Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Biochemie wie Größe, Form und konforme Veränderungen von Biomolekülen und deren Komplexen zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Experimente unter physiologisch relevanten Pufferbedingungen in einer Umgebung durchgeführt werden können, in der Biomoleküle stabil sind. SAXS ist eine kostenlose Technik zu vielen anderen biophysikalischen und strukturbiologischen Methoden.
Die Kombination von SAXS mit diesen Methoden kann uns bei der Entwicklung strukturbasierter Therapeutika helfen. Obwohl diese Methode Einblicke in biomolekulare Komplexe geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie die Untersuchung von Nanopartika und Arzneimittelabgabeversicles angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, weil sie als überwältigender und komplizierter Prozess erscheint, von rohen Streudaten zu Strukturen mit niedriger Auflösung zu gelangen.
Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Pipeline der Datenanalyse, um Strukturmodelle aus Rohdaten zu erhalten, schwierig zu erlernen ist, da sie die Verwendung vieler verschiedener Softwarepakete umfasst. Es gibt einige Softwarepakete, die für die SAXS-Datenanalyse nützlich sind. Dazu gehören SCATTER, BioXTAS RAW und die ATSAS-Suite.
In diesem Video geben wir einen Überblick über die allgemeinen Schritte, die bei der Analyse von SAXS-Rohdaten mithilfe der ATSAS-Programmsuite zu tun haben. Installieren und laden Sie zunächst die ATSAS-Programmsuite. Öffnen Sie das PRIMUS/Qt-Programm, und wechseln Sie zur Option Menü öffnen.
Wählen Sie hier bis zu 13 interessierte Datendateien aus. Die Datendateien müssen im ASCII-Format vorliegen, in dem die erste Spalte die s-Vektorachse und die zweite Spalte die Intensität ist. Wiederholen Sie diesen Schritt für die nur Pufferdaten, indem Sie diese Daten in ein zweites Menü "Tools" einfügen.
Navigieren Sie als Nächstes zum Fenster Datenverarbeitung, und wählen Sie Subtrahieren aus. Dadurch wird eine subtrahierte Streukurve erzeugt, die nur die Streuung vom Makromolekül von Interesse darstellt. Um eine Guinier-Analyse durchzuführen, beginnen Sie mit einer puffersubtrahierten Streukurve, die in PRIMUS/Qt geladen ist.
Klicken Sie dann auf Radius of Gyration, wodurch der Primus Guinier Wizard geöffnet wird. An dieser Stelle wird ein Diagramm angezeigt, das das natürliche Protokoll der Intensität im Vergleich zu den quadrierten Streuwinkeln zeigt. Um einen vorläufigen Kreiselradius zu erhalten, suchen Sie das Fenster Eingabeaufforderung und verwenden Sie die Autorg-Funktion.
Nachdem Sie Autorg gedrückt haben, klicken Sie auf die obere Grenze nach oben, dann nach unten, um das Programm zu zwingen, die statistischen Messungen zu aktualisieren. Alternativ können Sie mehrere Dateien gleichzeitig eingeben, indem Sie auf dieselbe aufzeigende Eingabeaufforderung klicken und mehrere Namen für Datendateien auswählen, indem Sie sie auf die gleiche Weise wie zuvor beschrieben markieren. Um mit der Kratky-Analyse zu beginnen, klicken Sie auf , um den Namen der Datendatei auszuwählen.
Dadurch werden die Daten im Fenster geplottet. Wählen Sie dann Plot aus. Als nächstes, unter der Plot-Schaltfläche, klicken Sie auf Kratky Plot.
Als Ergebnis zeigen kugelförmige Proteine einen GALC-ean-Peak an, während entfaltete Proteine ein Plateau anstelle eines Peaks anzeigen und einem hyperbolischen Diagramm ähneln, wie es hier gezeigt wird. Lastpuffer subtrahierte Daten für jede Konzentration in PRIMUS/Qt erneut. Und klicken Sie unter der Registerkarte Verarbeitung auf Skalieren und überprüfen Sie jede Kurve und die i-Skala-Zahl, die mit den Verdünnungen aus der ursprünglichen Probe korreliert.
Führen Sie die Daten nach der Überprüfung zusammen, indem Sie im Fenster Verarbeitung auf die Schaltfläche Zusammenführen klicken. Um das Entfernungsverteilungsdiagramm zu generieren, laden Sie die zusammengeführten Datenkurven in PRIMUS/Qt, und klicken Sie dann auf der Registerkarte Analyse auf Entfernungsverteilung. Passen Sie den Datenbereich der zusammengeführten Daten an, um signifikante Sandgeräusche am Ende der Rohdaten zu vermeiden.
Lassen Sie auch Datenpunkte in der Nähe der Trägerplatte im Low-q-Bereich weg, indem Sie den niedrigeren Bereichswert auswählen und die Anzahl erhöhen. Um die Dmax zu bestimmen, beginnen Sie mit einem Bereich von fünf Mal dem Radius des Kreisels aus der Guinier-Analyse erhalten. Verringern Sie diesen Wert dann schrittweise, bis das Abstandsverteilungsdiagramm auf der y-Achse nicht abrupt auf Null fällt und keinen langen Schwanz hat, bevor es sich Null nähert.
Überprüfen Sie, ob der experimentelle Radius von Kreisel-Intensitätsdiagramm, der aus der Guinier-Annäherung abgeleitet wird, und der Entfernungsverteilungsradius von Kreisel-Intensitätszahlen ähnlich sind. Hier wird die Intensität des Streulichts gegen den Streuwinkel dargestellt, was sowohl auf die Qualität der Biomoleküle Nidogen-1, Laminin-Gamma-1 und deren Komplex als auch auf deren Form hindeutet. Die aus den Streudaten ermittelte Elektronenpaar-Entfernungsverteilung legt nahe, dass die Biomoleküle eine längliche Form haben, und das Kratky-Diagramm deutet darauf hin, dass sich die Proteine in einem gefalteten Zustand befinden, da die Daten dazu neigen, Plateau zu erreichen, oder sogar im größeren q-Bereich zuzunehmen und keine Glockenkurvenform aufweisen.
Darüber hinaus zeigen die Guinier-Plots, die Daten bei niedrigem Streuwinkel verwenden, den linearen Bereich zur Bestimmung des Kreiselradius an, der hier für Nidogen-1, Laminin-Gamma-1 und deren Komplex dargestellt wird. Zur Untersuchung von Protein-Protein-Komplexen wurde MONSA verwendet, um die niedrig auflösende Struktur des gesamten Nidogen-1-Laminin-Gamma-1-Komplexes zu erhalten, was darauf hindeutet, dass nur die C-Terminal-Region beider Proteine an der Vermittlung von Wechselwirkungen beteiligt ist, während der Rest der Domänen weit voneinander entfernt ist. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Synchrotron-Strahlung extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen und Sicherheit, die von jeder einzelnen Beamline beschrieben werden, sollten immer während der ersten Datenerfassung getroffen werden.
