festlegung der funktionellen Protein Regionen durch chimäres Protein Aufbau

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine exchangers in plants have not been identified. Here, we outline a method to characterize polyamine antiporters using membrane vesicles generated from the lysis of Escherichia coli cells heterologously expressing a plant antiporter. First, we heterologously expressed AtBAT1 in an E. coli strain deficient in polyamine and arginine exchange transporters. Vesicles were produced using a French press, purified by ultracentrifugation and utilized in a membrane filtration assay of labeled substrates to demonstrate the substrate specificity of the transporter. These assays demonstrated that AtBAT1 is a proton-mediated transporter of arginine, &#947;-aminobutyric acid (GABA), putrescine and spermidine. The mutant strain that was developed for the assay of AtBAT1 may be useful for the functional analysis of other families of plant and animal polyamine exchangers. We also hypothesize that this approach can be used to characterize many other types of antiporters, as long as these proteins can be expressed in the bacterial cell membrane. E. coli is a good system for the characterization of novel transporters, since there are multiple methods that can be employed to mutagenize native transporters.

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

We describe a method for the characterization of proton-driven membrane transporters in membrane vesicle preparations produced by heterologous expression in E. coli and lysis of cells using a French press.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in liver cancer, the modification by SUMO (Small Ubiquitin MOdifier) has been given the most attention. Isolation of endogenous SUMOylated proteins in vivo is challenging due to the presence of active SUMO-specific proteases. Initial studies of SUMOylation in vivo were based on the molecular detection of specific SUMOylated proteins (e.g., by western blot). However, in many cases, antibodies, generally made with non-modified recombinant protein, did not immunoprecipitate SUMOylated forms of the protein of interest.&#160;Nickel chromatography has been the other approach to study SUMOylation by capturing histidine-tagged versions of SUMO molecules. This approach is mainly used in cells stably expressing or transiently transfected with His-SUMO molecules. To overcome these limitations, SUMO-binding entities (SUBEs) were developed to isolate endogenous SUMOylated proteins. Herein, we describe all the steps required for the enrichment, isolation, and identification of SUMOylated substrates from human hepatoma cells and hepatic tissues from a liver cancer mouse model by using SUBEs. Firstly, we describe methods involved in the preparation and lysis of the human hepatoma cells and liver tumor tissue samples. Then, a thorough explanation of the preparation of SUBEs and controls is detailed along with the protocol for the protein pull-down assays. Finally, some examples are provided regarding the options available for the identification and characterization of the SUMOylated proteome, namely the use of western-blot analysis for the detection of a specific SUMOylated substrate from liver tumors or the use of proteomics by mass spectrometry for high-throughput characterization of the SUMOylated proteome and interactome in hepatoma cells.

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Here, we present a protocol to enrich, isolate, identify, and characterize proteins modified by SUMO in vivo both from human hepatoma cells and liver tumors obtained from mouse models of hepatocellular carcinoma by using SUMO-binding entities (SUBEs).

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Funktionelle Charakterisierung von RING-Typ E3 Ubiquitin Ligases In Vitro und In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These amyloid fibrils can sequester endogenous metastable proteins as well as components of the proteostasis network (PN) and thereby exacerbate protein misfolding in the cell. There are a limited number of tools available to assess the aggregation process of amyloid proteins within an animal. We present a protocol for fluorescence lifetime microscopy (FLIM) that allows monitoring as well as quantification of the amyloid fibrilization in specific cells, such as neurons, in a noninvasive manner and with the progression of aging and upon perturbation of the PN. FLIM is independent of the expression levels of the fluorophore and enables an analysis of the aggregation process without any further staining or bleaching. Fluorophores are quenched when they are in close vicinity of amyloid structures, which results in a decrease of the fluorescence lifetime. The quenching directly correlates with the aggregation of the amyloid protein. FLIM is a versatile technique that can be applied to compare the fibrilization process of different amyloid proteins, environmental stimuli, or genetic backgrounds in vivo in a non-invasive manner.

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Fluorescence lifetime imaging monitors, quantifies and distinguishes the aggregation tendencies of proteins in living, aging, and stressed C. elegans disease models.

Charakterisierung von Amyloidstrukturen im Altern C. Elegans mit Fluoreszenz-Lebensdauer-Bildgebung

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. This method combines expression of proteins tagged with the fluorescent non-canonical amino acid ANAP, and FRET between ANAP and fluorescent (trinitrophenyl) nucleotide derivatives. We present examples of nucleotide binding to ANAP-tagged KATP ion channels measured in unroofed plasma membranes and excised, inside-out membrane patches under voltage clamp. The latter allows for simultaneous measurements of ligand binding and channel current, a direct readout of protein function. Data treatment and analysis are discussed extensively, along with potential pitfalls and artefacts. This method provides rich mechanistic insights into the ligand-dependent gating of KATP channels and can readily be adapted to the study of other nucleotide-regulated proteins or any receptor for which a suitable fluorescent ligand can be identified.

This protocol presents a method for measuring adenine nucleotide binding to receptors in real time in a cellular environment. Binding is measured as F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between trinitrophenyl nucleotide derivatives and protein labeled with a non-canonical, fluorescent amino acid.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...