Enteroide sind dreidimensionale Organoide, die aus Darmepithelzellen abgeleitet werden. Sie sind ideal für die Untersuchung komplexer physiologischer Wechselwirkungen, Zellsignalisierung und Wirtspathogenabwehr. Unser Protokoll beschreibt, wie man menschliche Enteroide kultiviert, nachdem man Darmstammzellen von Patienten isoliert hat, die sich einer Darmresektion unterziehen.
Die gleichzeitige Anwendung von Lipopolysaccharid in unseren Kulturmedien verursacht eine entzündliche Reaktion in den Enteroiden, die zu histologischen, genetischen und Proteinexpressionsänderungen führt, ähnlich denen, die bei humanen nekrotisierenden Enterokolitis beobachtet werden. Angesichts der Tatsache, dass die Untersuchung der nekrotisierenden Enterokolitis und potenzieller therapeutischer Wirkstoffe bei menschlichen Probanden, insbesondere Kindern, ethisch anspruchsvoll ist, ist es sehr wünschenswert, dieses neuartige, biologisch relevante enteroide Modell der nekrotisierenden Enterokolitis mit menschlichem neonatalem Gewebe zu nutzen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass Enteroide in der Lage sind, die verschiedenen Zelltypen des menschlichen Darmepithels zu rekapitulieren und die erkannten Einschränkungen von Tiermodellen und zellbasierten Systemen zu überwinden.
Christie Buonpane, eine chirurgisch lebende Bewohnerin, und Carrie Yuan, eine Labortechnikerin aus unserem Labor, helfen bei der Demonstration des Verfahrens. Zum Zeitpunkt der Sammlung in der operativen Suite, legen Sie die menschliche kleine Darmgewebeprobe in kalten DPBS. Waschen Sie die Probe in der kalten DPBS, bis es frei von Blut und Stuhl ist.
Bewahren Sie die Probe in RPMI 1640 medium bei vier Grad Celsius auf, bis sie für die Kryptaisolierung bereit ist. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, überprüfen Sie erneut, ob die Probe frei von Stuhl und Blut ist. Mit zarten Sezieren Schere entfernen überschüssiges Fett oder chirurgische Clips und Heftklammern.
Gewichten Sie die Probe und zielen Sie auf ein Stück, das etwa 0,75 bis 2,5 Gramm beträgt. Als nächstes schneiden Sie das Gewebe in 0,5 Zentimeter Stücke und legen Sie es in ein Rohr mit 30 Milliliter Chelatpuffer Nummer eins. Bei niedriger Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius schütteln.
Filtern Sie dann das Gewebe durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb und entsorgen Sie den Durchfluss. Fügen Sie das gefilterte Gewebe in ein Rohr mit 30 MilliliterChelium-Puffer Nummer zwei. Bei niedriger Geschwindigkeit 15 Minuten bei vier Grad Celsius schütteln.
Filtern Sie das Gewebe durch einen 100-Mikrometer-Filter und entsorgen Sie den Durchfluss. Danach 500 Mikroliter Kellermembranmatrix auf Eis für die spätere Verwendung auftauen. Fügen Sie etwas Gewebe zu 10 Milliliter kaltem DMEM in einem 50 Milliliter konischen Rohr hinzu und schütteln Sie 10 Sekunden lang kräftig von Hand.
Filtern Sie diese Suspension durch ein 100 Mikrometer Zellsieb und sammeln Sie den Durchfluss durch. Halten Sie diese Röhre auf Eis. Fügen Sie etwas Gewebe zu weiteren 10 Milliliter kaltem DMEM in einem separaten 50 Milliliter konischen Rohr hinzu und schütteln Sie kräftig von Hand für 10 Sekunden.
Filtern Sie diese Suspension durch ein 100 Mikrometer Zellsieb und sammeln Sie den Durchfluss durch. Wiederholen Sie den Vorgang zwei weitere Male, bis vier konische Rohre durch fließend eins bis vier enthalten. Filtern Sie dann die Lösung in Rohr Nummer eins durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb und übertragen Sie den Durchfluss in ein 15 Milliliter konisches Rohr, das auch mit der Nummer eins gekennzeichnet ist.
Wiederholen Sie diesen Vorgang für Rohre zwei bis vier. Zentrifugieren Sie die 15 Milliliter-Rohre bei 200-fachen G und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Entfernen Sie in der laminaren Strömungshaube den Überstand aus jedem Rohr und entsorgen Sie ihn.
Vermeiden Sie es, die Gewebewolke direkt über dem Pellet zu stören, auch wenn das bedeutet, einen Überstand zurückzulassen. In jedem Rohr, Pipette nach oben und unten langsam, um das Pellet mit dem übrig gebliebenen Überstand zu mischen. Übertragen Sie das Gemisch aus jedem Rohr in ein einzelnes zwei Milliliter konisches Rohr und Zentrifuge bei 200 mal G und bei vier Grad Celsius für 20 Minuten.
Danach entfernen Sie den Überstand und setzen Sie das Pellet in 500 Mikrolitervorhergetadien aus. Verwenden Sie eine gekühlte Pipettenspitze, um 50 Mikroliter dieser Suspension in der Mitte eines Brunnens in einer 24-Well-Platte aufzutragen. Diese Probe sollte kuppelförmig erscheinen.
Wiederholen Sie diesen Bewerbungsprozess neunmal, um 10 Gesamtbohrungen zu füllen. Übertragen Sie die 24 Well-Platte 30 Minuten lang in einen 5%Kohlendioxid-Inkubator bei 37 Grad Celsius, um eine Polymerisation zu ermöglichen. Dann fügen Sie 500 Mikroliter menschlicher Minigut-Medien zu jedem Brunnen hinzu.
Setzen Sie die Inkubation unter den gleichen Bedingungen fort, und stellen Sie sicher, dass diese Medien alle zwei Tage ersetzt werden. Fügen Sie zunächst 10 Mikroliter LPS bei einer Konzentration von fünf Milligramm pro Milliliter zu den 500 Mikrolitern menschlicher Minigut-Medien hinzu, die in jedem Brunnen der Platte am Tag Null vollständig sind. Bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid weiter inkubieren und die ergänzten Medien alle zwei Tage bis zur Abholung ersetzen.
Um sich auf die Paraffineinbettung vorzubereiten, entfernen Sie zunächst vorsichtig die Medien, fügen Sie einen Milliliter PBS hinzu und pipette naufen Sie vorsichtig nach oben und unten, um die Kellermembranmatrix aufzulösen, während Sie darauf achten, die Enteroide nicht zu lysieren. Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von weniger als 300 mal G für fünf Minuten zu Pellet und dann entfernen Sie die PBS. 4% Paraformaldehyd hinzufügen und das Rohr für eine Stunde beiseite stellen, um es bei Raumtemperatur zu fixieren.
Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von weniger als 300 mal G für fünf Minuten zu Pellet und dann entfernen Sie das Paraformaldehyd. Mit einem Milliliter PBS und Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von weniger als 300 mal G fünf Minuten lang vorsichtig waschen. Entfernen Sie dann die PBS.
Wiederholen Sie diesen Waschvorgang mit PBS einmal. Legen Sie die gewünschte Menge des Gewebeverarbeitungsgels in ein konisches Rohr und erwärmen Sie es in einem trockenen Bad-Inkubator bei 65 Grad Celsius für drei bis zehn Minuten, bis es flüssig ist. Danach das geschmolzene Gewebeverarbeitungsgel in das Pellet geben und sanft mischen.
Legen Sie einen kleinen Klonring in einen Deckel. Pipette das Gewebe verarbeitungsgel und enteroid Mischung in den Klonring, der auf einem Deckelmontiert montiert ist. Lassen Sie das Gewebeverarbeitungsgel und die Enteroidmischung bei vier Grad Celsius für eine Stunde erstarren.
Dann tauchen Sie den Klonring mit der erstarrten Mischung in 70% Ethanol, um sich auf die Paraffineinbettung vorzubereiten. Unmittelbar nach der Beschichtung erscheinen die frisch isolierenden Darmkrypen als längliche Stäbe. Innerhalb weniger Stunden nehmen die Enteroide ein rundes Aussehen an.
In den nächsten Tagen werden die Enteroide beginnen, Kugeln zu bilden. Budding sollte zwischen fünf und 10 Tagen auftreten, das ist, wenn Enteroid-Sammlung auftreten sollte. Die wachsenden Enteroide weisen auch Polarität auf, die ein zentralisiertes Lumen, eine apikale Grenze und eine basilaterale Domäne enthält.
Enteroide zeigen auch strukturelle Integrität, die durch ein robustes Aktin-Zytoskelett dargestellt wird. Nach mehreren Tagen in der Kultur, die LBS behandelt Enteroide erleben mehr Apoptose und haben eine geringere Ausbeute als die Kontrollgruppe. Wie in menschlichen NEC in murinen Modellen von NEC gesehen, eine erhöhte Expression von Maut wie Rezeptor vier ist in LPS behandelt Enteroide im Vergleich zu Kontrollen gefunden.
Die Enteroide können auch für die RNA- und Proteinextraktion mit etablierten qRT-PCR- und Western-Blotting-Techniken gesammelt werden.
