Ex-vivo-Erweiterung der hämatopoetischen Stammzelle aus Nabelschnurbluteinheit halten große Versprechen für HSC-Anwendung in der regenerativen Medizin und Transplantationstherapie. Dieses Protokoll verwendet einen Zytokin-Cocktail in Kombination mit Valproinsäure-Behandlung, um schnell eine große Anzahl von funktionellen HSCs mit Eigenschaften zu erweitern, die primären primitiven HSCs sehr ähnlich sind. Aufgrund der schnellen Wirkung der Valproinsäurebehandlung hat diese Methode auch das Potenzial, den Verlust von HSCs im Zusammenhang mit der Genbearbeitung zu überwinden.
Diese Methode könnte für die Erzeugung einer höheren Anzahl genetisch veränderter Zellen innerhalb eines Zeitraums von Vorteil sein, der für derzeit verwendete Genmodifikationsprotokolle relevant ist. Das Valproicsäure ex vivo Expansionsprotokoll ist relativ einfach und zuverlässig. Die Reinigung von CD34-positiven Zellen mit dem Zellabscheidergerät ist sehr reproduzierbar und schnell, was eine schnelle Wiederherstellung hochgereinigter CD34-positiver Zellen ermöglicht.
24 Stunden vor der Isolierung von CD-34-positiven Zellen aus Nabelschnurblut, bereiten Sie den Trennpuffer durch Zugabe von zwei Millilitern von 0,5 Molaren EDTA und 33 Milliliter von 7,5%BSA zu 465 Millilitern 1X PBS. Mischen Sie den Puffer sanft und halten Sie ihn über Nacht bei vier Grad Celsius. Am Tag der Reinigung, erwärmen Sie die Medien auf Raumtemperatur.
Geben Sie die gesamte Nabelschnurbluteinheit in einen 75-Quadrat-Zentimeter-Kolben. Das Blut mit einem gleichen PBS-Volumen bei Raumtemperatur verdünnen und sanft mischen. Als nächstes bestimmen Sie die Anzahl der Röhren, die für die Verarbeitung der gesamten Nabelschnurbluteinheit erforderlich sind.
Fügen Sie 15 Milliliter Dichtegradientenmedien zu jedem Rohr hinzu. Geben Sie das verdünnte Blut sehr langsam auf den Dichtegradienten, während Sie das Rohr in einem 45-Grad-Winkel halten, um zwei Schichten zu erstellen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 g für 30 Minuten mit einer niedrigen Beschleunigungs- und Verzögerungsrate.
Nach der Zentrifugation befinden sich die mononukleären Zellen in der weißen Schicht zwischen den Plasma- und Dichtegradienten-Medienschichten. Übertragen Sie die buffy Schicht vorsichtig in ein neues 50-Milliliter-Rohr. Sammeln Sie alle mononukleären Zellen aus der gleichen Nabelschnurbluteinheit in eine 50-Milliliter-Röhre, bis sie 25 Milliliter erreichen.
25 Milliliter kaltes PBS in die Röhre geben, die 25 Milliliter mononukleäre Zellen enthält, und gut vermischen. Zentrifuge bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 10 Minuten. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 50 Millilitern kalter PBS wieder aufhängen.
Danach entfernen Sie 20 Mikroliter der Zellsuspension zum Zählen. Verwenden Sie einen automatisierten Zellzähler, um die Anzahl der Zellen zu zählen, die entweder mit Akridinorange oder Propidiumjodid gefärbt sind, und berechnen Sie die Gesamtzahl der mononukleären Zellen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten.
Mischen Sie zunächst 300 Mikroliter Trennpuffer mit 100 Mikroliter menschlichen FCR humanem IgG und 100 Mikroliter CD34-Magnetperlen, um die CD34-positiven Zellen von 10 Millionen mononukleären Zellen zu isolieren. Als nächstes entfernen Sie vorsichtig den Überstand aus einem Röhrchen von zuvor zentrifugierten mononukleären Zellen. Setzen Sie das Pellet in der magnetischen Perlenlösung mit 500 Mikrolitern pro 10 Millionen Zellen wieder auf.
Sanft mischen und bei vier Grad Celsius 30 Minuten lang bebrüten. Bereiten Sie während der Inkubation das Zellabscheidergerät vor, indem Sie die Speicherlösung durch den Arbeitspuffer ersetzen und ein Waschprogramm mit anschließendem Spülprogramm ausführen. Fügen Sie dann dem Rohr, das die Zellmischung enthält, einen Kaltzellentrennungspuffer hinzu, bis das Rohr vollständig gefüllt ist.
Zentrifugieren Sie das Rohr bei 400 g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie das Zellpellet im Kaltabscheider-Laufpuffer mit zwei Millilitern pro 10 Millionen Zellen wieder auf. Das Zwei-Milliliter-Zellsuspensionsgemisch in 15-Milliliter-Röhren übertragen.
Laden Sie drei Sätze der Rohre in das Zellabscheider-Rack, das auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Ein Satz von Röhren enthält MMCs, der zweite Satz von Röhren wird verwendet, um den negativen Anteil zu sammeln, und ein dritter Satz von Röhren wird verwendet, um gereinigte CD34-positive Zellen zu sammeln. Laden Sie das Rack in das Zelltrenngerät, und führen Sie das voreingestellte Programm aus.
Danach zentrieren Sie die Rohre, die den positiven Anteil bei 400 g bei und vier Grad Celsius für 15 Minuten enthalten. Den Überstand ansaugen und die gereinigten CD34-positiven Zellen in einem Milliliter serumfreien Medium wieder aussetzen. Verwenden Sie dann einen automatisierten Zellzähler, um die mit Acridinorange oder Propidiumjodid gefärbten Zellen zu zählen.
Bereiten Sie zunächst ein ausreichendes Medienvolumen vor, um die gereinigten CD34-positiven Zellen mit einer Dichte von 33.000 Zellen pro Milliliter zu verdichten. Die gereinigten CD34-positiven Zellen in einer 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 50.000 Zellen in 1,5 Milliliter Medien pro Brunnen. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem 5% kohlendioxidbefeuchteten Inkubator für 16 Stunden.
Fügen Sie den Kulturen Valproinsäure so hinzu, dass die Endkonzentration ein Millimolar beträgt. Kultivieren Sie die Zellen unter den gleichen Bedingungen für weitere sieben Tage. In diesem Ex-vivo-Protokoll wird die Anzahl der primitiven hämatopoetischen Stammzellen erhöht, die aus CD34-positiven Zellen erzeugt werden, die aus Nabelschnurblut isoliert sind.
Die Gesamtzahl der nukleierten Zellen ist in Kulturen, die allein mit dem Zytokincocktail behandelt werden, signifikant höher. Trotz der höheren Anzahl an gesamtnukleierten Zellen bleibt die Anzahl der hämatopoetischen Stammzellen in den Kulturen, die den Zytokin-Cocktail allein erhalten, während der gesamten Expansionsphase niedrig, verglichen mit Kulturen, die mit Zytokincocktail und Valproinsäure behandelt werden. Die größte Anzahl hämatopoetischer Stammzellen wird in Kulturen erzeugt, die mit einer Kombination aus Zytokincocktail und Valproinsäure behandelt werden.
Insbesondere wird die größte Expansion nach fünf bis sieben Tagen nach der Behandlung mit Valproinsäure erreicht. Diese erhöhte Anzahl hämatopoetischer Stammzellen korreliert mit einer raschen Erhöhung des Anteils hämatopoetischer Stammzellen, was innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung mit Valproinsäure bemerkenswert ist. Während der Prozentuale Anstieg während der ersten vier Tage der Ex-vivo-Kultur beibehalten wird, nimmt er nach fünf bis sieben Behandlungstagen schrittweise ab.
Diese Abnahme korreliert jedoch umgekehrt mit einem Anstieg der absoluten Anzahl hämatopoetischer Stammzellen. Der rasche Anstieg des Anteils hämatopoetischer Stammzellen in valprosäurebehandelten Kulturen ist auf die Erfassung des CD90-Phänotyps zurückzuführen. CD34-positive Zellen, die den cd90-phänotisch-marker exzessiv ex vivo-Kulturen exvivo ex vivo exreichen, vier Tage lang mit dem Zytokincocktail und Der Valproinsäure behandelt, erreichen fast 40 bis 50%.
Die Erfassung des CD90-Phänotyps wird dann durch ex vivo-Erweiterung der hochgereinigten CD34-positiven Zellen bestätigt, denen die Expression des CD90-Markers fehlt. Innerhalb von 24 Stunden nach der Behandlung mit Valproinsäure drücken fast 75% der ex vivo expandierten Zellen CD90 aus. Dieser Phänotyp wird in den ersten vier Tagen in diesen Kulturen stark erhalten.
Das verdünnte Nabelschnurblut sollte sehr langsam auf den Dichtegradienten abgegeben werden, während das Rohr in einem 45-Grad-Winkel gehalten wird, um zwei unterschiedliche Schichten zu erzeugen. Nach diesem Ex-vivo-Erweiterungsverfahren können die erweiterten Zellen in die myeloabierten immungeschwächten NSG-Mäuse injiziert werden, um ihre Funktionalität und ihr Einpfropbefreienpotenzial zu testen. Die erweiterten Zellen können verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen in Bezug auf die Biologie von Mensch und Maus HSC und die Rolle der verschiedenen Gene oder kritischen Akteur auf die funktionelle Integrität von HSCs zu testen.
Die Funktionalität des ex vivo erweiterten HSC von der menschlichen Nabelschnurbluteinheit mit dieser Technik wird bald in einer klinischen Studie bei Patienten mit hämatologischen Malignitäten getestet, die eine allogene Knochenmarktransplantation erfordern. Diese Technik hat es uns auch ermöglicht, den Mechanismus zu untersuchen, der der Ex-vivo-Erweiterung mit VPA-Behandlung zugrunde liegt, und Einblicke in die Biologie primitiver HSCs zu erhalten.
