Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in den Neurowissenschaften zu beantworten, wie die Veränderungen in der Neurochemie während der Naturgeschichte von neurologischen Erkrankungen. Der Hauptvorteil der vorgeschlagenen Mikrodialyse-EEG-Technik ist, dass ein solcher kombinierter Ansatz die Paarung von Veränderungen in der Neurotransmitter-Freisetzung innerhalb bestimmter Stadien der Krankheitsentwicklung und -progression ermöglicht. Beginnen Sie, indem Sie den Verstärker außerhalb des Faraday-Käfigs einschalten.
Öffnen Sie die EEG-Software und starten Sie die EEG-Erfassung und beobachten Sie das EEG-Signal, das durch nicht angeschlossene Kabel erzeugt wird. Als nächstes verbinden Sie das Tier mit dem gefesselten EEG-Aufzeichnungssystem, indem Sie den Kopf des Tieres zwischen zwei gestreckten Fingern einer Hand halten und die Anschlüsse mit der anderen freien Hand an den Elektrodensockel schrauben. Stellen Sie auf jedem Kanal des Verstärkers einen Verstärkungsfaktor entsprechend dem Elektrodensignal eines einzelnen Tieres ein, damit das EEG-Signal skaliert wird.
Dann lassen Sie das Tier den neuen Käfig für mindestens eine Stunde unter der direkten Beobachtung des Forschers erkunden. Passen Sie das Kabel entsprechend der Ware des Tieres an, und stellen Sie sicher, dass die Kabel die Bewegungen und die Liegehaltung des Tieres nicht stören. Überprüfen Sie schließlich die richtige Bildgestaltung auf den Videokameras, und starten Sie dann die Video-EEG-Aufnahme.
Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Mikrodialyse-Sonden für den ersten Einsatz gemäß der Bedienungsanleitung des Herstellers und füllen Sie sie mit Ringer-Lösung. Schneiden Sie dann 10 Zentimeter lange Stücke von FEP-Schläuchen und schließen Sie sie mit den Ein- und Auslasskanülen der Sonde mit den Schlauchadaptern in verschiedenen Farben an. Stellen Sie sicher, dass die Schläuche die Adapter ohne Totraum in allen Verbindungen berühren.
Entfernen Sie die Dummy-Kanüle aus ihrer Führungslinie mit der Pinzette, indem Sie den Kopf des Tieres fest halten. Setzen Sie die Mikrodialysesonde in die Führungskanüle ein und verwenden Sie Modellierton, um die Kanüle weiter zu festieren. Verbinden Sie das Tier anschließend mit dem angeschlossenen EEG-Aufzeichnungssystem.
Dann legen Sie das Tier in den Plexiglaszylinder und lassen Sie es die neue Umgebung erkunden. Folgen Sie den wachen und frei beweglichen Rattenbewegungen. Verbinden Sie dann den Einlass der Sonde mit einer abgestumpften 22-Spur-Nadel mit Ringer-Lösung mit den Schlauchadaptern an die 2,5-Milliliter-Spritze.
Schieben Sie einen Milliliter Ringer-Lösung in 10 Sekunden in die Sonde, indem Sie den Kolben der 2,5-Milliliter-Spritze kontinuierlich drücken. Prüfen Sie, ob der Tropfen der Flüssigkeit, der am Auslass erscheint, angezeigt wird, um zu bedeuten, wann die Sonde einsatzbereit ist. Schließlich füllen Sie die 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, durch Schlauchadapter mit Ringer-Lösung auf und montieren Sie sie auf die Infusionspumpe.
Starten Sie die Pumpe mit zwei Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie über Nacht laufen. Nachdem eEG per Video bestätigt hat, dass in der drei stündigen Probenentnahme keine Anfälle vorhanden sind, stoppen Sie die Pumpe, die die mit Ringers Lösung gefüllten FEP-Schlauchdosenträgt. Montieren Sie einen weiteren Satz von 2,5-Milliliter-Spritzen, die mit FEP-Schläuchen verbunden sind, mit Schlauchadaptern, die mit einer modifizierten Ringer-Lösung gefüllt sind, die 100 Millimolar-Kaliumlösung enthält.
Starten Sie die Pumpe mit zwei Mikrolitern pro Minute und lassen Sie sie laufen. Prüfen Sie, ob keine Luftblasen im System vorhanden sind, und stellen Sie sicher, dass der Schlauch die Adapter ohne Totraum in allen Anschlüssen berührt. Überprüfen Sie dann, ob der Tropfen der Flüssigkeit am Auslass erscheint, um zu begründen, wann die Sonde einsatzbereit ist.
Als nächstes verbinden Sie die FEP-Schläuche von Spritzen, die mit Ringers Lösung gefüllt sind, mit der Einlaufkanüle der Sonde in jedem Tier und warten Sie auf das Auftreten des Flüssigkeitstropfens an der Spitze des Auslasses. Schließen Sie den Auslass der Sonde an den FEP-Schlauch an, der zur Entnahme im Reagenzglas führt. Setzen Sie den FEP-Schlauch mit einer perforierten Kappe in das geschlossene 0,2-Milliliter-Reagenzglas ein und sorgen Sie dafür, dass das Rohr durch Fixieren mit einem Stück Modellierton an Ort und Stelle bleibt.
Nachdem Sie die Pumpe 60 Minuten lang mit zwei Mikrolitern pro Minute laufen lassen, ohne Proben zu sammeln, um das System auszugrenzen, sammeln Sie fünf aufeinander folgende 30-minütige Dialysatproben unter Basisbedingungen und lagern Sie Proben auf Eis. Schalten Sie nach 10 Minuten die Schläuche aus den Spritzen mit 100 Millimolaren Kaliumringerlösung auf normale Ringerlösung um und lassen Sie die Pumpe laufen. Nach der Entnahme des fünften Dialysats nach dem Ausgleich 20 Mikroliter-Dialysatfraktionen alle 10 Minuten für eine Stunde sammeln.
Dann sammeln Sie drei zusätzliche 30 Minuten Dialysatproben und stoppen Sie die Pumpe. Schließlich lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius nach dem Experiment bis zur HPLC-Analyse. Nach Abschluss des Experiments die verwendeten Mikrodialysesonden mit destilliertem Wasser abspülen und bis zum nächsten Gebrauch in einer mit sauberem destilliertem Wasser gefüllten Durchstechflasche aufbewahren.
Schließlich spülen Sie die gesamte Mikrodialyse einrichtung mit destilliertem Wasser, gefolgt von 70 Prozent Ethanol. Ersetzen Sie Ethanol durch Luft, und lagern Sie das Setup in einer sterilen Umgebung. Dabei handelt es sich um die repräsentativen EEG-Spuren, die während der chronischen Phase der Krankheit aus dem Hippocampus der Kontrolle und epileptischen Ratten aufgezeichnet wurden.
Bei Kontrollratten wurde keine EEG-Veränderung beobachtet, während eine synchronisierte paroxysmale epiptiforme Aktivität etwa 500 Millisekunden vor und während der Verhaltensanfälle bei epileptischen Ratten beobachtet wurde. Die Basalglutamatkonzentration bei chronischen epileptischen Ratten war signifikant höher als bei Kontrolltieren. Hoher Kalium evozierte eine zusätzliche Freisetzung von Glutamat für etwa 30 Minuten bei Kontrollratten und für etwa 60 Minuten bei chronischen epileptischen Ratten.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Tiere, die mit dem Gerät implantiert werden, dazu neigen, es während eines längeren Experiments zu verlieren, also verwenden Sie einen leichten Kopfsatz und ausreichend lange Kabel, um die Mobilität der Tiere zu vermeiden. Je nach Verfügbarkeit eines geeigneten analytischen Aufsatzes kann die Methode weiter verwendet werden, um verschiedene lösliche Moleküle im Gehirn zu testen, wenn gleichzeitig EEG-Aufzeichnung verwendet wird. Nach ihrer Entwicklung ermöglichte diese Technik den Forschern auf dem Gebiet der Epilepsie einen Einblick in die Veränderungen der exzitatorischen Neurotransmission im Falle einer zeitlichen Lappenepilepsie.
Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, vertrauen wir darauf, dass Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie eine in vivo Mikrodialyse zusammen mit der Tiefenelektrode EEG-Aufnahme in einer frei beweglichen epileptischen Ratte durchführen können.
