Die hier gezeigten Flash-Nanopräzipitierungs- oder FNP-Techniken bieten eine skalierbare und unkomplizierte Plattform zum Verkapseln hydrophober oder hydrophiler Verbindungen in polymeren Nanopartikeln. Aus Gründen der Übersichtlichkeit wird die Technik, die zum Verkapseln von Biologika verwendet wird, als inverse Flash-Nanopräzis ( IFNP) bezeichnet. Die zugrunde liegenden Prinzipien bleiben unverändert, aber die resultierende Nanopartikelstruktur ist unterschiedlich.
Im Allgemeinen benötigen neue Anwender Praxis, um die Einlassspritzen bei der manuellen Herstellung kleiner Nanopartikelchargen konsequent zu betreiben. Größere Mengen können mit computergesteuerten Spritzenpumpen produziert werden. Unser Protokoll enthält auch Details zur Nachbearbeitung von Nanopartikellösungen, die für die erfolgreiche Anwendung einer Formulierung oft entscheidend sind.
Bevor Sie mit dem Prozess beginnen, überprüfen Sie die CIJ-Mischfittings, und stellen Sie sicher, dass der Auslassschlauch nicht gekräust ist. Dann füllen Sie zwei fünf Milliliter Polypropylen gummifreie Luer-Sperrspritzen mit zwei bis drei Milliliter Aceton oder einem anderen Reinigungslösungsmittel. Verriegeln Sie die Spritzen in die Einlassadapter, und stellen Sie die Montage über einen Abfallbehälter.
Drücken Sie die Kolben kontinuierlich, um das Lösungsmittel im Laufe weniger Sekunden durch die Mischkammer zu senden. Entfernen Sie dann die Spritzen und trocknen Sie das Gemisch mit einem Stickstoffgasstrom. Als nächstes, um mit der Vorbereitung des Lösungsmitteleingangsstroms zu beginnen, Pipette 0,25 Milliliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung von Vitamin E, in stabilisator freiem Tetrahydrofuran, in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Dann Pipette 0,25 Milliliter einer 10 Milligramm pro Milliliter Lösung eines Block Copolymer stabilisator in THF in das gleiche Rohr. Wirbeln Sie die Mischung für fünf bis 10 Sekunden, und zentrifugieren Sie es dann bei tausend G für fünf bis 10 Sekunden, um Flüssigkeit zu erholen, die an der Kappe haften. Bereiten Sie ein 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr mit 0,525 Milliliteren entionisiertem Wasser als Antilösungsmittel vor.
Dann Pipette vier Milliliter entionisiertes Wasser in eine 20 Milliliter Szintillationsdurchstechflasche, um das Löschbad zu machen. Legen Sie eine kleine Rührstange in die Durchstechflasche. Legen Sie den sauberen CIJ-Mixer über das Löschbad in ein Rack oder einen Reagenzglasblock auf eine Rührplatte.
Beginnen Sie, das Löschbad mit ca. 75% der maximal möglichen Geschwindigkeit zu rühren. Dann eine stumpf gekippte Nadel auf eine ein Milliliter Polypropylen-Gummi-freie Spritze montieren und das Anti-Lösungsmittel aufstellen. Luftblasen vorsichtig aus der Spritze entfernen und die Nadel entfernen und entsorgen.
Stellen Sie den Kolben so ein, dass die Flüssigkeit direkt am Ende der Spritze ankommt. Befestigen Sie die Spritze dann an einem der CIJ-Einlässe. Ziehen Sie das Lösungsmittelgemisch auf die gleiche Weise in eine zweite Spritze und befestigen Sie es am anderen Einlass.
Um die Nanopartikel zu bilden, drücken Sie gleichzeitig beide Kolben mit einer gleichmäßigen Bewegung in weniger als 0,5 Sekunden. Es ist wichtig, die Spritzen schnell, gleichmäßig und reibungslos zu drücken. Sie sollten nicht plötzlich die Spritzen schlagen, sondern die Bewegung beginnen, die bereits in Kontakt mit den Spitzen der Spritzen ist.
Stellen Sie anschließend den CIJ-Mischer über den Abfallbehälter, ohne die Spritzen zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Ladevolumen nicht in die Dispersion abfließt. Entfernen Sie die Rührstange aus der Szintillationsdurchstechflasche und verriegeln Sie sie. Entfernen und entsorgen Sie dann die Lösungsmittel- und Antilösungsmittelspritzen.
Reinigen Sie den Mixer vor der nächsten Flash-Nanopräzipitation. Zur Vorbereitung einer Probe für die dynamische Lichtstreuungsanalyse, Pipette 100 Mikroliter der Dispersion in eine Küvette. Fügen Sie 900 Mikroliter Löschbad Lösungsmittel, und mischen Sie gut durch Pipettieren, bevor Sie die Probenanalyse beginnen.
Um mit der Montage des Micro MIVM zu beginnen, legen Sie den O-Ring in die Mischgeometriescheibe. Richten Sie die Löcher in der Mischscheibe mit den Stiften auf der oberen Scheibe aus und passen Sie sie zusammen, wobei Sie darauf achten, den O-Ring nicht zu verdrängen. Lösen Sie den Auslassschlauch im unteren Empfänger, und schrauben Sie dann die angeschlossenen Scheiben in den Empfänger.
Passen Sie einen Spannerschlüssel an die Stifte der oberen Scheibe an, und ziehen Sie die Baugruppe fest. Ziehen Sie den Auslassschlauch so fest, dass er fest an der Unterseite der Mischgeometriescheibe sitzt. Stellen Sie sicher, dass die Spritzenbeschläge auf der oberen Scheibe eng sind.
Heben Sie die mobile Platte auf dem Mischerständer an, um sie aus dem Weg zu halten, und legen Sie dann den montierten Mischer auf den Ständer, wobei der Auslassschlauch durch die Stützplatte gefädelt wird. Als nächstes legen Sie ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr mit 5,25 Milliliter Chloroform als Löschbad unter den Auslassschlauch. Dann ziehen Sie 0,75 Milliliter Lösung A, das ist eine Fünf Milligramm pro Milliliter Lösung von Ovalbumin in Dimethylsulfoxid in 10%Wasser Volumen, in eine ein Milliliter gasdichte Luer-Sperrspritze mit einer stumpf gekippten Nadel.
Heben Sie Luftblasen vorsichtig aus, entfernen Sie die Nadel und grundieren Sie die Lösung bis zum Ende der Luer-Armatur. Schließen Sie die Spritze an einen Mischereinlass an. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit jeweils 0,75 Millilitern der Lösung B, die sechs Milligramm pro Milliliter Blockcopolymerstabilisator in DMSO beträgt, und Lösung C, die THF ist.
Schließen Sie die Spritzen im Uhrzeigersinn in alphabetischer Reihenfolge an die Mischereinlässe an. Bereiten Sie eine 2,5 Milliliter gasdichte Spritze mit 1,85 Millilitern der Chloroform-Lösung D vor und schließen Sie sie an den vierten Einlass an. Bestätigen Sie, dass es keinen signifikanten Unterschied in den Spritzenhöhen gibt.
Greifen Sie dann vorsichtig das Lagergehäuse auf jeder Seite der mobilen Platte und senken Sie die Platte langsam, bis sie nur noch gleichmäßig auf den Spritzen ruht. Um die Nanopartikel zu erzeugen, wird die Platte in etwa 0,5 bis einer Sekunde kontinuierlich und sanft depressiv. Dann entfernen und kappen Sie das Löschbadrohr.
Zerlegen und reinigen Sie den Mischer, wenn Sie fertig sind. Um mit größeren Volumina zu arbeiten, laden Sie die Lösungen in gasdichte Spritzen und verbinden Sie Polytetrafluorethylen-Schläuche mit Luer-Armaturen mit den Spritzen. Primieren Sie die Lösungen bis zu den Enden des Schlauches.
Klemmen Sie die Spritzen in Spritzenpumpen und befestigen Sie die Schläuche an den entsprechenden Mischereinlässe. Legen Sie eine kleine Abfallflasche unter den Auslassschlauch, um das Startvolumen zu sammeln. Bereiten Sie das Löschbad vor und halten Sie es in der Nähe.
Gleichzeitig starten Sie die Pumpen und lassen etwa fünf Milliliter Abwasser in die Abfallflasche fließen. Beginnen Sie dann wie gewohnt mit dem Sammeln der Nanopartikel im Löschbad. Eine Rührplatte kann verwendet werden, um das Löschbad auf Wunsch zu mischen.
Vier Replikationen von FNP von polymeren Nanopartikeln mit einem hydrophoben Kern, die im CIJ-Mischer hergestellt wurden, zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit und waren mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 107 Nanometern relativ monodisperse. Ein repräsentatives Fehlfeuer durch langsame oder ungleichmäßige Spritzendepression, die etwas größere Partikel produzierte, während die Polydispersität in diesem Beispiel nicht beeinträchtigt wurde, können Fehlzündungen zu mehr polydispersen Verteilungen führen. Die DLS-Autokorrelationsfunktion zerfiel reibungslos für eine repräsentative polymere Nanopartikelprobe.
Dieser glatte Zerfall wurde nicht beobachtet, wenn die Formulierung ohne den Block-Copolymer-Stabilisator versucht wurde, der stattdessen Öltröpfchen im Mikron-Maßstab produzierte. Die relative Menge an Kernmaterial zum Stabilisator kontrollierte die Partikelgröße, wie hier gezeigt, in Nanopartikeln mit einem Polystyrolkern. Die PDI lag in jeder Formulierung unter 0,15.
Nanopartikel mit hydrophilen Kernen, die von IFNP hergestellt wurden. Partikel mit einem Maltodextrinkern, der im CIJ-Mischer hergestellt wurde, hatten einen Durchmesser von etwa 65 Nanometern und hatten einen PDI von 0,08. Partikel mit einem im Mikro-MIVM hergestellten Ovalbuminkern hatten einen Durchmesser von etwa 125 Nanometern und eine PDI von 0,16.
FNP und IFNP sind leistungsstarke Werkzeuge zur Verarbeitung von Molekülen und Nanopartikeln. Bevor Sie eine der beiden Techniken ausführen, achten Sie darauf, die Löslichkeiten jedes Bauteils in allen Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemische zu berücksichtigen, um eine hohe Supersättigung während des Mischens zu gewährleisten. Die grundlegende Technik ist einfach, aber die Beherrschung der SpritzenDepression Schritte erfordert einige Übung.
Wenn Sie Probleme damit haben, sollten Sie eine Spritzenpumpe wie die in diesem Video gezeigte verwenden, um die Konsistenz zu verbessern. Für geladene hydrophile Moleküle oder Moleküle mit Mittlerer Löslichkeit kann FNP mit hydrophober Ionenpaarung kombiniert werden, um eine effiziente Verkapselung zu ermöglichen. FNP kann auch verwendet werden, um mehrere Verbindungen im gleichen Nanopartikelkern zu verkapseln.
Lesen Sie den Text und andere Literaturressourcen, um zu erfahren, wie Sie organische Lösungsmittel am besten aus den Nanopartikeldispersionen in Ihrer gewünschten Anwendung entfernen können. Es gibt auch eine Reihe von Techniken zur Stabilisierung von Nanopartikeln während der Lagerung.
