Name: semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein
Uploaded: 2018-06-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil durch das Projekt zur Entwicklung der Innovationsforschung auf Cancer Therapeutics (P-direkt) (15cm0106102h0002, k.m.) und das Projekt für Krebsforschung und therapeutische Evolution (P-erstellen) (16 cm 01061150001, k.m.) aus Japan Agency unterstützt für medizinische Forschung und Entwicklung, AMED; die Takeda Science Foundation (Y.M); Gewährung von Prinzessin Takamatsu Cancer Research Fund (13-24520, Y.M); und JSPS KAKENHI Grant-Nummer JP16K07133 (Y.M).

(1) Reagenz Setup
<ol><li>
Reagenzien für die Zelle Synchronisierung
	<ol>
<li>Um 2,5 mM Thymidin-haltigem Dulbeccos modifizierten Eagle Medium (DMEM) zu generieren, lösen sich 30,28 mg pro 1 mL Gewebekultur Grade Wasser zuzubereiten 125 mM Thymidin Thymidin. Filtern Sie die Lösung mit einer 0,22 μm Spritze Filtereinheit. Fügen Sie 1 mL frisch zubereitete 125 mM Thymidin pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) fetalen bovine Serum (FBS) ergänzt.</li>
		<li>Um DMEM mit 0,1 μg/mL Nocodazole zu generieren, lösen sich Nocodazole in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), 5 μg/μL Nocodazole vorzubereiten. Fügen Sie 1 µL 5 µg / µL Nocodazole pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS ergänzt.</li>
		<li>Zum Generieren von DMEM mit 0,002 % (Vol/Vol) von DMSO fügen Sie 1 µL von DMSO pro 50 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS ergänzt hinzu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Reagenzien für IP-Trichothecene-assay
	<ol>
<li>Bereiten Sie Lyse Puffer A: 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl (pH 7,4) und 0,5 % (Vol/Vol) Nonidet p-40 (NP-40). Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Bereiten Sie 5 x Acetat-Puffer: 50 mM 2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic Säure (HEPES)-KOH (pH 7,8), Kalium Acetat 500 mM und 20 mM MgCl2. Lagern Sie das Reagenz bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Bereiten Waschpuffer Puffer 1: 1 X Acetat, 10 % (Vol/Vol) Glycerin, 0,1 % (Vol/Vol) Triton X-100 und 0,06 X Proteaseinhibitor cocktail, Ethylenediamenetetraacetic Säure (EDTA)-frei. Waschpuffer 1 am Tag der Verwendung oder am Tag vor dem Gebrauch vorzubereiten. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Bereiten Sie AGC Lösung: 1 x Acetat-Puffer, 10 % (Vol/Vol) Glycerin und 0,02 % (wt/Vol)-3-[(3-Cholamidopropyl)-Dimethylammonio] -1-Propanesulfonat (CHAPS). Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Zum Generieren von AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2fügen Sie 100 µL 1 M CaCl2 pro 50 mL AGC-Lösung hinzu. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>AGC-Lösung mit 3 mM Ethylenglykol BIZ (b-Aminoethylether) zu generieren-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure (EGTA), 375 µL von 0,4 M EGTA (pH 7,5) pro 50 mL AGC-Lösung hinzufügen. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>Puffer 2: 1 X Acetat Waschpuffer und 0,02 % (wt/Vol) CHAPS vorbereiten. Das Reagenz bei 4 ° c Lagern</li>
		<li>HMD Lösung vorbereiten: 0,2 M HEPES-KOH (pH 7,8), 40 mM MgCl2 und 2 mM Dithiothreitol (DTT). Speichern Sie das Reagenz bei-20 ° C. Hinweis: HMD-Lösung sollte mindestens drei Monate erneuert werden.</li>
		<li>2 x Proteinase K-Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 20 mM EDTA und 1 % (wt/Vol) Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Speichern Sie das Reagenz bei-20 ° C.</li>
		<li>2 x Ladepuffer vorbereiten: 95 % (Vol/Vol) Formamid, 20 mM EDTA und 1 % (wt/Vol) Orange G. speichern das Reagenz bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung von HeLa-Zellen
Hinweis: Bereiten Sie HeLa-Zellen synchronisierte in mitotischen Phase (manipuliert) oder asynchron dividiert (unmanipuliertes). Kultur der Zellen in Anwesenheit von 5 % CO2 bei 37 ° C.
<ol><li>
Synchronisation von HeLa-Zellen in Mitose
	<ol>
<li>Platte 1 x 106 von HeLa-Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS in der Kulturschale 10 cm ergänzt.</li>
		<li>Ersetzen Sie zwei Tage nach der Beschichtung, das Medium mit 10 mL DMEM mit 2,5 mM Thymidin und 10 % (Vol/Vol) FBS. Kultur der Zellen für 24 h.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen dreimal mit 10 mL von Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (-) und die Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS für 6 h Kultur.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium mit 10 mL DMEM mit 0,1 µg/mL Nocodazole und 10 % (Vol/Vol) FBS und Kultur der Zellen für 14 h.</li>
		<li>Der Kulturschale leicht schütteln, und den überstand der freistehende mitotischen Zellen abrufen. Zählen Sie die Anzahl von Zellen für die IP-Trichothecene-Assay.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 490 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Die Zelle-Pellet kann bei-80 ° c aufbewahrt werden</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der unmanipuliertes HeLa-Zellen
	<ol>
<li>Platte 1 x 106 von HeLa-Zellen mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS in der Kulturschale 10 cm ergänzt.</li>
		<li>Ersetzen Sie zwei Tage nach der Beschichtung, das Medium mit 10 mL DMEM mit 10 % (Vol/Vol) FBS. Kulturzellen Sie für 30 h.</li>
		<li>Ersetzen Sie das Medium mit 10 mL DMEM mit 0,002 % (Vol/Vol) DMSO und 10 % (Vol/Vol) FBS und Kultur der Zellen für 14 h.</li>
		<li>Sammeln Sie die Zellen durch Trypsinization mit 0,7 mL Trypsin (2,5 g/L), 1 mM EDTA enthalten. Zählen Sie die Anzahl von Zellen für die IP-Trichothecene-Assay.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 490 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand. Hinweis: Die Zelle-Pellet kann bei-80 ° c aufbewahrt werden</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. IP-Trichothecene Assay
<ol><li>Protein A-Agarose Bead Vorbereitung
	<ol>
<li>Übertragen Sie 1 mL (Bett Volume 500 µL) Affinität Harz zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Bei 800 X g für 5 min bei 4 ° C zentrifugiert, und den überstand verwerfen.</li>
		<li>Die Perlen 800 µL Lysis Puffer A hinzu, und mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Bei 800 X g für 3 min bei 4 ° C zentrifugiert, und den überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).</li>
		<li>Die Perlen 800 µL Lysis Puffer A hinzu, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Drehen Sie das Röhrchen über Nacht (oder mindestens 4 Stunden) bei 4 ° C auf einem Dreh Shaker.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 800 X g für 3 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Die Perlen 500 µL Lysis Puffer A hinzu, und mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male. Speichern Sie die Perlen bei 4 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Zelle lysate
	<ol>
<li>(Optional) Wenn die Zellen in Schritt 2 eingefroren sind, platzieren Sie und tauen Sie die gefrorenen Zellen auf Eis, bis die Zellen verlieren werden.</li>
		<li>Waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL PBS (-). Zentrifugieren Sie die Probe auf 1.450 X g für 5 min bei 4 ° C, und verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Lösen Sie die Zellen mit eiskalten Lysis Puffer (1 mL Lyse Puffer A pro 1 x 107 Zellen) durch sanfte pipettieren.</li>
		<li>Beschallen Sie die Probe in einem 1,5 mL Röhrchen mit folgenden Bedingungen; Verstärkung der sonikator auf 25 % festgesetzt und beschallen für 10 s.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe auf 20.400 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Den überstand zu sammeln. Übertragen Sie 1 mL des Überstands in 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunopräzipitation
	<ol>
<li>Vorab klar lysate aus Schritt 3.2.6 durch Zugabe von 40 µL (Perle Volumen 20 µL) vorgewaschen Protein A-Agarose Perlen pro 1 mL der lysate. Mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre mehrere Male und drehen Sie die Probe für 30 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Zentrifugieren der Probe bei 13.000 X g für 1 min bei 4 ° C, und den überstand zu erholen.</li>
		<li>Hinzufügen von 40 µL (Bett Band 20 µL) vorgewaschen Protein A-Agarose Korne und 10 µg Anti-Human-TERT-Antikörper (Klon: 10E9-2)8 in die vorher gelöscht lysate. Mischen Sie gut durch Umkehrung des Schlauchs mehrmals und drehen Sie die Probe bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen mit Waschpuffer 1: die Perlen 1 mL Waschpuffer 1 hinzu, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre, und drehen Sie die Probe für 5 min bei 4 ° c Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt drei weitere Male.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen einmal mit AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2: 1 mL der AGC-Lösung mit 2 mM CaCl2 bis die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre und drehen die Probe für 5 min bei 4 ° C. Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Die Perlen mit Micrococcal Nuklease (MNase) zu behandeln: bereiten Sie das MNase Reaktionsgemisch in Tabelle 1beschrieben. Die Perlen in 60 µL des Reaktionsgemisches MNase durch sanfte pipettieren aufzuwirbeln. Schütteln Sie die Probe vorsichtig (20 bis 25 u/min) auf einer Drehscheibe von einem Boston-Shaker set in einem Peltier-Art Inkubator für 15 min bei 25 ° C. Hinweis: Es ist sehr wichtig, eine wellige Shaker und strikt zu befolgen das Tempolimit in diesem Schritt. Andere Art von Schüttele-Apparat, wie rotierende Mischer werden nicht empfohlen.</li>
		<li>Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen zweimal mit AGC-Lösung mit 3 mM EGTA: 1 mL der AGC-Lösung mit 3 mM EGTA, die Perlen hinzufügen, mischen Sie gut durch das Rohr invertieren und drehen die Probe für 5 min bei 4 ° C. Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
		<li>Waschen Sie die Perlen einmal mit Waschpuffer 2: Fügen Sie 1 mL Waschpuffer 2, Perlen, mischen Sie gut durch Umkehrung der Röhre, und drehen Sie die Probe für 5 min bei 4 ° c Probe bei 3.300 X g für 0,5 min bei 4 ° C zentrifugiert und den Überstand entfernen. Halten Sie die Perlen auf dem Eis während des Einrichtens Trichothecene Reaktion. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen.</li>
	</ol></li>
	<li>Trichothecene Reaktion
	<ol>
<li>Bereiten Sie ein Trichothecene Reaktionsgemisch in einen neuen Schlauch, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
		<li>Fügen Sie 6 µL [α -32P] UTP (3.000 Ci/Mmol), die Mischung und die Mischung gut durch pipettieren. Hinweis: ATP [α -32P], [α -32P] CTP oder [α -32P] GTP eignet sich für die Reaktion statt [α -32P] UTP.</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL RNA-Vorlage (1 µg/µL) in die Mischung und die Mischung gut durch pipettieren. Hinweis: Um die Trichothecene-Assay etablieren, die folgende RNA-Vorlage wird empfohlen: 5'-GGGAUCAUGUGGGUCCUAUUACAUUUUAAACCCA-3' 9.</li>
		<li>Die Perlen mit 20 µL des Reaktionsgemisches Trichothecene aus Schritt 3.4.3 durch pipettieren aufzuwirbeln.</li>
		<li>Schütteln Sie die Probe vorsichtig (20 bis 25 u/min) auf einer Drehscheibe von einem Boston-Shaker set in einem Inkubator peltier-Typ für 2 h bei 32 ° C.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch 5.4 µL Proteinase K (20 mg/mL) und 45,4 µL 2 X Proteinase K Puffer hinzufügen. Durch pipettieren mischen Sie und schütteln Sie (20 bis 25 u/min) der Probenmaterials auf einer Drehscheibe inmitten einer Peltier-Art Brutkasten für 30 min bei 37 ° C.</li>
		<li>Die Probe 109,2 µL RNase-freies Wasser hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL des sauren Phenol-Chloroform zur Probe. Mischen Sie gut durch Wirbel und Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 3 M Natriumacetat (pH = 5,2), 4 µL Niederschlag Träger und 250 µL Ethanol in der wässrigen Phase. Schütteln Sie den Schlauch gut zum Mischen, dann die Probe bei 21.100 X g für 20 min bei 4 ° c zentrifugiert Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 300 µL von kaltem 70 % (Vol/Vol) Ethanol bei-20 ° c gelagert Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und trocknen Sie das Pellet. Achtung: Führen Sie alle Verfahren unter RNase-freie Bedingungen. Hinweis: Das Pellet aus Schritt 3.4.11 kann bei-20 ° C für mindestens 2 Tage gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>RNase-Behandlung
	<ol>
<li>Das Pellet aus Schritt 3.4.11 in 20 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.</li>
		<li>Bereiten Sie eine RNase Reaktionsgemisch in einen neuen Schlauch, wie in Tabelle 3beschrieben.</li>
		<li>Das Beispiel 180 µL RNase Reaktionsmischung hinzu, und inkubieren das Rohr für 2 h bei 37 ° c</li>
		<li>2.3 µL 10 % (Vol/Vol) SDS zur Probe hinzufügen und 15 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Die Probe 2 µL Proteinase K (20 mg/mL) hinzu und 15 min bei 37 ° c inkubieren</li>
		<li>Die Stichprobe 205 µL Säure Phenol-Chloroform hinzufügen. Mischung gut durch Wirbel, anschließend Zentrifugieren die Probe bei 21.100 X g für 5 min bei Raumtemperatur. Übertragung der wässrigen Phase zu einem neuen Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 3 M Natriumacetat (pH 5,2), 4 µL Niederschlag Träger und 250 µL Ethanol in der wässrigen Phase. Schütteln Sie den Schlauch gut zum Mischen, dann die Probe bei 21.100 X g für 20 min bei 4 ° c zentrifugiert Verwerfen Sie den überstand.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 300 µL von kaltem 70 % (Vol/Vol) Ethanol bei-20 ° c gelagert Zentrifugieren Sie die Probe bei 21.100 X g für 15 min bei 4 ° C.</li>
		<li>Verwerfen Sie den überstand und trocknen Sie das Pellet. Hinweis: Das Pellet aus Schritt 3.5.9 kann bei-20 ° C für mindestens 2 Tage gespeichert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Gelelektrophorese und Autoradiographie
	<ol>
<li>Die Probe mit 20 µL RNase-freies Wasser aufschwemmen.</li>
		<li>Fügen Sie 20 µL 2 x Ladepuffer.</li>
		<li>Kochen der Probe für 10 min bei 95 ° C. Zerdrücken Sie die Probe auf dem Eis.</li>
		<li>Führen Sie das Gel. Für den Fall, dass die Vorlage Größe 34 Nts ist (siehe auch Punkt 3.4.3), ist 7 M Harnstoff - 10 % Polyacrylamid-Gel für die Denaturierung Gelelektrophorese verwendet.</li>
		<li>Trocknen Sie das Gel mit einem Gel Trockner.</li>
		<li>Aussetzen des Films getrocknet-Gel innerhalb einer Röntgen-Kassette mit einem verschärfende Bildschirm bei-80 ° C.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die IP-Trichothecene-Assay ist eine empfindliche Methode, Trichothecene Aktivität des menschlichen TERT zu erkennen. TERT Protein drückt sich hoch in mitotischen HeLa-Zellen, in denen TERT die Trichothecene komplexe8,9,10bildet. Dies deutet darauf hin, dass mitotische HeLa-Zellen ein optimales Material, Trichothecene Aktivität zu erkennen sind. In dem oben beschriebenen Protokoll sind mitotische und nicht synchronisierten HeLa-Zellen bzw. als ein positives und ein negatives Beispiel enthalten. Wie in Abbildung 1Adargestellt, Trichothecene-Assay-Produkte aus der empfohlenen RNA-Vorlage in mitotischen HeLa-Zellen zeigen Breite radioaktiven Signale zwischen 20 und 30 nt. Neben HeLa-Zellen, wir haben Tests mit verschiedenen Arten von Zelllinien durchgeführt und festgestellt, dass die signalmuster in andere Zelle Arten9geändert werden kann: einige zeigen eines starken Signals nur rund 30 nt, einige zeigen eines ähnlichen Musters mit HeLa-Zellen. Wir haben auch den Assay mit RNA-Vorlagen als die 34 nt Vorlage8, kurz durchgeführt und lange (~ 300 nt) RNAs mit verschiedenen Sequenzen und erfolgreich Trichothecene Produkte aus diesen Vorlagen erhalten, obwohl einige Präferenz sein kann. Für den ersten Test empfehlen wir jedoch mit HeLa-Zellen in der mitotischen Phase und die 34 nt RNA-Vorlage. RdRPs können sowohl in eine Grundierung-abhängige eine Grundierung-unabhängige Weise11doppelsträngige RNA generieren. Wir haben berichtet, dass TERT diese Eigenschaft als menschliche Trichothecene7,9 bewahrt; TERT synthetisiert DsRNA aus einer RNA-Vorlage mit 3' Foldback-Struktur durch eine Rücken-Priming-Mechanismus-7. Für die 34 nt RNA-Vorlage synthetisiert TERT komplementäre Stränge ohne Verwendung von Primern9. Speziell Trichothecene Produkte synthetisiert in einer Grundierung-unabhängige Weise, d. h. de Novo synthetisiert RNA Produkte, [α -32P] erkennen NTP ausgetauscht werden mit [γ -32P] NTP Trichothecene Reaktion9.
MNase Behandlung von Immunkomplexen TERT auf Perlen ist ein entscheidender Schritt, um gewünschte Ergebnisse zu erzielen. Erfolgt die MNase Behandlung zu lange oder mit intensivem schütteln, würde die Trichothecene Produkte bemerkenswert reduziert werden. Um solchen Ärger zu vermeiden, empfehlen wir dringend, sich streng an das Protokoll sorgfältig. HMD-Lösung ist ein weiterer entscheidender Faktor für den Erfolg. Wenn Sie feststellen, dass die Signale sehr schwach sind, ersetzen Sie die HMD-Lösung zu einem neu vorbereitet.
Im gesamten Protokoll sollte man großen Sorgfalt zur Vermeidung von Kontaminationen RNase nehmen. Ribonuklease Behandlung sollte mit speziellen Geräten durchgeführt werden. Nach Manipulation der Ribonuklease, man sollte die Spitzen auswerfen und Rohre mit RNase sofort beseitigen RNase mit spezialisierten Lösung (z.B. RNase ruhig), und ändern Sie Haine.
TERT interagiert mit nicht nur TERC , sondern auch viele Arten von endogenen RNAs, und wir haben7Teil davon berichtet. Änderung in der IP-Trichothecene-Assay, wie z. B. die IP-Trichothecene Assay ohne MNase Behandlung, wird eine vollständige Liste der endogene RNA-Vorlagen für TERT-assoziierten Trichothecene Aktivität und bioinformatische Guide auf ihre Sequenz-Funktionen bieten. Wir haben dieses Protokoll erfolgreich an Gewebe lysate angewendet. Da TERT in einer Vielzahl von normalen und Tumor Geweben ausgedrückt wird, kann dieser Test sinnvoll, nicht-kanonische enzymatischen Funktion der TERT in Menschen zu untersuchen sein.

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) ist bekannt als die katalytische Untereinheit der Telomerase und es verlängert Telomer Telomerase RNA Komponente (TERC), die spezifische RNA-Vorlage1. Obwohl TERT telomeric DNA als Bestandteil der Telomerase polymerisiert, zufolge der Struktur- und phylogenetischen Analysen TERT ist eng mit der viralen RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRPs) sowie viralen reversen Transkriptase und teilt Domains mit Diese Polymerasen2,3,4. Trichothecene ist das Enzym, das komplementäre RNA-Strang zu einer Vorlage RNA erzeugt. Das Enzym ist nicht nur Viren, sondern auch in Modellorganismen wie Pflanze, Hefe und Wurm, codiert und doppelsträngige RNA-Synthese durch Trichothecene trägt zur transkriptionellen und posttranskriptionelle gen-silencing in diese Organismen5,6 . Obwohl menschliche Trichothecene lange gefehlt hatte, fanden wir Trichothecene Aktivität in menschlichen TERT in 20097.
Wir zuerst bestätigt Trichothecene Tätigkeit der TERT mit rekombinanten Proteins7, dann etabliert einen sensible in Vitro Assay um Trichothecene Aktivität von endogenen TERT8erkennen. Hier zeigen wir die in-vitro- Trichothecene Assay (IP-Trichothecene Assay) für endogene TERT. Diese Methode beginnt mit Immunopräzipitation (IP) des endogenen TERT und ist gefolgt von in-vitro- Trichothecene Reaktion, in denen radioaktive Purine entstehende RNA-Stücke integriert sind.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle&amp;rsquo;s medium (DMEM)</td><td>Wako</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>CORNING</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin mixed solution</td><td>nacalai tesque</td><td>26253-84</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-Ethylenediamenetetraacetic acid (EDTA) solution</td><td>nacalai tesque</td><td>32777-44</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS(-))</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>nacalai tesque</td><td>07147-61</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>nacalai tesque</td><td>08904-85</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>nacalai tesque</td><td>31333-45</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>nacalai tesque</td><td>35434-21</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>nacalai tesque</td><td>18321-05</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 (NP-40)</td><td>nacalai tesque</td><td>25223-04</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protein A Plus Agarose</td><td>Thermo scientific</td><td>22812</td><td></td></tr><tr><td>2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (HEPES)</td><td>nacalai tesque</td><td>17514-15</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydroxide</td><td>Wako</td><td>168-21815</td><td></td></tr><tr><td>Potassium acetate</td><td>nacalai tesque</td><td>28405-05</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2&amp;bull;6H2O)</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>nacalai tesque</td><td>17045-65</td><td></td></tr><tr><td>Polyoxyethylene(10) octylphenyl ether (Triton X-100)</td><td>Wako</td><td>169-21105</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, EDTA-free</td><td>Roche Applied Science</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2&amp;bull;2H2O)</td><td>nacalai tesque</td><td>06731-05</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal nuclease (MNase)</td><td>Takara Bio</td><td>2910A</td><td></td></tr><tr><td>Ethylene glycol bis (b-aminoethylether)-N,N,N&#039;,N&#039;-tetraacetic acid (EGTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15214-92</td><td></td></tr><tr><td>3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonat (CHAPS)</td><td>nacalai tesque</td><td>07957-64</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>nacalai tesque</td><td>14128-91</td><td></td></tr><tr><td>rCTP, rATP, rUTP, rGTP, 100mM each</td><td>Promega</td><td>E6000</td><td></td></tr><tr><td>[a-&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]UTP (3,000 Ci/mmol)</td><td>PerkinElmer</td><td>NEG507H</td><td>Use fresh RI for the assay</td></tr><tr><td>RNase inhibitor</td><td>TOYOBO</td><td>SIN-201</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Takara</td><td>9033</td><td></td></tr><tr><td>Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>3 M Sodium acetate</td><td>NIPPON GENE</td><td>316-90081</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol (99.5)</td><td>nacalai tesque</td><td>14713-95</td><td></td></tr><tr><td>Dr. GenTLE Precipitation Carrier</td><td>Takara Bio</td><td>9094</td><td></td></tr><tr><td>RNase One Ribonuclease</td><td>Promega</td><td>M4265</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>nacalai tesque</td><td>02873-75</td><td></td></tr><tr><td>Formamide, deionized</td><td>nacalai tesque</td><td>16345-65</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (EDTA)</td><td>nacalai tesque</td><td>15130-95</td><td></td></tr><tr><td>Orange G</td><td>nacalai tesque</td><td>25401-22</td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>SCA-325DRS</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>EX-135</td><td>For step B)</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., KUBOTA</td><td>3740</td><td>For step 6.2</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q125</td><td>Set a microtip (#4422) on the sonicator, for step 6.4</td></tr><tr><td>Micro refrigerated centrifuge</td><td>e.g., TOMY</td><td>MX-305</td><td>For step 6.5</td></tr><tr><td>Cooled incubator</td><td>e.g., Panasonic</td><td>MIR-154-PJ</td><td>Set a rotary shaker inside</td></tr><tr><td>Rotary shaker</td><td>e.g., TAITEC</td><td>RT-5</td><td></td></tr><tr><td>Cooled incubator&amp;nbsp;</td><td>e.g., TAITEC</td><td>BR-43FL</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 7.7</td></tr><tr><td>MINI WAVE</td><td>AS ONE</td><td>WEV-03</td><td>A shaker for steps 7.7, 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>e.g., TAITEC</td><td>HB-80</td><td>Set a shaker &amp;ldquo;MINI WAVE&amp;rdquo; inside, for step 8.5 and 8.6</td></tr><tr><td>Block incubator</td><td>e.g., ASTEC</td><td>BI-516S</td><td></td></tr></tbody></table>

semi-quantitative detection of rna-dependent rna polymerase activity of human telomerase reverse transcriptase protein

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) ist die katalytische Untereinheit der Telomerase und es verlängert Telomere durch RNA-abhängige DNA-Polymerase-Aktivität. Obwohl eine Reverse Transkriptase TERT genannt wird, nachweislich Struktur- und phylogenetische Analysen der TERT TERT ist Mitglied der Rechtshänder Polymerasen und bezieht sich auf die virale RNA-abhängige RNA-Polymerasen (RdRPs) sowie viralen reversen Transkriptase. Wir identifiziert zunächst Trichothecene Aktivität des menschlichen TERT, die komplementäre RNA erzeugt stehen, um eine Vorlage, die nicht-kodierende RNA und trägt zur RNA silencing in Krebszellen. Um dieses nicht-kanonischen enzymatische Aktivität zu analysieren, wir Trichothecene Assay mit rekombinanten TERT im Jahr 2009 entwickelt, danach in Vitro Trichothecene Assay für endogene TERT gegründet. In diesem Manuskript beschreiben wir die letztere Methode. Kurz, TERT Immunkomplexe aus Zellen zu isolieren, und inkubiert mit RNA-Vorlage und rNTPs einschließlich radioaktive rNTP für Trichothecene Reaktion. Einsträngige RNA zu beseitigen, sind Reaktionsprodukte mit RNase behandelt, die ich, und die Endprodukte mit Polyacrylamid Gelelektrophorese analysiert werden. Radioaktiven Trichothecene Produkte können nach Übernachtung Exposition durch Autoradiographie nachgewiesen werden.

Mit der empfohlenen RNA-Vorlage werden radioaktive Trichothecene Produkte zwischen 20 bis 30 Nukleotiden (nt) speziell in HeLa-Zellen in mitotischen Phase nach der Übernachtung Exposition (Abbildung 1A) beobachtet. In der Regel Signalintensität der Trichothecene Produkte zeigt zwei Peaks, die rund 25 positioniert sind nt und 30 nt im Einklang mit der Größenverteilung der Produkte vom nächsten Generation Sequenzierung9bestätigt. Im Gegensatz zur mitotischen Zellen zeigen HeLa-Zellen ohne Synchronisation fast keine der 20 – 30 nt radioaktive Produkte. Ovale Signale, die unter 20 liegen nt in allen Proben sind unspezifische driftet.
Für den Fall, dass nur ~ 30 nt Produkt mit schwachem Signal in mitotischen HeLa-Zellen gibt, bedeutet dies, dass die Trichothecene Reaktion nicht gut gehen. Beispielsweise wenn MNase Behandlung grob und unsachgemäß durchgeführt wird, die Signalintensität in mitotischen HeLa Zellen sinkt deutlich (Abbildung 1 b). Trichothecene Reaktion durchgeführt mit alten HMD-Lösung reduziert auch die Produkte (Abbildung 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57021/57021fig1.jpg"> Abbildung 1 : Vertreter RdRP Produkte von endogenen TERT in mitotischen HeLa-Zellen. (A) drei repräsentative Ergebnisse des IP-Trichothecene Assays in HeLa-Zellen mit Nocodazole (manipuliert) oder DMSO (unmanipuliertes) behandelt. Die chemisch synthetisierten 34 nt RNA diente als Vorlage. (B) IP-Trichothecene Assay in mitotischen HeLa-Zellen mit ungeeigneten MNase Behandlung durchgeführt. (C) IP-Trichothecene Assay in mitotischen HeLa-Zellen mit frisch oder alt HMD-Lösung durchgeführt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57021/57021fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease, 20 U/µL</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Micrococcal Nuclease Puffer, 10-fach</td>
			<td>8 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>51 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: MNase Reaktion Mischung Komponente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>CHAPS, 0,07 % (wt/Vol.)</td>
			<td>6 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>HMD-Lösung</td>
			<td>2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rATP, 80 mM</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rGTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rUTP, 0,4 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>rCTP, 8 mM</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-Inhibitor, 40 U/µL</td>
			<td>0,5 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>1 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 2: Trichothecene Reaktion Mischung Komponente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reagenzien</td>
			<td>Volumen</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase eine Ribonuklease, 10 U/µL</td>
			<td>0,2 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reaktion-Puffer, 10-fach</td>
			<td>20 ΜL</td>
		</tr>
<tr>
<td>RNase-freies Wasser</td>
			<td>159.8 ΜL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Ribonuklease Reaktion Mischung Komponente.

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) synthetisiert nicht nur telomeric DNA, sondern auch doppelsträngige RNA durch RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität. Hier beschreiben wir einen neu gegründeten Assay um RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität der endogenen TERT zu erkennen.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

semi-quantitative-detection-rna-dependent-rna-polymerase-activity

Research

JoVE Journal

Genetics

9.8K Aufrufe.  National Cancer Center Research Institute. Menschliche Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) synthetisiert nicht nur telomeric DNA, sondern auch doppelsträngige RNA durch RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität. Hier beschreiben wir einen neu gegründeten Assay um RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität der endogenen TERT zu erkennen.

Serie: Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

Forschung

Medizin

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved N6-isopentenyladenosine modifications occurs at the A37 position in a subset of tRNAs. This modification improves translation efficiency and fidelity by increasing the affinity of the tRNA for the ribosome. Mutation of enzymes responsible for this modification in eukaryotes are associated with several disease states, including mitochondrial dysfunction and cancer. Therefore, understanding the substrate specificity and biochemical activities of these enzymes is important for understanding of normal and pathologic eukaryotic biology. A diverse array of methods has been employed to characterize i6A modifications. Herein is described a direct approach for the detection of isopentenylation by Mod5. This method utilizes incubation of RNAs with a recombinant isopentenyl transferase, followed by RNase T1 digestion, and 1-dimensional gel electrophoresis analysis to detect i6A modifications. In addition, the potential adaptability of this protocol to characterize other RNA-modifying enzymes is discussed.

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Here, we describe a protocol for the biochemical characterization of the yeast RNA-modifying enzyme, Mod5, and discuss how this protocol could be applied to other RNA-modifying enzymes.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Biochemie

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase chain reaction (PCR)-based method allows for robust measurements of enzyme activity from most cell lysates. The gel-based TRAP with fluorescently labeled primers limits sample throughput, and the ability to detect differences in samples is restricted to two fold or greater changes in enzyme activity. The droplet digital TRAP, ddTRAP, is a highly sensitive approach that has been modified from the traditional TRAP assay, enabling the user to perform a robust analysis on 96 samples per run and obtain absolute quantification of the DNA (telomerase extension products) input within each PCR. Therefore, the newly developed ddTRAP assay overcomes the limitations of the traditional gel-based TRAP assay and provides a more efficient, accurate, and quantitative approach to measuring telomerase activity within laboratory and clinical settings.

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

We successfully converted the standard telomere repeat amplification protocol (TRAP) assay to be employed in droplet digital polymerase chain reactions. This new assay, called ddTRAP, is more sensitive and quantitative, allowing for better detection and statistical analysis of telomerase activity within various human cells.

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Krebsforschung

Detection of Tilapia Lake Virus Using Conventional RT-PCR and SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be used as part of surveillance programs, biosecurity measures and in TiLV basic research laboratories. The gold standard of virus diagnostics typically involves virus isolation followed by complementary techniques such as reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) for further verification. This can be cumbersome, time-consuming and typically requires tissue samples heavily infected with virus. The use of RT-quantitative (q)PCR in the detection of viruses is advantageous because of its quantitative nature, high sensitivity, specificity, scalability and its rapid time to result. Here, the entire method of PCR based approaches for TiLV detection is described, from tilapia organ sectioning, total ribonucleic acid (RNA) extraction using a guanidium thiocyanate-phenol-chloroform solution, RNA quantification, followed by a two-step PCR protocol entailing, complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative identification via qPCR using SYBR green I dye. Conventional PCR requires post-PCR steps and will simply inform about the presence of the virus. The latter approach will allow for absolute quantification of TiLV down to as little as 2 copies and thus is exceptionally useful for TiLV diagnosis in sub-clinical cases. A detailed description of the two PCR approaches, representative results from two laboratories and a thorough discussion of the critical parameters of both have been included to ensure that researchers and diagnosticians find their most suitable and applicable method of TiLV detection.

This protocol diagnoses Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues using RT-PCR methodologies. The entire method is described from tissue dissection to total RNA extraction, followed by cDNA synthesis and detection of TiLV by either conventional PCR or quantitative PCR using dsDNA binding a fluorescent binding dye.

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

The aim of this method is to facilitate the fast, sensitive and specific detection of Tilapia Lake Virus (TiLV) in tilapia tissues. This protocol can be ...

Umwelt

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and ...

Genetik

<meta charset="utf8"></head><body>Genaue Bewertung der Telomerlänge in Studien zur menschlichen Population

Monochrome Multiplex Quantitative PCR Telomere Length Measurement

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. Telomere length (TL) has been associated with various exposures, biological processes, and health outcomes. This article describes the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay protocol routinely conducted in our laboratory for measuring relative mean TL from human DNA. There are several different PCR-based TL measurement methods, but the specific protocol for the MMqPCR method presented in this publication is repeatable, efficient, cost-effective, and suitable&#160;for population-based studies. This detailed protocol outlines all information necessary for investigators to establish this assay in their laboratory. In addition, this protocol provides specific steps to increase the reproducibility of TL measurement by this assay, defined by the intraclass correlation coefficient (ICC) across repeated measurements of the same sample. The ICC is a critical factor in evaluating expected power for a specific study population; as such, reporting cohort-specific ICCs for any TL assay is a necessary step to enhance the overall rigor of population-based studies of TL. Example results utilizing DNA samples extracted from peripheral blood mononuclear cells demonstrate the feasibility of generating highly repeatable TL data using this MMqPCR protocol.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Erforschung der Auswirkungen von Traumata auf die Zellalterung

Here we present a protocol for the measurement of relative telomere length (TL) using the monochrome multiplex quantitative polymerase chain reaction (MMqPCR) assay. The MMqPCR assay is a repeatable, efficient, and cost-effective method for measuring TL from human DNA in population-based studies.

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung 

Telomeres are ribonucleoprotein structures at the end of all eukaryotic chromosomes that protect DNA from damage and preserve chromosome stability. ...

Quantifizierung der Telomerlänge mittels nicht-radioaktiver Chemilumineszenzdetektion

Optimization of Performance Parameters of the TAGGG Telomere Length Assay

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening occurs due to a problem with end replication and the absence of the telomerase enzyme, which is responsible for maintaining telomere length. Interestingly, telomeres also shorten in response to various internal physiological processes, like oxidative stress and inflammation, which may be impacted due to extracellular agents like pollutants, infectious agents, nutrients, or radiation. Thus, telomere length serves as an excellent biomarker of aging and various physiological health parameters. The TAGGG telomere length assay kit is used to quantify average telomere lengths using the telomere restriction fragment (TRF) assay and is highly reproducible. However, it is an expensive method, and because of this, it is not employed routinely for large sample numbers. Here, we describe a detailed protocol for an optimized and cost-effective measurement of telomere length using Southern blots or TRF analysis and non-radioactive chemiluminescence-based detection.

Autor im Rampenlicht: Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays  

Here, we describe in detail the protocol for quantifying telomere length using non-radioactive chemiluminescent detection, with a focus on the optimization of various performance parameters of the TAGGG telomere length assay kit, such as buffer quantities and probe concentrations.

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Telomeres are repetitive sequences which are present at chromosomal ends; their shortening is a characteristic feature of human somatic cells. Shortening ...

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Zusammenfassung

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MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

Tröpfchendigital TRAP (ddTRAP): Anpassung des Telomere Repeat Amplification Protocol an die Reaktion auf die digitale Polymerase Chain Reaction

Erkennung von Tilapia See Virus mit konventionellen RT-PCR und SYBR Green RT-qPCR

Antikörperfreier Assay für rna-Methyltransferase-Aktivitätsanalyse

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung

Monochrome Multiplex-Quantitative PCR-Telomerlängenmessung

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays

Optimierung der Leistungsparameter des TAGGG Telomerlängen-Assays