Diese Methode beschreibt den vollständigen Weg der Konstruktion, Montage und Charakterisierung von Polyelektrolyt-Komplexen Mizellen, die Nanopartikel sind, die aus der Selbstmontage von entgegengesetzt geladenen Polymeren gebildet werden. Einige große Herausforderungen bei der Polyelektrolyt-Selbstmontage sind die Vermeidung kinetischer Fallen und die Charakterisierung der Nanopartikel. Die von uns beschriebene Salzglühtechnik ermöglicht die wiederholbare Montage von Mizellen mit geringer Dispergität in Größe und Form und wir beschreiben Charakterisierungsmethoden, einschließlich Lichtstreuung, Kleinwinkel-Röntgenstreuung und Elektronenmikroskopie.
Die Lieferung von therapeutischen Nukleinsäuren ist eine seit langem bestehende Herausforderung für die Nanomedizin. Diese Polyelektrolyt-Komplexmizellen nutzen die starke negative Ladung der Nukleinsäure, um sie im Kern der Micelle zu sequestrieren, wo die neutrale Polymerkorona sie vor Nukleasen und Immunantwort schützt. Das Montageverfahren sollte auf jede Art von geladenen Polymeren anwendbar sein.
Wir haben sie mit mehreren Polyanionen und Polykationen getestet, und die Charakterisierungsmethode sollte auf alle selbst zusammengesetzten Nanopartikel anwendbar sein, einschließlich Tensid-Nanopartikeln und anderen hydrophobisch angetriebenen Systemen. Beginnen Sie mit der Inkubation der Oligonukleotid-Lösung bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten. Nach der Inkubation 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen, um die Nukleinsäuren thermisch anzuglühen, dann 40 Mikroliter 20 Millimolar geladenen Konzentrationsdiblock-Copolymer hinzufügen.
Wirbeln Sie die Lösung sofort und inkubieren Sie sie für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Um das Salz-Anneal durchzuführen, fügen Sie der Oligonukleotid-Lösung Natriumchloridlösung für eine Endkonzentration von einem Molar hinzu und wirbeln Sie sie 10 Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit. Inkubieren Sie das Gemisch 10 Minuten bei Raumtemperatur, und laden Sie es dann in die Dialysepatrone.
Vor dem Laden Patronen mit permanentem Marker beschriften und mindestens zwei Minuten im Puffer einweichen, um die Membranen zu hydratisieren. Entfernen Sie die Kappe, indem Sie sich gegen den Uhrzeigersinn verdrehen, und laden Sie die Probe mit einer Gel-Ladepipettenspitze. Drücken Sie die Membran vorsichtig, um überschüssige Luft zu entfernen und die Kappe zu ersetzen.
Setzen Sie die Patronen in 1X PBS 0,5 molaren Natriumchlorid-Dialysebad, um sicherzustellen, dass sie mit beiden Membranen dem Bad ausgesetzt schwimmen. Nach 24 Stunden die Patronen in 1X PBS überführen und für weitere 24 Stunden einweichen. Nach der endgültigen Dialyse, erholen Sie die Probe, indem Sie die Patronen aus dem Bad entfernen, die Kappe entfernen und die Probe mit einer Gel-Ladepipettenspitze entfernen.
Legen Sie die Probe in ein sauberes 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr und kühlen Sie sie bis zur Gebrauchstauglichkeit. Bereiten Sie die Probe in DLS-Instrument nach Manuskriptrichtungen vor, und erfassen Sie dann Daten für mindestens eine Minute, um sicherzustellen, dass die Zählrate über die gesamte Erfassungszeit konstant ist. Untersuchen Sie die Autokorrelationsdaten.
Die lange Zeitbasislinie sollte flach sein und die Autokorrelationskurve sollte mit minimaler Streuung glatt sein. Das Rauschen in den Daten kann durch die Erfassung weiterer Daten verbessert werden. Um Datenreduktion und -analyse mit Irena durchzuführen, beginnen Sie mit dem Import von micelle in Hintergrunddatensätzen.
Zeichnen Sie die Probe und den Hintergrund zusammen auf einer Log-Log-Skala, und berechnen Sie das Verhältnis zwischen Stichprobe und Hintergrund und überprüfen Sie das hohe Q-Asymptote. Berechnen Sie das durchschnittliche Verhältnis über diesen Q-Bereich, und verwenden Sie das Datenmanipulationsmakro, um den Hintergrund mit dem berechneten Verhältnis zu skalieren. Zeichnen Sie dann das im Hintergrund subtrahierte Signal über Q und speichern Sie die Daten mit einem neuen Namen, um sicherzustellen, dass die ursprünglichen Daten nicht überschrieben werden.
Öffnen Sie das Modellierungsmakro, und laden Sie dann die subtrahierten Hintergrunddaten, und zeichnen Sie sie auf. Um ein ungefähres Modell für die Außenfläche des Polyelektrolyt-Komplexmicelle (PCM) zu finden, wählen Sie in den Datensteuerelementen den Bereich "Durchfluss bis mittelmittel Q" aus, um sicherzustellen, dass Schwingungen enthalten sind, wenn sie vorhanden sind. Wählen Sie in Modellsteuerelementen die erste Streuungspopulation aus, und stellen Sie sicher, dass sie die einzige wird.
Wählen Sie die Größenverteilung für das Modell aus, wählen Sie den gewünschten Verteilungstyp aus, und wählen Sie den Formfaktor aus. Dieses Beispiel ist für einen flexiblen Zylinder, der manuell unter dem Benutzerformfaktor hinzugefügt werden muss. Laden Sie den flexiblen Zylinderformfaktor herunter und fügen Sie ihn hinzu, und geben Sie dann die Funktionsnamen und Anfangswerte für die Parameter eins und zwei ein, die der Zylinderlänge bzw. der Kuhn-Länge entsprechen.
Diese Zylinder sind länger als von SAXS aufgelöst werden können, sodass der Zylinderlängenparameter auf einen großen Wert festgelegt ist. Legen Sie die Anfangsparameter für die Suche fest, indem Sie Werte in die Felder Skalierung, Mittelwertgröße und Breite eingeben. Klicken Sie dann auf Modell berechnen, um den resultierenden Formfaktor zu zeichnen.
Sobald vernünftige Parameter gefunden wurden, klicken Sie auf Modell anpassen, um eine nichtlineare kleinste Quadrate anpassung an die Daten auszuführen. Als nächstes modellieren Sie die Streuung der einzelnen Polymere innerhalb des PCM-Kerns. Passen Sie die Datensteuerelemente an, um den Q-Bereich auszuwählen, in dem eine übermäßige Streuung auftritt, die in der Regel im mittleren bis hohen Bereich liegt.
Fügen Sie eine zweite Streuungspopulation hinzu, und stellen Sie sicher, dass sie die einzige ist, die verwendet wird. Wählen Sie die einheitliche Ebene für das Modell aus, passen Sie die GDA-Faktoren G und RG an, um sicherzustellen, dass das Modell keine übermäßige Streuung bei niedrigem Q vorhersagt, und verwenden Sie das Anpassungs-PB zwischen Cursormakro, um eine erste Schätzung für diese Parameter zu erhalten. Führen Sie eine nichtlineare Anpassung für das Modell der einheitlichen Ebene aus.
Wenn ein Beugungsspitzenwert vorhanden ist, fügen Sie ein drittes Modell für die Beugungsspitze im Q-Interessenbereich hinzu. Sobald ungefähre Anpassungswerte für die einzelnen Streupopulationen ermittelt wurden, schalten Sie alle drei zusammen ein und optimieren Sie die kombinierte Passung. Überprüfen Sie schließlich, ob jeder Wert physisch angemessen bleibt, und speichern Sie die Anpassung, indem Sie den Speicher im Ordner auswählen.
Das Ergebnis dieses Verfahrens sollte ein zusammengesetztes Modell sein, das die Kleinen-Winkel-Röntgenstreudaten weit über einen großen Bereich von Größenmaßstäben beschreibt. Dieses Protokoll wurde verwendet, um Nukleinsäure-Polyelektrolyt-Komplexe Mizellen oder PCMs zu entwerfen, zu montieren und zu charakterisieren. Micelle-Kerngröße wird in erster Linie durch die Länge des geladenen Blocks des Blockcopolymers angetrieben und ist weitgehend unabhängig von der Länge des Homopolymers.
Dynamische Lichtstreuungsdaten wurden für sphärische PCMs erfasst, die aus relativ langen Blockcopolymeren in kurzen einsträngigen Oligonukleotiden gebildet wurden. Die Autokorrelationsfunktion ist auf einen flachen Wert mit der einzelnen Zeitskala zerfallen, was zu einem Spitzenwert der einzelnen Größe in der RepIS-Größenverteilung führt. Komplexe kleine Engel-Röntgenstreuung oder SAXS-Intensitätsspektren können genau passen, indem Modelle für die verschiedenen räumlichen Korrelationen kombiniert werden, die vorhanden sind, und Multiangle-Lichtstreuung kann verwendet werden, um Streumessungen auf längere Längenskalen zu erweitern.
PCMs unterschiedlicher Morphologie können auch mit Elektronenmikroskopie abgebildet werden, um zu überprüfen, ob Kernradien und Form mit den Werten übereinstimmen, die bei der Anpassung von SAXS-Daten erzielt wurden. Beim Anpassen von SAXS-Daten ist es wichtig, für jede Streufunktion Zuberücksichtigen und kostenlose Methoden wie TEM zu verwenden, um sicherzustellen, dass Sie den richtigen Formfaktor verwenden.
