As técnicas de nanoprecipitação flash, ou FNP demonstradas aqui oferecem uma plataforma escalável e simples para encapsular compostos hidrofóbicos ou hidrofílicos dentro de nanopartículas poliméricas. Para clareza, a técnica usada para encapsular biológicos é chamada de nanoprecipitação flash inversa, ou IFNP. Os princípios subjacentes são inalterados, mas a estrutura das nanopartículas resultantes é diferente.
Geralmente, novos usuários precisam de prática para operar consistentemente as seringas de entrada ao fazer manualmente pequenos lotes de nanopartículas. Volumes maiores podem ser produzidos com bombas de seringa controladas por computador. Nosso protocolo também fornece detalhes sobre o pós-processamento de soluções de nanopartículas, o que muitas vezes é fundamental para a aplicação bem-sucedida de uma formulação.
Antes de iniciar o processo, verifique os encaixes do misturador CIJ e certifique-se de que a tubulação de saída não está amassada. Em seguida, encha duas seringas de borracha luer livres de polipropileno de cinco mililitros com dois a três mililitros de acetona, ou outro solvente de limpeza. Coloque as seringas nos adaptadores de entrada e coloque a montagem sobre um recipiente de resíduos.
Deprimi os êmbolos para enviar o solvente através da câmara de mistura ao longo de alguns segundos. Em seguida, remova as seringas e seque a mistura com um fluxo de gás nitrogênio. Em seguida, para começar a preparar o fluxo de entrada solvente, pipeta 0,25 mililitros de uma solução de 10 miligramas por mililitro de vitamina E, em tetrahidrofurano livre de estabilizador, em um tubo de microcentrífugo de 1,5 mililitro.
Em seguida, pipeta 0,25 mililitros de uma solução de 10 miligramas por mililitro de um estabilizador copolímero de bloco em THF no mesmo tubo. Vórtice a mistura por cinco a dez segundos, e depois centrífuga-a a mil G por cinco a dez segundos para recuperar a adesão líquida à tampa. Prepare um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro contendo 0,525 mililitros de água deionizada como anti-solvente.
Em seguida, pipeta quatro mililitros de água deionizada em um frasco de cintilação de 20 mililitros para fazer o banho de saciar. Coloque uma pequena barra de mexida no frasco. Coloque a batedeira CIJ limpa sobre o banho de saciar em um rack ou bloco de tubo de ensaio em uma placa de mexida.
Comece a mexer o banho de saciar em cerca de 75% da velocidade máxima possível. Em seguida, coloque uma agulha de ponta sem corte em uma seringa de borracha livre de polipropileno de um mililitro, e elabore o anti-solvente. Expulse cuidadosamente bolhas de ar da seringa e, em seguida, remova e descarte a agulha.
Ajuste o êmbolo para que o líquido chegue apenas ao fim da seringa. Em seguida, conecte a seringa a uma das entradas do CIJ. Desenhe a mistura de solvente em uma segunda seringa da mesma forma e anexe-a à outra entrada.
Para formar as nanopartículas, pressione simultaneamente ambos os êmbolos com um movimento uniforme suave em menos de 0,5 segundos. É fundamental deprimir as seringas rapidamente, uniformemente e suavemente. Você não deve de repente atacar as seringas, mas deve começar o movimento já em contato com os topos das seringas.
Em seguida, coloque a batedeira CIJ sobre o recipiente de resíduos, sem remover as seringas para garantir que o volume de ressarcação não escorra para a dispersão. Retire a barra de mexida do frasco de cintilação e tampe-a. Em seguida, remova e descarte as seringas solventes e anti-solventes.
Limpe a batedeira antes do próximo teste de nanoprecipitação. Para preparar uma amostra para análise dinâmica de dispersão de luz, pipeta 100 microliters da dispersão em uma cuvette. Adicione 900 microliters de solvente de banho de saciar e misture bem por pipetar antes de iniciar a análise da amostra.
Para começar a montar o micro MIVM, coloque o O-ring no disco de geometria de mistura. Alinhe os orifícios no disco de mistura com os pinos no disco superior e encaixe-os juntos, tomando cuidado para não deslocar o o-anel. Solte o encaixe da tubulação de saída no receptor inferior e, em seguida, enrosque os discos conectados no receptor.
Coloque uma chave inglesa nos pinos do disco superior e aperte o conjunto. Aperte o encaixe da tubulação de saída para que ele fique firmemente contra a face inferior do disco de geometria de mistura. Certifique-se de que os encaixes da seringa no disco superior estão aconchegantes.
Levante a placa móvel no suporte da batedeira para mantê-la fora do caminho, em seguida, coloque a batedeira montada no suporte, com a tubulação de saída roscada através da placa de suporte. Em seguida, coloque um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 5,25 mililitros de clorofórmio como o banho de saciamento sob a tubulação de saída. Em seguida, desenhe 0,75 mililitros de solução A, que é uma solução de cinco miligramas por mililitro de ovalbumina em sulfóxido de dimetil em 10% de água em volume, em um mililitro de gás apertado Luer travar seringa com uma agulha de ponta sem corte.
Expulse cuidadosamente bolhas de ar, remova a agulha e forja a solução até o final do encaixe Luer. Conecte a seringa a uma entrada de misturador. Repita este processo com 0,75 mililitros cada uma da solução B, que é de seis miligramas por mililitro de estabilizador copolímero de bloco em DMSO, e solução C, que é THF.
Conecte as seringas às entradas da batedeira no sentido horário, em ordem alfabética. Prepare uma seringa apertada de gás de 2,5 mililitros contendo 1,85 mililitros de solução D, que é clorofórmio, e conecte-a à quarta entrada. Confirme que não há diferença significativa nas alturas da seringa.
Em seguida, segure cuidadosamente a carcaça de rolamento em cada lado da placa móvel, e lentamente abaixe a placa até que ela mal esteja descansando uniformemente em cima das seringas. Para gerar as nanopartículas, deprimir a placa de forma constante e suave em cerca de 0,5 a um segundo. Em seguida, remova e tampe o tubo de banho.
Desmonte e limpe a batedeira quando estiver pronto. Para trabalhar com volumes maiores, carregue as soluções em seringas apertadas a gás e conecte tubos de politefluoroetileno com encaixes Luer às seringas. Prime as soluções para as extremidades da tubulação.
Fixar as seringas em bombas de seringa e fixar a tubulação às entradas de batedeiras apropriadas. Coloque um pequeno frasco de resíduos sob a tubulação de saída para coletar o volume da inicialização. Prepare o banho de saciar e mantenha-o por perto.
Simultaneamente, inicie as bombas e deixe que cerca de cinco mililitros de efluentes fluam para o frasco de resíduos. Então, comece a coletar as nanopartículas no banho de saciar, como de costume. Uma placa de mexida pode ser usada para misturar o banho de saciar, se desejar.
Quatro réplicas de FNP de nanopartículas poliméricas com núcleo hidrofóbico, preparadas na batedeira CIJ, apresentaram alta replicabilidade, e eram relativamente monodispersas, com um diâmetro médio de 107 nanômetros. Um erro representativo da depressão da seringa lenta ou desigual, produziu partículas ligeiramente maiores, enquanto a polidispersidade não foi afetada neste exemplo, erros de fogo podem resultar em distribuições mais polidisperses. A função de auto-correlação DLS decaiu suavemente para uma amostra representativa de nanopartículas poliméricas.
Essa decadência suave não foi observada quando a formulação foi tentada sem o estabilizador copolímero do bloco, que produziu gotículas de óleo em escala de míccro. A quantidade relativa de material central para estabilizador controlava o tamanho das partículas, como mostrado aqui, em nanopartículas com um núcleo de poliestireno. O PDI ficou abaixo de 0,15 em cada formulação.
Nanopartículas com núcleos hidrofílicos produzidos pela IFNP. Partículas com núcleo maltodextrina, preparadas na batedeira CIJ, tinham cerca de 65 nanômetros de diâmetro, e tinham um IDD de 0,08. As partículas com núcleo ovalbumin preparado no micro MIVM tinham cerca de 125 nanômetros de diâmetro, e tinham um IDB de 0,16.
FNP e IFNP são ferramentas poderosas para processar moléculas e nanopartículas. Antes de executar qualquer técnica, certifique-se de considerar as solubilidades de cada componente em todos os solventes, ou misturas de solventes, para garantir alta super saturação durante a mistura. A técnica básica é simples, mas dominar os passos da depressão da seringa requer alguma prática.
Se você tiver problemas com isso, considere usar uma configuração de bomba de seringa como a mostrada neste vídeo para melhorar a consistência. Para moléculas hidrofílicas carregadas, ou moléculas com solubilidade intermediária, fNP pode ser combinado com emparelhamento de íons hidrofóbicos para permitir um encapsulamento eficiente. FNP também pode ser usado para encapsular múltiplos compostos no mesmo núcleo de nanopartículas.
Consulte o texto e outros recursos da literatura para saber como remover melhor solventes orgânicos das dispersões de nanopartículas na aplicação desejada. Há também uma gama de técnicas para estabilizar nanopartículas durante o armazenamento.
