Unser Protokoll hilft den Forschern, standardisierte experimentelle Pipelines zur phänotypischen Charakterisierung ähnlicher Populationen durch immunfluoreszierende Färbung zu implementieren. Mit dieser Technik können Forscher die ähnliche Zusammensetzung komplexer Krankheitsgewebe rigoros analysieren und qualitative und quantitative Analysen der Phänotypen der Zelltypen durchführen. Demonstriert wird das Verfahren von Sidney Mahan, einem Techniker aus meinem Labor.
Um das Tier auf die brachiocephale Arterienernte vorzubereiten, schneiden Sie das Peritoneum bis zum Brustbein, wobei Sie darauf achten, das Bauchgewebe nicht zu beschädigen. Und machen Sie zwei Schnitte an der mittleren Achsellinie durch den Thorax, wobei Sie darauf achten, das Herz und die Lunge nicht zu beschädigen. Schneiden Sie dann das Zwerchfell, um das Herz teilweise freizulegen.
Um die Maus zu übergießen, installieren Sie ein Gravitationsprofusionssystem, so dass der Druck der Profusionsflüssigkeit dem durchschnittlichen murinen Blutdruck entspricht, um eine konsistente Überfluss- und Aufrechterhaltung der Gefäßmorphologie zu ermöglichen. Dann überziehen Sie das Tier mit fünf Milliliter Raumtemperatur PBS, 10 Milliliter 4%Raumtemperatur Paraformaldehyd, und fünf zusätzliche Milliliter Raumtemperatur PBS. Schließen Sie eine 23 oder 25 Gauge Schmetterlingsnadel an das Gravitationsprofusionssystem an, und führen Sie PBS durch die Nadel, um die Luft aus den Rohren zu vertreiben, bevor Sie die Nadel in den linken Ventrikel einsetzen.
Nach der Sicherung der Nadel an Ort und Stelle, verwenden Sie Irisschere, um einen weniger als zwei Zentimeter Großen Schnitt im rechten Vorhof zu machen. Ernten Sie die gewebe von Interesse in frische 4%Paraformaldehyd. Um die brachiocephale Arterie freizulegen, verwenden Sie eine Schere, um einen Schnitt auf der Mittellinie des Brustbeins durch das Manubrium zu machen, und verwenden Sie Zangen, um beide Seiten des Brustkorbs zu ziehen, um die Brusthöhle vollständig zu öffnen.
Als nächstes legen Sie das Tier unter ein Sezieren Mikroskop, um die Karotis teilweise zu visualisieren, und verwenden Sie feine Pinzette, um die Muskeln, das Bindegewebe und das Fett zu ziehen, bis die rechte Karotise, brachiocephale Arterie, subklavische Bifurkation und Aortenbogen gereinigt und vom umgebenden Bindegewebe und Fett isoliert werden. Als nächstes verwenden Sie Zangen, um die rechte Karotis unter seiner Bifurkation zu greifen und einen ersten Schnitt über den Zangen zu machen. Dennoch, halten die Carotis, machen einen zweiten Schnitt durch die subklavische Arterie und machen die letzten beiden Schnitte durch den Aortenbogen auf beiden Seiten der brachiocephalen Arterie.
Dann sammeln Sie alle anderen vaskulären Gewebe von Interesse und legen Sie die brachiocephale Arterie und die anderen Gewebe in 4%Paraformaldehyd-Lösung über Nacht bei Raumtemperatur. Für die immunfluoreszente Färbung der brachiocephalen Arterie verwenden Sie ein Mikrotome, um 10 Mikrometerabschnitte durch die paraffineingebettete Gewebeprobe zu erhalten, bis durch die Lichtmikroskopie bestätigt werden kann, dass der Aortenbogen durchgeschnitten wurde und die brachiocephale Arterie sichtbar ist. Passen Sie die Ausrichtung des Blocks so lange an, bis das Gewebe vollständig senkrecht zur Mikrotomklinge ist, und erhalten Sie drei serielle 10 Mikrometer dicke Abschnitte der brachiocephalen Arterie pro Glasrutsche, bis die subklavische Bifurkation erreicht ist.
Wenn alle Abschnitte gesammelt wurden, hydratisieren Sie die Gewebeproben unter einer chemischen Haube mit zwei fünfminütigen Xylol-Tauchionen, gefolgt von einer fünfminütigen Tauchethanolserie wie angegeben und zwei fünfminütigen entionisierten Wassertauchionen. Als nächstes, inkubieren Dias in Antigen-Retrieval-Lösung, nach Standard-Protokolle, gefolgt von Heizung in einer Mikrowelle für 20 Minuten. Nach einer Stunde Abkühlung bei Raumtemperatur verwenden Sie einen hydrophoben Stift, um jeden Gewebeabschnitt einzukreisen.
Und blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit Sperrpuffer für eine Stunde bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Gewebeproben über Nacht bei vier Grad Celsius mit dem primären Antikörpercocktail von Interesse oder Isotyp übereinstimmenden IgG-Kontrollantikörpern kennzeichnen. Am nächsten Morgen, waschen Sie Dias dreimal in PBS für fünf Minuten pro Wäsche, gefolgt von einer einstündigen Inkubation in der entsprechenden fluoreszenz konjugierten sekundären Antikörper-Cocktail und DAPI für Nukleus Visualisierung.
Verwenden Sie dann ein für die Fluoreszenzmikroskopie geeignetes Montagemedium, um Coverlips auf den Dias zu montieren. Für die konfokale Mikroskopie-Bildgebung der beschrifteten Gewebeabschnitte verwenden Sie Abschnitte, die mit der IgG-Steuerung und primären Antikörpern befleckt sind, um die Empfindlichkeit, Laserleistung und den Offset des Detektors für jeden einzelnen Kanal einzustellen. Legen Sie dann die oberen und unteren Positionen für die Z-Stack-Erfassung fest, und bestimmen Sie die Dicke und Anzahl der zu bebildernden Stapel.
Wenn alle Bilder aufgenommen wurden, öffnen Sie die Bilder in ImageJ und öffnen Sie das Kanalwerkzeugbedienfeld und pseudofarben die verschiedenen Färbekanäle. Führen Sie die Farbkanäle zusammen. Alle Kanäle sollten auf demselben Bild sichtbar werden.
Schalten Sie einzelne Farbkanäle im Bedienfeld der Kanalwerkzeuge ein und aus, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Zählsymbol, um das Multi-Point-Werkzeug auszuwählen. Doppelklicken Sie auf das Zählsymbol, um das Punkt-Bedienfeld zu öffnen und den Typ und die Größe der Elemente auszuwählen, die zum Zählen der Zellen verwendet werden. Aktivieren Sie alle Anzeigen, und aktivieren Sie den DAPI-Kanal nur im Bedienfeld der Kanalwerkzeuge.
Wählen Sie dann den Zählerkanal Null aus und klicken Sie auf einzelne Kerne, die getaggt werden sollen, und scrollen Sie durch die Z-Stacks, um alle Kerne zu zählen, die innerhalb des Interessenbereichs befleckt sind. Die Anzahl der quantifizierten Einzelzellenereignisse wird unten im Punkt-Werkzeugbedienfeld angegeben. Wenn alle Kerne markiert sind, schalten Sie einen anderen Färbekanal ein und wählen Sie Zählerkanal eins aus, um die Zellen zu markieren, in denen es eine Kolokalisierung zwischen DAPI und der Antikörperfärbung gibt.
Für zytoplasmatische Färbung, wählen Sie Zellen mit Färbung um den Kern in der gesamten Tiefe des Kerns, überprüfen Mehrere Z-Stacks nach Bedarf. Die Ergebnisse können dann als Anzahl der Zellen zur Gesamtzahl der DAPI-positiven Zellen oder als Anzahl der Zellen pro Bereich innerhalb des Interessenbereichs ausgedrückt werden. Immunfluoreszierende Färbung mit Antikörpern, die auf phänotische Marker abzielen, wie gezeigt, ermöglicht es, Bilder von jedem einzelnen Marker-Färbung und Differentialinterferenzkontrast für die Abgrenzung von Bereichen von Interesse für die Einzelzellzählung zu erhalten.
Einzelzellzählung, um die Fülle verschiedener glatter Muskelzell-abgeleiteten Populationen zu bestimmen, kann dann mit ImageJ durchgeführt werden. Beispielsweise zeigte die Einzelzellzählungsanalyse im Faserkappenbereich dieser repräsentativen Querschnitte bemerkenswerte Unterschiede in der zellulären Zusammensetzung des Faserkappenbereichs zwischen Mäusen, die mit Anti-IL-1-Beta-Antikörpern behandelt wurden, und Mäusen, die mit einer isotypübereinstimmenden IgG-Kontrolle behandelt wurden. Tatsächlich war die Hemmung der IL-1 Beta mit einer Abnahme der YFP-positiven glatten Muskelzellen und einer Zunahme der Galectin-3-positiven Zellen verbunden.
Darüber hinaus wurde eine Abnahme der Anzahl der YFP-positiven glatten Muskelaorten alpha Actin-positive glatte Muskelzellen beobachtet. Während die relative Anzahl der glatten Muskelzell-abgeleiteten YFP-positiven Galectin-3-positiven Makrophagen an beiden brachiocephalen Arterienstellen signifikant erhöht wurde. Insbesondere hat die Hemmung von IL-1 Beta keine Auswirkungen auf die Gesamtzahl der osteochondrogenen Zellen innerhalb der Läsion, oder den Anteil der glatten Muskelzelle abgeleitet oder Makrophagen abgeleitet chondrogene Zellen.
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Strenge und Reproduzierbarkeit in der atherosklerotischen Läsionsanalyse zu verbessern, indem wichtige Schritte wie Gewebesammlung, -verarbeitung und -schnitt sowie Einzelzellzählung standardisiert werden. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um zusätzliche Gefäßbetten zu analysieren, die anfällig für atherosklerotische Läsionen wie die Aorta und die Aortenwurzel sind.
