Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit die Haupttodesursache. Mausmodelle sind nützliche Werkzeuge für die Untersuchung dieser Krankheit und unser Protokoll kann verwendet werden, um Arteriosklerose bei Mäusen zu quantifizieren. Mit diesem Protokoll kann die Läsionsgröße an drei Gefäßstellen gemessen werden.
Die Aortenwurzel, der Aortenbogen und die brachiocephale Arterie. Die Quantifizierung von Arteriosklerose bei Mäusen kann eine mühsame Aufgabe sein. Wir haben detaillierte Schritte vorgelegt, von denen wir hoffen, dass sie den Prozess beschleunigen können.
Einige dieser Schritte sind schwer schriftlich zu beschreiben. Wir hoffen, dass dieses Video Ihnen helfen wird, eine robuste atherosklerotische Läsionsgrößenanalyse zu erhalten. Nach der Ernte eines Mausherzes nach Standardprotokollen, legen Sie das Herz auf ein Korkbett, ventrale Seite nach oben unter einem Sezieren Mikroskop und verwenden Sie eine Nadel, um das Herz an den Korken durch die Spitze zu fixieren.
Halten Sie die Basis des Herzens mit anatomischen Zangen, verwenden Sie ein Skalpell in einem 20-Grad-Winkel kauadtinförmig in der sagittalen Ebene gehalten, und 20 Grad cranially in der transversalen Ebene, um die apikalen zwei Drittel des Herzens zu schneiden. Die Aortenwurzel und die Basis des Herzens in eine optimale Schnitttemperatur-Verbindung oder OCT einbetten und das Herz vorsichtig mit der Zange drücken, um die Aortenwurzel mit Verbindung zu füllen und Luftblasen zu entfernen. Übertragen Sie die Probe auf den Boden eines mit OCT gefüllten Kryomolds mit der Aortenwurzel senkrecht zur Bodenoberfläche und frieren Sie die Verbindung auf Trockeneis ein.
Dann die Gewebeprobe in einem Gefrierbeutel bei minus 80 Grad Celsius bis zum Kryosektionen aufbewahren. Um ein Pinning-Bett für die En-Face-Analyse vorzubereiten, falten Sie ein Segment von Paraffin-Wachsfolie acht mal, um eine flache 25 x 25 mm Oberfläche zu machen und wickeln Sie schwarze elektrische Isolationsband um den Film, um einen dunklen Hintergrund für die Aorta zu machen. Legen Sie ein Etikett auf die Rückseite des Anheftenbettes und notieren Sie die Maus-Identifikationsnummer mit einem Bleistift.
Übertragen Sie den Aortenbogen auf das Pinning-Bett und fügen Sie dem Gewebe einen Tropfen PBS hinzu. Reinigen Sie die Aorta mit hilfe eines Stereomikroskops vom verbleibenden periadventitialen Fettgewebe und verwenden Sie Vannas Schere und Dumont-Zangen, um das gesamte umgebende Fettgewebe sanft abzuschälen, ohne die Aorta zu manipulieren oder zu beschädigen. Als nächstes führen Sie die Vannas-Schere in das aortenhafte Lumen ein, um die Intimoberfläche freizulegen.
Beginnen Sie, die äußere Krümmung des aufsteigenden Bogens in distaler Richtung zu schneiden, die Zweige, einschließlich der brachiocephalen Arterie, weiter zu schneiden und den dorsalen Teil der absteigenden Brustregion zu schonen. Um die Intimfläche anzuzeigen, schneiden Sie die kleinere Krümmung auf und falten Sie die Aorta. Mit einem Mikro-Castroviejo-Nadelhalter den offenen Bogen zum Pinning-Bett mit dem stumpfen Ende der Minuten-Insektenstifte sichern, ohne die Probe zu dehnen, und biegen Sie die Stifte sanft von der Probe weg, während das Gewebe an Ort und Stelle gehalten wird.
Dann den gepinnten Bogen verdeckt in einer Petrischale von PBS bei vier Grad Celsius aufbewahren. Für sudanesische IV Färbung, spülen Sie das Exemplar für fünf Minuten in einer Petrischale von 70%Ethanol mit dem Bogen nach unten, bevor Sie das Exemplar auf eine Schale von Sudan IV Arbeitslösung für sieben Minuten übertragen. Am Ende der Inkubation spülen Sie die Probe mit zwei dreiminütigen Wärten in 80% Ethanol ab, um die normale Intimoberfläche zu entfärben, gefolgt von einer endgültigen Spülung in PBS, bevor das Gewebe in seine ursprüngliche Petrischale zurückgebracht wird.
Dann erhalten Sie Mikrographen unter einem Stereomikroskop, das mit einer Digitalkamera bei einer 10-fachen Vergrößerung verbunden ist, und erhalten Sie Bilder des in PBS getauchten gepinnten Bogens, indem Sie kleine Metallgewichte verwenden, um das Pinnbett an der Unterseite der Petrischale zu halten. Um Kryosections der eingebetteten Aortenwurzel zu erhalten, stellen Sie die Kryostattemperatur auf minus 20 Grad Celsius und die Schnittdicke auf 10 Mikrometer ein. Montieren Sie den OCT-Block, der die Aortenwurzel auf dem Probenhalter enthält, wobei das ventrikuläre Gewebe nach außen gerichtet ist.
Sichern Sie die Positionierung bei Bedarf mit einem zusätzlichen OCT. Die Aortenwurzel sollte nun senkrecht zur Messerklinge positioniert werden. Sammeln Sie die ersten Kontrollabschnitte mit Herzmuskelgewebe auf gewöhnlichen Mikroskop-Dias und überprüfen Sie alle 200 Mikrometer unter einem Lichtmikroskop das Fortschreiten durch das Gewebe.
Wenn die erste Aortenspitze erscheint, neigen Sie die Probe in Richtung der Punkt-Null-Spitze, um die Schnittebene an den beiden anderen Spitzen auszurichten, und zählen Sie jeden 10-Mikrometer-Abschnitt, der von Punkt Null abgeschnitten wird. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Abschnitten für die Analyse ab 90 Mikrometern und nach dem geplanten Dia, bis 800 Mikrometer von Punkt Null erreicht sind. Die Berechnung des Läsionsanteils der gesamten Gefäßfläche der Aortenwurzel macht die Daten weniger empfindlich gegenüber möglichen Winkelunterschieden während des Schnitts.
Darüber hinaus könnte es veranschaulichend sein, die Fläche unter der Kurve oder die Atherotoläsionsgröße pro Maus zu berechnen und die Daten in einem Punktdiagramm darzustellen, um einzelne Variationen innerhalb von Gruppen weiter zu visualisieren. Lesionale Lipidakkumulation kann durch Farbschwellen Öl rot O positive Bereiche der gesamten Läsionsfläche quantifiziert werden. Die rechten und linken Herzkranzgefäße weichen in der Regel um 250 Mikrometer von der Aorta von der Aortensinus ab, die oft mit den prominentesten Läsionsgrößen übereinstimmt.
Das Entfernen des dunklen Hintergrunds in repräsentativen Bildern der en face aortenäsischen Bögen kann die visuelle Darstellung verbessern. Die Läsionsgröße ist in der Regel innerhalb von Gruppen verteilt, sodass statistische Analysen mithilfe des T-Tests von Student zwischen Gruppen möglich sind. Wir empfehlen Ihnen, mit einigem Testmaterial zu üben, bis Sie ausreichende Fähigkeiten für die Verarbeitung Ihrer experimentellen Proben erworben haben.
Wenn die Läsionsgröße zwischen Gruppen unterschiedlich ist, sollten Sie den Mechanismus bestimmen, da eine Läsionszusammensetzungsanalyse in der Regel der nächste Schritt ist.
