La nanoprecipitazione flash, o tecniche FNP qui dimostrate offrono una piattaforma scalabile e diretta per incapsulare composti idrofobici o idrofili all'interno di nanoparticelle polimeriche. Per chiarezza, la tecnica utilizzata per incapsulare i biologici è chiamata nanoprecipitazione flash inversa, o IFNP. I principi sottostanti sono invariati, ma la struttura della nanoparticella risultante è diversa.
Generalmente, i nuovi utenti hanno bisogno di pratica per azionare in modo coerente le siringhe di ingresso quando fanno manualmente piccoli lotti di nanoparticelle. Volumi maggiori possono essere prodotti con pompe per siringhe controllate dal computer. Il nostro protocollo fornisce anche dettagli sulla post-elaborazione delle soluzioni di nanoparticelle, che è spesso fondamentale per un'applicazione riuscita di una formulazione.
Prima di iniziare il processo, controllare i raccordi del miscelatore CIJ e assicurarsi che il tubo di uscita non sia crimpato. Quindi, riempire due siringhe Luer senza gomma in polipropilene da cinque millilitri con due o tre millilitri di acetone o un altro solvente detergente. Bloccare le siringhe negli adattatori di ingresso e impostare l'assemblaggio su un contenitore di rifiuti.
Premere costantemente i pistoni per inviare il solvente attraverso la camera di miscelazione nel corso di pochi secondi. Quindi, rimuovere le siringhe e asciugare la miscela con un flusso di gas azoto. Successivamente, per iniziare a preparare il flusso di ingresso del solvente, pipettare 0,25 millilitri di una soluzione di vitamina E da 10 milligrammi per millilitro, in tetraidrofurano privo di stabilizzatori, in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.
Quindi, pipetta 0,25 millilitri di una soluzione di 10 milligrammi per millilitro di uno stabilizzatore di copolimero a blocchi in THF nello stesso tubo. Vortice la miscela per cinque-10 secondi, quindi centrifugarla a mille G per cinque-10 secondi per recuperare il liquido che aderisce al tappo. Preparare un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri contenente 0,525 millilitri di acqua deionizzata come anti solvente.
Quindi, pipettare quattro millilitri di acqua deionizzata in una fiala a scintillazione da 20 millilitri per fare il bagno di tempra. Posizionare una piccola barra di agitazione nel flaconcino. Posizionare il miscelatore CIJ pulito sopra il bagno di tempra in un rack o in un blocco di provetta su una piastra di agitazione.
Iniziare a mescolare il bagno di tempra a circa il 75% della velocità massima possibile. Quindi, montare un ago con punta smussata su una siringa senza gomma di polipropilene millilitro e redigere l'anti-solvente. Espellere con cura le bolle d'aria dalla siringa, quindi rimuovere e smaltire l'ago.
Regolare lo stantuffo in modo che il liquido venga appena alla fine della siringa. Quindi, attaccare la siringa a una delle entrate CIJ. Disegnare la miscela di solvente in una seconda siringa nello stesso modo e attaccarla all'altra insenatura.
Per formare le nanoparticelle, deprimere simultaneamente entrambi i pistoni con un movimento uniforme liscio in meno di 0,5 secondi. È fondamentale deprimere le siringhe rapidamente, uniformemente e senza intoppi. Non dovresti colpire improvvisamente le siringhe, ma dovresti iniziare il movimento già a contatto con la parte superiore delle siringhe.
Successivamente, impostare il miscelatore CIJ sul contenitore dei rifiuti, senza rimuovere le siringhe per garantire che il volume di attesa non si scarichi nella dispersione. Rimuovere la barra di agitazione dal flaconcino a scintillazione e capovoltarla. Quindi, rimuovere e scartare il solvente e le siringhe anti-solvente.
Pulire il mixer prima della successiva prova di nanoprecipitazione flash. Per preparare un campione per l'analisi dinamica dello scattering della luce, pipettare 100 microlitri della dispersione in una cuvetta. Aggiungere 900 microlitri di solvente da bagno di tempra e mescolare bene tubazione prima di iniziare l'analisi del campione.
Per iniziare a assemblare la micro MIVM, posizionare l'O-ring nel disco della geometria di miscelazione. Allineare i fori nel disco di miscelazione con i pioli sul disco superiore e adattarli insieme, facendo attenzione a non spostare l'O-ring. Allentare il raccordo del tubo di uscita nel ricevitore inferiore, quindi avvitare i dischi collegati nel ricevitore.
Adattare una chiave inglese ai pioli del disco superiore e stringere l'assieme. Stringere il raccordo del tubo di uscita in modo che si sieda saldamente contro la faccia inferiore del disco della geometria di miscelazione. Assicurarsi che i raccordi della siringa sul disco superiore siano aderenti.
Sollevare la piastra mobile sul supporto del miscelatore per tenerla fuori mano, quindi posizionare il miscelatore assemblato sul supporto, con il tubo di uscita filettato attraverso la piastra di supporto. Quindi, posizionare un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 5,25 millilitri di cloroformio come bagno di tempra sotto i tubi di uscita. Quindi, disegnare 0,75 millilitri della soluzione A, che è una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di ovoalbumina in solfossido di dimetile in 10% di acqua in volume, in una siringa di blocco Luer a tenuta di gas da un millilitro con un ago con punta smussata.
Espellere con cura le bolle d'aria, rimuovere l'ago e innescare la soluzione fino alla fine del raccordo Luer. Collegare la siringa a un'ingresso mixer. Ripetere questo processo con 0,75 millilitri ciascuno della soluzione B, che è di sei milligrammi per millilitro di stabilizzatore di copolimero a blocchi in DMSO, e la soluzione C, che è THF.
Collegare le siringhe alle entrate del miscelatore in senso orario, in ordine alfabetico. Preparare una siringa a tenuta di gas da 2,5 millilitri contenente 1,85 millilitri di soluzione D, che è cloroformio, e collegarla alla quarta insenatura. Verificare che non vi sia alcuna differenza significativa nell'altezza della siringa.
Quindi, afferrare attentamente l'alloggiamento del cuscinetto su ciascun lato della piastra mobile e abbassare lentamente la piastra fino a quando non è a malapena appoggiata uniformemente sopra le siringhe. Per generare le nanoparticelle, deprimere costantemente e senza intoppi la piastra in circa 0,5 a un secondo. Quindi, rimuovere e cappuccio il tubo del bagno di tempra.
Smontare e pulire il miscelatore al termine. Per lavorare con volumi maggiori, caricare le soluzioni in siringhe a tenuta di gas e collegare i tubi in politetrafluoroetilene con i raccordi Luer alle siringhe. Innescare le soluzioni fino alle estremità del tubo.
Fissare le siringhe in pompe per siringhe e fissare il tubo alle entrate del miscelatore appropriate. Posizionare una piccola fiala di scarto sotto i tubi di uscita per raccogliere il volume di avvio. Preparare il bagno di tempra e tenerlo nelle vicinanze.
Contemporaneamente, avviare le pompe e lasciare che circa cinque millilitri di effluenti fluiranno nel flaconcino di scarto. Quindi, inizia a raccogliere le nanoparticelle nel bagno di tempra come al solito. Una piastra di agitazione può essere utilizzata per mescolare il bagno di tempra, se lo si desidera.
Quattro repliche di FNP di nanoparticelle polimeriche con un nucleo idrofobico, preparate nel miscelatore CIJ, mostravano un'elevata replicabilità, ed erano relativamente monodisperse, con un diametro medio di 107 nanometri. Un errore rappresentativo a causa della depressione lenta o irregolare della siringa, ha prodotto particelle leggermente più grandi, mentre la polidispersità non è stata influenzata in questo esempio, gli errori possono causare più distribuzioni di polidispersi. La funzione di autocorrelazione DLS decadeva senza intoppi per un campione rappresentativo di nanoparticelle polimeriche.
Questo decadimento liscio non è stato osservato quando la formulazione è stata tentata senza lo stabilizzatore del copolimero a blocchi, che produceva invece goccioline di olio su scala micron. La quantità relativa di materiale del nucleo da stabilizzare controllava la dimensione delle particelle, come mostrato qui, in nanoparticelle con un nucleo di polistirolo. Il PDI era inferiore a 0,15 in ogni formulazione.
Nanoparticelle con nuclei idrofili dove prodotte dall'IFNP. Le particelle con un nucleo di maltodestrina, preparate nel miscelatore CIJ, avevano un diametro di circa 65 nanometri e avevano un PDI di 0,08. Le particelle con un nucleo di ovoalbumina preparato nella micro MIVM avevano un diametro di circa 125 nanometri e avevano un PDI di 0,16.
FNP e IFNP sono potenti strumenti per l'elaborazione delle molecole e delle nanoparticelle. Prima di eseguire entrambe le operazioni, assicurarsi di considerare le solubilità di ciascun componente in tutti i solventi, o miscele di solventi, per garantire un'elevata super saturazione durante la miscelazione. La tecnica di base è semplice, ma padroneggiare i passaggi di depressione della siringa richiede un po 'di pratica.
In caso di problemi, prendere in considerazione l'utilizzo di una configurazione della pompa per siringhe come quella mostrata in questo video per migliorare la coerenza. Per molecole idrofile cariche, o molecole con solubilità intermedia, fnp può essere combinato con l'accoppiamento ionico idrofobico per consentire un'incapsulamento efficiente. L'FNP può anche essere usato per incapsulare più composti nello stesso nucleo di nanoparticelle.
Consultare il testo e altre risorse della letteratura per imparare a rimuovere al meglio i solventi organici dalle dispersioni delle nanoparticelle nell'applicazione desiderata. Ci sono anche una serie di tecniche per stabilizzare le nanoparticelle durante lo stoccaggio.
