Diese Methode könnte helfen, Schlüsselprobleme in den Bereichen Virologie und Mikrobiologie im Zusammenhang mit der Aufzählung von Bakteriophagen aus komplexen Proben und Bakteriophagen basierenden Diagnostiken und Therapeutika zu lösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine zeiteffiziente und genaue Quantifizierung einer großen Anzahl von Proben aus Phagen-Display-Biopanning-Experimenten ermöglicht, die mit herkömmlichen Assays nicht möglich sind. Demonstriert wird das Verfahren von Rashmi Mohanty und Jasmim Leal, Absolventen meines Labors.
Nach dem Entwerfen der Primer und der Erstellung einer Lagerkonzentration erhalten Sie Referenz T7 Phagen-DNA in einer Konzentration von 0,1 Mikrogramm pro Mikroliter. Mit Reinstwasser verdünnen Sie diese DNA seriell verzehnfacht, von einer Million Femtogrammen pro Mikroliter auf ein Femtogramm pro Mikroliter in 0,2 Milliliter PCR-Röhren. Bereiten Sie 20 Mikroliter jeder Konzentration vor, stellen Sie sicher, dass Diepipe-Spitzen und Wirbel der Rohre zwischen jeder Stufe der Verdünnung zu ändern.
Konvertieren Sie dann die DNA-Konzentration des T7-Phagens von Femtogrammen pro Mikroliter in Genomkopien pro Mikroliter. Zuerst Pipette 200 Mikroliter der Probe T7 Phagen Klon in eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr für jede der 10 gewünschten Proben. Fügen Sie zwei Mikroliter DNase zu jeder Röhre hinzu.
Die Rohre kappen und 10 Minuten lang in einem beheizten Trockenbad bei 37 Grad Celsius bebrüten. Dann bei 100 Grad Celsius für 15 Minuten in einem beheizten Trockenbad bebrüten. Zentrifugieren Sie die Rohre, die die wärmebehandelten Phagen bei 18, 534 mal g für 10 Sekunden enthalten.
Legen Sie die Zentrifugenrohre 10 Sekunden lang auf einen Wirbelmischer im Touch-Aktivierungsmodus, um die Phagen zu mischen. Drehen Sie wieder bei 18, 534 mal g für 10 Sekunden. Danach lassen Sie die Proben etwa eine Stunde auf der Laborbank, um sie auf Raumtemperatur abzukühlen.
Bereiten Sie den qPCR-Premix für 10 biopanierte Phagenproben unbekannter Konzentration und sieben Proben von Standardkonzentrationen in Dreifachen vor. Daraus ergibt sich ein Vormix für 51 Proben mit 255 MikroliterqPCR-Master-Mix, 51 Mikroliter Primer und 102 Mikroliter Wasser. Aliquot acht Mikroliter der vorbereiteten PCR mischen in 51 Brunnen einer 96-Well qPCR Platte.
Als nächstes fügen Sie zwei Mikroliter wärmebehandelten T7-Phagenproben zu jedem dieser Brunnen hinzu und geben sie unter der Oberfläche des qPCR-Vormixes ab. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie. Wickeln Sie die Platte in Aluminiumfolie, um fluoreszenz-Fotobleichungen zu minimieren, und fahren Sie dann mit dem Ausführen der Platte auf dem qPCR-Gerät fort.
Richten Sie die Zyklusbedingungen und Schmelzkurveneinstellungen wie im Textprotokoll beschrieben ein. Nachdem die qPCR ausgeführt wurde, werden das Amplifikationsdiagramm, das Schmelzkurvendiagramm und das Mehrkomponentendiagramm aus den Rohdaten analysiert. Das Amplifikationsdiagramm gibt an, ob die PCR-Verstärkung jeder Probe erfolgreich ist oder nicht.
Das Mehrkomponentendiagramm stellt die Verstärkung und den Zerfall des Fluoreszenzsignals während der Amplifikationszyklen dar. Während das Schmelzkurvendiagramm verwendet wird, um die Spezifität der Primer zu validieren, da jedes PCR-Produkt eine einzigartige Schmelztemperatur hat. Die Standardkurve wird dann aus der Referenz-DNA generiert.
Hier wird die Amplifikationseffizienz auf 92,4% berechnet. Wie hier zu sehen, ist die Anzahl der Phagen in der qPCR-Quantifizierung höher als im Plaque-Assay. Die Wiederholbarkeit der qPCR-Methode, dargestellt durch den Varianzkoeffizienten, hat Werte zwischen 2,85 und 27,2%Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass es zahlreiche Überlegungen bei der Entwicklung und Verwendung von qPCR gibt, um Phagen genau zu quantifizieren, einschließlich sorgfältiger Behandlung und Vorbereitung von Proben und Kalibrierung relevanter Geräte.
Nach dieser Methode können andere Techniken durchgeführt werden, um Phagenpartikel in einer Vielzahl von Anwendungen aufzuzählen, die in vivo Biopanning, Phagenbibliotheks-DNA-Vorbereitung und Sequenzierung und Phagendetektion der nächsten Generation in komplexen Umweltproben enthalten sind. Vergessen Sie nicht, dass Phagen als biologische Gefahren im Labor betrachtet werden und Vorsichtsmaßnahmen wie persönliche Schutzausrüstung, einschließlich Handschuhe und Labormäntel, sollten immer während der Durchführung des Verfahrens getragen werden.
