Diese Methode kann helfen, schlüsselhafte Fragen in der Pathophysiologie der frühen Arteriosklerose bei Mäusen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Effizienz, Schnelligkeit, mit der Aldosteron die Entwicklung von Arteriosklerose Plaques bei Erwachsenenwachstum induziert. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige technische Schritte allein durch Textanweisung schwer zu erlernen sind.
Demonstriert wird das Verfahren von Caterina Mammi, einer Mitarbeiterin aus meinem Labor. Mit chirurgischen Handschuhen befestigen Sie das Minipumpenfüllrohr an einer Ein-Milliliter-Spritze und beladen Sie das Rohr mit 125 Mikrolitern des Aldosterons oder der Fahrzeuglösung. Legen Sie das Füllrohr durch das Loch an der Oberseite der Minipumpe, bis es nicht weiter vorrücken kann und die Pumpe langsam mit der Aldosteron-Lösung füllen kann.
Beenden Sie das Befüllen der Pumpe, wenn eine Flüssigkeitsperle aus dem Pumpenkörper steigt, und entfernen Sie vorsichtig das Füllrohr. Setzen Sie den Durchflussregler in den Körper der Minipumpe ein, wobei darauf zu achten ist, dass der Regler fest gegen den Pumpenkörper gesät wird, und die gefüllte Pumpe in einem Becher mit steriler Lösung bei 37 Grad Celsius bis zu 24 Stunden vor der Implantation grundieren. Um die Pumpen zu implantieren, verwenden Sie ein Rasiermesser, um das Haar von der chirurgischen Stelle zu entfernen und die exponierte Haut mit 70% Isopropylalkohol getränkt, Vliespad Material zu desinfizieren.
Als nächstes machen Sie einen 0,8 bis 1 Zentimeter Großen Schnitt durch die Haut, aber nicht die zugrunde liegenden Gewebe und verwenden Zangen, um den Schnitt zu öffnen. Mit einem Trokar in der anderen Hand, verteilen Sie die Haut, um eine Tasche für die Pumpe aus dem Schnitt in Richtung des Schulterblattes zu erstellen und legen Sie die Pumpe in den Schnitt, mit dem Kopf des Reglers nach vorne der Maus ausgerichtet, sanft schieben die Pumpe vollständig in die Tasche, so dass es genug Haut, um die Wunde ohne Spannung oder Dehnung zu schließen. Sobald die Pumpe eingesetzt wurde, befestigen Sie den Schnitt mit chirurgischem Draht und verwenden Sie einen sauberen Tupfer, um topische, 10%Povidon Jodsalbe anzuwenden.
Dann lassen Sie die Maus auf einer wärmenden Stufe mit Überwachung bis zur vollen Recumbency erholen. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt perfuse Maus über den linken Ventrikel mit Schwerkraftperfusion mit 10 bis 15 Milliliter eiskaltem DPBS, gefolgt von 40 bis 50 Millilitern von 10% neutral gepufferter Formulierung. Legen Sie die Maus nach 10 bis 20 Minuten unter Stereomikroskop und verwenden Sie Zangen und Scheren, um das überschüssige periaortische und perikardäre Fettgewebe zu entfernen.
Halten Sie das feste Herz mit Zange und schneiden Sie senkrecht auf den Zugang des Aortenbogens, so nah wie möglich am Herzen, ohne Schäden zu verursachen. Sobald das Herz von der Aorta getrennt wurde, verwenden Sie ein Skalpell, um quer entlang einer geraden Linie zu schneiden, die unteren Punkte des rechten und linken Atriums zu verbinden und den oberen Teil des offenen Herzens mit einer optimalen Schnitttemperaturverbindung zu füllen. Legen Sie das resezierte Gewebe mit einer Kryo-Sektion Kunststoffform mit der Achse der Aorta senkrecht an der Basis der rechteckigen Form platziert und bedecken Sie das Gewebe mit frischem OCT.
Backlight die Form, um sicherzustellen, dass das Gewebe richtig ausgerichtet ist, dann legen Sie die Form vorsichtig auf eine Metallplatte auf Trockeneis, wickeln Sie die gesamte Form mit Silberfolie für minus 80 Grad Celsius Lagerung, wenn das OCT weiß wird. Wenn der Kryo-Stat minus 20 Grad Celsius erreicht, montieren Sie den gefrorenen Herzblock auf den Probenhalter mit dem ventrikulären nach außen gerichteten Ventrikulen und legen Sie den Probenhalter in den Probenorientkopf ein. Passen Sie die Ausrichtung des Probenhalters so an, dass der Block mit der Aortenwurzel senkrecht zur Klinge geschnitten wird, und schneiden Sie den Block, bis die Aortenwurzel erreicht ist.
Sammeln Sie serielle Abschnitte auf Glasschlitten und überwachen Sie das anatomische Aortenwurzelprofil, bis alle drei Aortenklappen erscheinen. Dann sechs bis acht, zehn Mikrometer dicke Abschnitte sammeln oder bis eines der drei Ventile verschwindet oder nicht mehr intakt ist. Für ölrote O-neutrale Fettfärbung, fixieren Sie die Abschnitte in 70 Milliliter 37%Formaldehyd für fünf Minuten, gefolgt von einer gründlichen Wäsche in Leitungswasser.
Nach zwei bis drei Minuten, ausdematoben Zugang Wasser und färben die Abschnitte in 70 Milliliter 0,3%Öl rot O für 10 Minuten. Am Ende der Inkubation die Dias in Leitungswasser für 10 Minuten waschen und die Zellen für eine Minute in 70 Milliliter Meyers Hämatoxylin färben, gefolgt von einer einminütigen Wasserwäsche und einer einminütigen Einlebung in 70 Milliliter0,5% Lithiumcarbonat. Waschen Sie dann die Zellen eine letzte Minute in Wasser und montieren Sie die Abschnitte mit einem wässrigen Montagemedium für die Bildgebung mittels Lichtmikroskopie.
Nach vier Wochen Behandlung zeigten Apolipoprotein-E-Knockout-Mäuse einen signifikanten Anstieg des Lipidgehalts im Vergleich zu kontrollwilden Tieren. Darüber hinaus erhöht die Aldosteron-Behandlung den Makrophagengehalt bei Knockout-Tieren, wie durch Mack-3-Färbung belegt wird und eine stärker entzündete atherosklerotische Plaque bei diesen Tieren im Vergleich zu fahrzeugbehandelten Mäusen zeigt. Die Behandlung von Aldosteron verändert jedoch nicht den Kollagengehalt atherosklerotischer Plaques.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass diese Methode nur für Apolipoprotein-Mäuse validiert wird, die natürlicherweise anfällig für Arteriosklerose sind, wenn sie mit einem atherogen Farbstoff gefüttert werden. Daher kann sie nicht auf verschiedene Tiermodelle angewendet werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Diefra-Färbung durchgeführt werden, um Arteriosklerose in anderen Aortenregionen zu charakterisieren und die gesamtatherosklerotische Belastung zu quantifizieren.
Nach seiner Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Arteriosklerose, um den frühen Mechanismus der Atherogenese zu erforschen, wie Entzündungen und Endothelfunktionsstörung. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüchtigen Verbindungen wie Isophan und Formalin extrem gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen von Sicherheitslabor Gesichtsmaske sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens genommen werden.
