Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Bereichen Insektizid-Erkennung und Vektorkontrolle zu beantworten. Wie toxisch ist eine unformulierte Chemie für eine Population von Mückenlarven oder Erwachsenen? Hat die Chemie Entwicklungspotenzial als Larvizid oder Adultizid?
Und, was könnte der effektivste Lieferweg sein? Die Hauptvorteile dieser Technik sind, dass es verwendet werden kann, um die Toxizität von unformulierten Chemikalien zu bewerten Die Toxizität einer Chemie gegen mehrere Arten von Vektormücken, und es kann bis zu Hunderten von Verbindungen in hoher Durchsatzkapazität bewertet werden. Demonstriert wird das Verfahren von Jasleen Kaur, einer wissenschaftlichen Technikerin aus meinem Labor.
Zunächst beschriften Sie die Brunnen einer 24-Well-Gewebekulturplatte. Verwenden Sie eine analytische Waage, um die Testverbindung zu wiegen. Lösen Sie dann die Verbindung in sterilem doppelt destilliertem Wasser in einem 1,5 ml-Rohr, was zu einer 80mM-Stammlösung führt.
Anschließend wird die Stammlösung mit doppelt destilliertem Wasser seriell verdünnt, um Arbeitsstofflösungen der gewünschten Konzentrationen vorzubereiten. Beachten Sie, dass die Larven den Brunnen hinzugefügt werden, während der Entfernung von überschüssigem Wasser, und wenn die Testchemie hinzugefügt wird, um körperliche Schäden an den Larven zu vermeiden. Verletzungen können die Sterblichkeit erhöhen und somit falsche positive Ergebnisse hervorbringen oder den Test ungültig machen.
Verwenden Sie eine breite Bohrung Kunststoff TransferPipette fünf Drittel inStar Larven auf jeden Brunnen der Platte zu übertragen. Verwenden Sie dann eine 1 ml Pipette, um das Wasser vorsichtig zu entfernen, und ersetzen Sie es durch das gewünschte Volumen an doppelt destilliertem Wasser. Achten Sie darauf, die Larven nicht zu berühren, wenn das Wasser schnell zu entfernen, um sicherzustellen, dass die Larven nicht auslöschen, und fügen Sie vorsichtig die Testchemie durch Pipettieren gegen die gegenüberliegende Seite des Kunststoffbrunnens hinzu.
Fügen Sie jedem Bohrgut ein geeignetes Testvolumen hinzu und drehen Sie die Platte vorsichtig, um eine gleichmäßige Mischung zu gewährleisten. Platzieren Sie die Platte in einer Wachstumskammer, die 12 Stunden Licht/Dunkel-Zyklus bei 25 Grad Celsius mit 75 bis 85 Prozent relativer Luftfeuchtigkeit aufrechterhält. Um die Larvenbewegung zu überprüfen, tippen Sie vorsichtig auf die Platte.
Wenn keine Bewegung beobachtet wird, berühren Sie die Larve vorsichtig mit einem sterilen Zahnstocher. Bewerten Sie die Larve als tot, wenn keine Antwort bemerkt wird, und verwenden Sie ein Scoresheet, um die Gesamtzahl der toten Larven in jedem Brunnen zu den im Textprotokoll beschriebenen Zeitpunkten aufzuzeichnen. Kultur drei bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken in einem 20-Liter-Plastikkäfig.
Etikettieren Sie neun Unzen Papierbecher mit dem Namen und der Konzentration der Prüfmasse. Als nächstes bereiten Sie eine 10mg/ml-Stammlösung der Prüfverbindung in Aceton in einer 20ml Glasdurchstechflasche vor. Anschließend wird die Lagerlösung seriell verdünnt, um die gewünschten Arbeitskonzentrationen zu erhalten.
Reinigen Sie die eine ml Glasspritze mit Aceton. Dann mit der Testlösung in der entsprechenden Konzentration füllen. Befestigen Sie die Spritze in einem Mikro-Applikator, der auf ein Volumen von 0,25 uL eingestellt ist.
Als nächstes verwenden Sie einen Aspirator, um 10, drei bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken aus dem Käfig zu entfernen. Anästhesisieren Sie sie für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Dann die Mücken auf eine Petrischale übertragen.
Legen Sie das Gericht für 10 Minuten auf Eis. Um zu vermeiden, dass die erwachsene Mücke, die zur Sterblichkeit beitragen könnte, zu schädigen, stellen Sie sicher, dass sie nicht mehr als fünf Minuten im Kühlschrank beäscht oder mehr als 10 Minuten lang auf Eis immobilisiert werden, und minimieren Sie den Umgang mit den Mücken. Wenn Sie Zugang zu einer kalten Platte und einem Mikromanipulator mit einer beweglichen Stufe haben, kann dies den Umgang mit den Mücken weiter minimieren.
Verwenden Sie eine feine Pinzette, um jede Mücke aus der Schale zu entfernen. Mit der Spritze Mikroapplikator 0,25uL der Testlösung auf den dorsalen Thorax auftragen, unter einem Sezieren Mikroskop Next, übertragen Sie die Mücken auf einen beschrifteten Papierbecher auf Eis. Versiegeln Sie den Becher mit einem 10 x 10cm Mesh-Quadrat und einem Gummiband Dann, übertragen Sie ihn in die Wachstumskammer, und notieren Sie die Anzahl der toten Mücken wie zuvor beschrieben.
Sammeln Sie etwa 150 vier bis fünf Tage alte erwachsene weibliche Mücken mit einem Aspirator und übertragen Sie sie in einen separaten Käfig. Entfernen Sie die Zuckerquelle ein bis 24 Stunden vor dem Fütterungstest. Bereiten Sie eine 80mM Stofflösung der Prüfmasse in Wasser vor.
Dann, seriell mit Wasser verdünnen, um Arbeitsmateriallösungen der gewünschten Konzentrationen zu erhalten. Um die gewünschten Testkonzentrationen zu erhalten, fügen Sie 40uL jeder Verdünnung zu 960uL defibriniertem Kaninchenblut in einem 1,5 ml-Rohr hinzu und mischen Sie sie durch Pipetten. Legen Sie einen Elementfilter auf eine Zuführeinheit und versiegeln Sie ihn mit einem Gummiring.
Als nächstes verwenden Sie eine Pipette, um ein ml des Blutes mit Testlösung durch den Zustellanschluss zu übertragen, der sich auf der Rückseite der Zuführeinheit befindet. Befestigen Sie die Zuführeinheit an einer Heizeinheit. Dann die Membranoberfläche vorsichtig mit frisch zubereiteter 10-prozentigen Milchsäurelösung abwischen.
Legen Sie die Futtereinheit in den Käfig. Bedecken Sie den Käfig mit einem dunklen Tuch, und lassen Sie die Mücken für eine Stunde füttern. Nachdem die Mücken gefüttert haben, legen Sie den Käfig fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius in einen Kühlschrank, um sie zu beästhesieren.
Zählen und erfassen Sie dann die Gesamtzahl der Mücken im Käfig. Durch die Untersuchung des Bauches zählen und erfassen Sie die Gesamtzahl der vollständig und teilweise gefütterten weiblichen Mücken. Pro Dosis sollten mindestens 50 blutgefütterte Mücken erhalten werden.
Entfernen Sie alle Mücken, die nicht gefüttert haben. Übertragen Sie als Nächstes den Käfig in eine Wachstumskammer, und verwenden Sie ein Merkblatt, um die Anzahl der toten Mücken zu den entsprechenden Zeitpunkten aufzuzeichnen. Am dritten Tag nach der Blutfütterung einen Eierbecher 72 Stunden in den Käfig legen.
Verwenden Sie ein Sezieren des Mikroskops, um die Gesamtzahl der pro Behandlung produzierten Eier zu zählen. Ein Larvenkontakt-Assay wurde durchgeführt, um die Wirkung von Amitriptinin, einem Dopaminrezeptor-Antagonisten, auf die Larvensterblichkeit im Laufe der Zeit zu bewerten. Die Daten zeigten, dass der LC 50-Wert im Laufe des Experiments abnimmt.
Die Wirkung von Amitriptinin auf die Sterblichkeit erwachsener weiblicher Mücken wurde mit Bifenthrin und zwei negativen Kontrollen verglichen. Im Vergleich zu acetonbehandelten und unbehandelten Negativkontrollen induzierten sowohl Amitriptinin als auch Bifenthrin zu jedem experimentellen Zeitpunkt eine signifikante Sterblichkeit. Ein quantitativer Fütterungstest wurde durchgeführt, um die Wirkung von drei verschiedenen Dosen von Amitriptinin auf die Fruchtbarkeit und die prozentuale Sterblichkeit erwachsener weiblicher Mücken zu bewerten.
Die Daten zeigten keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Fruchtbarkeit von Amitriptinin gefütterten Mücken in der höchsten Dosis im Vergleich zu nur blutgefütterten Kontrollen. Einmal gemeistert, kann jeder der hier beschriebenen Assays in etwa zwei Stunden von einer einzelnen Person abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, sanft mit dem Organismus umzugehen, und es sollte Konsistenz bei topischen Anwendungen und beim Scoring Larven oder Erwachsenen-Assay geben.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Bio-Assays zur Bewertung der Toxizität über Absorption, durch den Mückentarsi, den CDC-Flaschentest und den WHO-Rohrtest durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Wirksamkeit der unformulierten Chemie oder eines formulierten Produkts und entwicklungsfähigen Entwicklungspotenzialals als Kontaktinsektizid oder Weltraumspray zu beantworten.
