Dieses Modell wird es den Forschern in den kritischen präklinischen Stadien ermöglichen, die antimikrobielle Wirksamkeit neuartiger Formulierungen genauer zu bestimmen, und gibt den Forschern eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln. Dieses Modell ermöglicht schnell reproduzierbare Ergebnisse in einer repräsentativen Wundumgebung. Es reduziert den Bedarf an speziell gezüchteten Tieren und erleichtert die schnellere Translation von topischen antimikrobiellen Mitteln für Wundinfektionen in die Klinik.
Die größten Herausforderungen sind Verunreinigung und Geschicklichkeit. Eine strenge aseptische Technik und Geduld bei der Gewebeaufbereitung sind unerlässlich; für den Erfolg dieser Methode ist eine präzise und zielgerichtete Lappenentfernung erforderlich. Beginnen Sie mit der Desinfektion der Pinzetten, indem Sie sie eine Stunde lang einer trockenen Hitzesterilisation bei 200 Grad Celsius aussetzen.
Autoklavieren Sie alle Glaswaren vor Gebrauch 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius. Desinfizieren Sie den Stirnteil der Lampe, indem Sie ca. 100 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung auf die Probenfläche gießen. Rasieren Sie den Stirnteil mit elektrischen Haarschneidern, gefolgt von einer Wäsche mit 200 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung.
Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und einer blauen Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich mit einer Haarentfernungscreme. Nach 35 Minuten die Haarentfernungscreme mit einem Schabenwerkzeug vorsichtig abkratzen und den Probenbereich beurteilen. Wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang, wenn eine signifikante Menge an Haaren übrig bleibt.
Spülen Sie den sauberen Probenbereich mit 200 Milliliter Chlordioxidlösung, gefolgt von Ethanol und einer blauen Rolle. Verwenden Sie einen sterilen Acht-Millimeter-Biopsiestempel, um eine acht Millimeter große Hautprobe aus dem vorbereiteten Bereich herauszuschneiden. Entfernen Sie dann die Probe mit einer sterilen Pinzette und dem Klingenskalpell Nr. 15, um sicherzustellen, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.
Legen Sie die Proben in ein steriles 0,5-Liter-Glas, das mit sterilem PBS gefüllt ist. Dann werden sie in sterile 50-Milliliter-Röhrchen überführt, die mit 50 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung gefüllt sind. Drehen Sie das Röhrchen zweimal um und lassen Sie es 30 Minuten sterilisieren.
Die Proben werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das mit 40 Milliliter sterilem PBS gefüllt ist. Nach dem PBS-Waschen legen Sie jede Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 350 Mikroliter des vorgewärmten Mediums in eine Vertiefung hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten wird.
Versiegeln Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattendichtung, bevor Sie die Platte zur Inkubation in einen befeuchteten Gewebeinkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 24 Stunden legen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 Mikrolitern sterilem PBS aus. Entfernen Sie die restlichen Antibiotika aus der Probe, indem Sie sie 24 Stunden lang mit antibiotikafreien Medien bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius behandeln.
Wenn sich Trübung oder Pilzinfektion im antibiotikafreien Medium entwickelt, verwerfen Sie die Probe. Als nächstes bereiten Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter steriler Tryptose-Sojabrühe vor. Dann mehrere Staphylococcus aureus-Kolonien von einer frischen Agarplatte S.aureus in die Brühe geben und das Röhrchen bei 37 Grad Celsius und 150 U/min für 18 Stunden inkubieren.
Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen bei 4.000 G für drei Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 10 Milliliter sterilem PBS resuspendieren. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal, bevor Sie das Inokulum mit sterilem PBS auf 0,6 optische Dichte bei 600 Nanometerwellenlängen einstellen. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung durch eine manuelle realisierbare Keimzahl.
Um die Hautprobe zu infizieren, bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24 Well-Einsätze mit sterilen Pinzetten hinzu. Entfernen Sie die Medien von den Hautproben. Waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche.
Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Probe vorsichtig am Boden der Vertiefung zu halten. Verwenden Sie eine Vier-Millimeter-Stanzbiopsie, um die Hautprobe bis zu einer rauen Tiefe von ein bis zwei Millimetern zu durchdringen und einen zentralen Wundlappen zu machen. Verwenden Sie dann ein Klingenskalpell Nummer 15 und steril gezahnte Allis-Gewebezangen, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen.
Sobald alle Proben verwundet sind, werden sie mit einer sterilen Pinzette in die 24 Brunneneinsätze überführt. Pipettieren Sie 15 Mikroliter des bakteriellen Inokulums in das Wundbett, bevor sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Gewebeinkubator inkubiert werden. Für längere Inkubationszeiten entfernen Sie das Medium, ersetzen Sie es alle 24 Stunden durch frisches Medium und inkubieren Sie die Platten unter den gleichen Bedingungen.
Um die Bakterienbelastung zu bestimmen, entfernen Sie das Medium vom Boden der Vertiefungen. Und mit sterilen Pinzetten wird jede Probe in ein separates 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das mit einem Milliliter sterilem PBS gefüllt ist. Lösen Sie dann die Bakterien von der Oberfläche des Wundbettes, indem Sie die Probenoberfläche mit einem feinspitzen Homogenisator homogenisieren.
Stellen Sie sicher, dass das Wundbett in direktem Kontakt mit der Spitze des Homogenisators steht. Sobald alle Proben verarbeitet sind, wird jede Probe durchgewirbelt, bevor 20 Mikroliter Homogenat in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 180 Mikrolitern sterilem PBS überführt werden. Jedes Probenhomogenat wird nacheinander auf 1 mal 10 bis negativ 7 verdünnt und 10 Mikroliter des verdünnten Homogenats auf eine Tryptose-Soja-Agar-Platte in dreifacher Ausfertigung pipettiert.
Inkubieren Sie die Tryptose-Soja-Agar-Platte bei 37 Grad Celsius und zählen Sie nach 18 Stunden die Anzahl der Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten oder KBE für jede Probe zu bestimmen. Ein geeignetes Hautsterilisationsregime wurde mit verschiedenen Behandlungen für unterschiedliche Zeiträume identifiziert. Die Gewebeintegrität wurde histologisch überwacht, gefolgt von einer Färbung mit Hämatoxylin und Eosin unmittelbar nach der Behandlung.
Eine 30-minütige Behandlung mit Chlordioxid war die effektivste Behandlung, bei der das Hautgewebe reproduzierbar sterilisiert und gleichzeitig die Integrität des Gewebes erhalten bleibt. Ein weißer Film im Wundbett war 48 Stunden nach der Infektion auf dem Gewebe zu sehen. Obwohl das Kratzermodell nach 24 Stunden eine höhere durchschnittliche Anzahl von CFUs aufwies, führte die Klappenentfernungsverwundungstechnik zu konsistenteren Ergebnissen.
Nach 48 Stunden wurden im Vergleich zum Inokulum etwa 100-mal mehr bakterielle KBE aus dem verwundeten Gewebe gewonnen, was auf eine erfolgreiche Infektion hindeutet. Gram-gefärbte histologische Schnitte des infizierten Gewebes zeigten das Vorhandensein von S.aureus-Zellen im Wundbett an, die in den Abschnitten des nicht infizierten Gewebes fehlten. Nach diesem Verfahren kann man Immunhistochemie durchführen, um die Gewebereaktion zu untersuchen, modifizierte Grammfärbung, um die bakterielle Lokalisation zu visualisieren, und lebensfähige Plattenzahlen nach antimikrobieller Exposition, um die antimikrobielle Wirksamkeit zu testen.
Für die Forscher, die neuartige antimikrobielle Mittel entwickeln, wird dieses Modell eine bessere Kontrolle der Bleioptimierung ermöglichen, die Abhängigkeit von teuren und streng regulierten Tierversuchen verringern und die schnelle Übertragung antimikrobieller Mittel in die Klinik ermöglichen.
