Die verschachtelte RT-PCR wurde entwickelt, um alle Lyssaviren zu erkennen, einschließlich aller 16 ICTV-zugelassenen und zwei neuartigen Lyssavirus-Arten. Die Validierung dieser Methode wurde durch die Verwendung von über 9000 Tierhirnproben in 10 Jahren klinischer Tollwutdiagnose und -überwachung in China nachgewiesen. Die verschachtelte RT-PCR kann nicht nur glaubwürdige Ergebnisse bei frischen Hirngewebeproben, sondern auch bei degradierten Proben liefern.
Die Überflutung dieser Methode kann verwendet werden, um biologische Flüssigkeitsproben wie Zerebrospinalflüssigkeit, Speichel und Urin zu assayen, wodurch diese Methode in Ultimatum-Diagnosen angewendet werden kann. Um PCR-Übertragung Kontamination zu minimieren, ist es wichtig, negative und positive Kontrollen vorzubereiten Es ist wirklich wichtig, Schritte zu ergreifen. Beispielsweise sollten für jede RNA-ExtraktionVorbereitung, PCR-Einrichtung und Gelelektrophorese in physikalisch getrennten Bereichen betrieben werden.
Es wird auch empfohlen, Spiralbänder in der RNA-Extraktion und Reverse-Transkription zu verwenden, um eine Tollwutkontamination der Peptidkette zu verhindern. Die richtige Handhabung wie die Vorbereitung Ihrer Agenten auf Eis, das regelmäßige Wechseln der Handschuhe und die Verwendung von ribonuzleasefreien Materialien verhindern die Einführung von Ribonuklease und eliminiert den Abbau der RNA. Um dieses Verfahren zu beginnen, extrahieren Sie die RNA aus Tollwut vermutetgewebe, Hautbiopsien, Speichel, Zerebrospinalflüssigkeit oder RABV infizierte Zellkultur, wie im Textprotokoll beschrieben.
Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, entfernen Sie die benötigten Reagenzien aus dem Gefrierschrank und halten Sie sie auf Eis. Achten Sie darauf, jedes Reagenz vor der Anwendung aufzutauen und zu wirbeln. Für die umgekehrte Transkription der viralen RNA zu cDNA bereiten 12 Mikroliter Reaktionsmischung für jede Probe auf Eis und eine 1,5 Milliliter Zentrifugenröhrchen, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls in einem Reinraum beschrieben.
Um Pipettierschwankungen Rechnung zu tragen, bereiten Sie ein Volumen der Mastermischung mindestens eine Reaktionsgröße vor, die größer als erforderlich ist, und teilen Sie dann den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren auf. Fügen Sie in einer PCR-Workstation in einem Vorlagenraum acht Mikroliter der Probe oder eines der Steuerelemente zum Reaktionsmix hinzu. Die positive Kontrolle ist RNA, die aus der Zellkultur extrahiert wird, die mit dem festen RABV-Stamm CVS11 infiziert ist, während die Negative Kontrolle Rnase-freies doppeldestilliertes Wasser enthält.
Mischen Sie den Inhalt der einzelnen Rohre durch erste Wirbel und dann durch kurzzentrifugieren. Danach die Reaktionsrohre in einen Thermocycler laden. Richten Sie das cDNA-Syntheseprogramm wie im Textprotokoll beschrieben ein und führen Sie es aus.
Holen Sie zunächst die notwendigen Reagenzien ab und halten Sie sie in einem Reinraum auf Eis, bis sie einsatzbereit sind. Wenn sie fertig sind, tauen und wirbeln Sie die Reagenzien aus. Als nächstes bereiten Sie 48 Mikroliter der ersten Runde PCR-Mischung für jede Probe in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, wie in Tabelle 2 des Textprotokolls beschrieben und teilen Sie den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren.
Fügen Sie in einer PCR-Workstation in einem Vorlagenraum eine Zwei-Mikroliter-Probe der cDNA in den ersten PCR-Mix ein. Fügen Sie zwei Mikroliter CVS11 cDNA als Positivkontrolle und zwei Mikroliter doppelt destilliertes Wasser als Negativkontrolle ein. Übertragen Sie dann die versiegelten Rohre in einen PCR-Thermocycler und fahren Sie mit den in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parametern.
Zunächst 48 Mikroliter der zweiten Runde PCR-Mischung für jede Probe in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr, wie in Tabelle 4 des Textprotokolls beschrieben vorbereitet und teilen Sie den Reaktionsmix in 0,2 Milliliter PCR-Röhren auf. Fügen Sie zwei Mikroliter des ersten Runden-PCR-Produkts in den zweiten PCR-Mix ein. Doppeldestilliertes Wasser als Negativkontrolle für diese PCR-Runde einbeziehen.
Führen Sie dann PCR-Thermocycling mit den in Tabelle 3 des Textprotokolls aufgeführten Parametern durch. Zuerst 1,5 Gramm Agarose zu 100 Milliliter Nissacetat EDTA hinzufügen und in einer Mikrowelle erhitzen, um es gründlich aufzulösen. Als nächstes fügen Sie Ethidiumbromid in einer Endkonzentration von 0,01%Gießen Sie das Gel in die Form und lassen Sie es bei Umgebungstemperatur für mindestens 30 Minuten erstarren.
Bereiten Sie die Ladeproben vor, indem Sie fünf Mikroliter jedes PCR-Produkts mit einem Mikroliter 6x Ladepuffer mischen. Die Proben und den geeigneten DNA-Marker separat in die Brunnen laden und das Gel ca. 30 bis 45 Minuten bei 120 Volt laufen lassen, bis die Färbelinie etwa 75 bis 80 % des Gels beträgt. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, schalten Sie die Stromversorgung aus und trennen Sie die Elektroden von der Stromquelle.
Dann entfernen Sie das Gel vorsichtig aus der Gelbox. Verwenden Sie ein UV-Gel-Dokumentationsgerät, um die DNA-Fragmente zu visualisieren und zu fotografieren. Charakterisieren Sie die verschachtelte Reverse-Transkriptions-PCR, wie im Textprotokoll beschrieben.
Die Ergebnisse einer repräsentativen verschachtelten RT-PCR zum Nachweis von 18 Lyssavirus-Arten werden hier gezeigt. Die PCR-Positivsteuerungen zeigen das erwartete Band bei 845 Basenpaaren in der ersten Runde und bei 371 Basenpaaren für die zweite. Für die Negativkontrollen wird kein Band gesehen.
Alle 18 Lyssaviren produzieren die gleichen zwei Bänder wie die Positivkontrolle, was darauf hindeutet, dass die verschachtelte RT-PCR alle 18 Lyssaviren nachgewiesen hat. Während 16 der Plasmide eine effiziente Amplifikation in zwei Runden PCR haben, werden zwei von ihnen, das Aravan-Virus und das Ikoma-Virus, nur in der ersten bzw. zweiten Runde verstärkt. Die Empfindlichkeit der Methode variiert beim Nachweis verschiedener Lyssavirus-Plasmide, von Werten von 2,24 bis 2, 240 Moleküle pro Mikroliter.
Diese Unterschiede lassen sich auf die Diskrepanzen zwischen den Primern und Vorlagen aufgrund der Viralsequenzvielfalt zurückführen. Ein Vergleich von 9, 624 Hirngeweben aus klinischen Proben, die mit verschachtelter PCR getestet werden, mit denen, die mit FAT getestet wurden, zeigt, dass verschachtelte RT-PCR als Empfindlichkeit von 100% und eine Spezifität von 99,97% Die Übereinstimmung zwischen den beiden Methoden ist 99,07%Zehn andere Tollwutlaboratorien wurden eingeladen, den Test durchzuführen, um die verschachtelte RT-PCR weiter zu validieren. Alle zehn Laboratorien erhielten verschachtelte RT-PCR-Ergebnisse, die 100% in Übereinstimmung mit der FAT sind, ohne falsche Negative oder falsche Positivwerte, was darauf hindeutet, dass die verschachtelte RT-PCR eine hohe Spezifität und Reproduzierbarkeit hat.
RT-PCR wird jetzt von OIE für den Einsatz von Tollwuttechnologien empfohlen. Und unsere verschachtelte RT-PCR hat sich 2018 in China als nationaler Standard für Tollwuttechnologien bewährt.
