Die Autoren bedanken sich Katharina Schallmoser für die Bereitstellung PHPL, Eva Rohde und Nicole Hofmann für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Daniela Thaler und Margaretha Fr hwirth für die technische Unterstützung, Monica Farrell für die sprachliche Bearbeitung, Uwe Lang, Margit Holzapfel und Sandra Eppich am Institut für Geburtshilfe für die Bereitstellung der Leitungen. Diese Arbeit wurde von der Austrian Research Foundation (FWF, gewähren N211-NAN zu DS), der Österreichischen Forschungsförderungsgesellschaft (FFG, gewähren N200 zum DS) und The Adult Stem Cell Research Foundation (AR) unterstützt worden. AR ist ein Fellow des PhD-Programm Molecular Medicine der Medizinischen Universität Graz.

Teil 1: Einrichten 1. Vorbereitung von Zellkulturmedium Vor dem Start des Mediums Vorbereitung sammeln alle Materialien und Werkzeuge, die Sie benötigen. Thaw 2 x 56 ml Aliquots von gepoolten menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL, self-made: Referenz 1 &amp; JoVE # 1523), 10 ml einer 100x Penicillin / Streptomycin-Lösung, 2 x 5 ml L-Glutamin (beide Sigma). Auftauen Zytokin-und Wachstumsfaktor Aliquots (VEGF, bFGF, EGF, IGF, Hydrocortison, Ascorbinsäure, Heparin, Amphotericin als &quot;einzigen quots &#39;versehen) zur Ergänzung 1 Flasche (500 ml) von EGM-2 Medium (Lonza) eingestellt. Aus dem Kühlschrank nehmen Sie eine 500 ml Flasche jeweils (i) alpha-modifizierte minimal essential medium (a-MEM) und (ii) endothelial Basalmedium (EBM). Alle folgenden Schritte werden in einer laminaren Strömung Gewebekultur Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Bereiten Sie frei von Konservierungsmitteln Heparin (zB Biochrom) durch Auflösen des Pulvers zu einer endgültigen Konzentration von 1000 IU / mL mit sterilem Wasser. MSC-Medium: Verwenden Sie 500 ml a-MEM, fügen Sie 56 ml des aufgetauten PHPL (siehe auch Hinweis 1 für weitere Details) und 2 IU / mL (= 224 ul der Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin (verhindert Koagulation des Mediums durch Verklumpung der das Fibrinogen im Plasma), um eine endgültige Konzentration von 10% PHPL. Zusätzlich fügen Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100μg/mL)-Lösung und 2 mM L-Glutamin (beide Sigma). Filter das Medium, durch ein 20 um-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). ECFC-Medium: Verwenden Sie eine Flasche (500 ml) von EBM, fügen Sie die Zytokin-Aliquots, 56 ml PHPL, 10 IU / ml (= 1120μl Stammlösung) der frei von Konservierungsmitteln Heparin, Penicillin (100U/mL) / Streptomycin (100 g / ml)-Lösung und 2 mM L-Glutamin, die Basalmedium und Filter mit 20 ul-Porengröße Vakuum-Filter (Millipore). Beschriften Sie die Flasche entsprechend (Inhalt, Datum). 2. Sterilisation von chirurgischen Instrumenten Pinzetten, scharfen Paar der chirurgischen Schere und Skalpell Inhaber muss Hitze sterilisiert Erz sterile Einmalprodukte werden. 3. Vorbereitung von Rohren für Kabel-Sammlung Add 500 IU Konservierungsmittel - free Heparin auf 50 ml Polypropylen-Röhrchen (Falcon) und passen Sie auf ein Endvolumen von 20 mL mit PBS. Übertragen Sie die Rohre in den Kreißsaal. 4. Informed Consent (bestätigt durch Ihren örtlichen Ethikkommission oder IRB). Bitten Sie die Eltern vor der Auslieferung, wenn sie möchten ein Stück von der Schnur zu spenden und angemessen informieren sie über den Zweck es dienen soll. 5. Cord Spende Nach der Lieferung und Kontrolle der Plazenta und Schnur schnitt ein 10 cm Stück und sofort übertragen, um Ihre Rohr mit Heparin vorgefüllte zu einer Koagulation des Blutes im übrigen die Schnur Gefäße zu vermeiden. Fahren Sie mit Zellisolation so schnell wie möglich. Teil 2: Zellisolierung <ol><li> Bereiten Laminar-Flow-Gewebekultur Haube von Oberflächen mit Incidin oder 70% EtOH. Legen Sie sterile 150 cm 2 Zellkultur-Platten, 75 cm Zellkulturflaschen (beide Corning), PBS, sterilisiert chirurgische Instrumente, Zell-Schaber, Rohrhalter, 25 mL stripettes und 5 ml Spritzen mit stumpfen Ende Nadeln entsprechend in Ihrem gereinigt Kapuze ausgestattet. </li><li> Pre-warm Ihre vorbereiteten α-MEM und EGM-2 Zellkulturmedium auf 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Bringen Sie das Kabel aus dem Kreißsaal in Ihrem Labor mit der Zellkultur Kapuze ausgestattet. Nach dem Übertragen der Schnur in der laminaren Strömung waschen Sie es zweimal in PBS (durch die Übertragung auf eine neue Platte) loswerden kontaminierender Blutzellen. Spülen Sie die Nabelvene nach canulating es auf der einen Seite mit einer sterilen 5 ml Spritze mit einer stumpfen Ende Nadel mit PBS, bis die Flüssigkeit aus dem anderen Ende des Kabels ausgestattet wird komplett transparent (rötlich zeigt Kontamination mit Blut). </li></ol> ECFCs: <ol start="4"><li> Bereiten Sie eine 75 cm 2-Kolben (Corning), beschriften Sie sie und füllen Sie in 15-20 ml vorgewärmten EGM-2 Medium. </li><li> Stecken Sie das Kabel in eine neue Platte mit sterilem PBS gefüllt. Nehmen Sie die chirurgische Schere und schnitt die Nabelschnur in zwei Stücke von ca. 5 cm in der Länge (kurze Stücke sind leichter zu verarbeiten, weil die Nabelgefässe entlang ihrer Achse verdreht sind). </li><li> Versuchen Sie, die Nabelvene (großes Schiff) finden, legen Sie ein Blatt des chirurgischen Schere und schnitt die Vene in Längsrichtung. An diesem Punkt könnte es hilfreich sein, wenn ein Assistent die bereits aufgeschnittenen Vene mit zwei Zangen halten können, während Sie weiter zu senken. </li><li> Stecken Sie das Kabel piece mit der aufgeschnittenen Vene in eine neue Platte ohne PBS, nehmen Sie die Zellschaber und kratzen der inneren (Endothelzellen) Oberfläche der Nabelschnur durch Abreibungen von einem Ende zum anderen. Übertragen Sie die Zellen, um Ihre vorbereiteten Kolben durch die Reinigung der Spitze des Kratzers in das Medium. Wiederholen Sie diese Prozedur mindestens 10 mal. </li><li> Schließen Sie die Flasche und steckte es in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). </li></ol> MSCs: <ol start="4"><li> Bereiten Sie eine 150 cm 2 Kultur (Corning) und beschriften Sie sie. </li><li> Nehmen Sie das Stück Schnur (nach Abschaben der Endothelschicht) und schneiden das ganze Kabel in sehr kleine Stücke mit einer sterilen Schere und sterilen Skalpell. Maximale Größe des Kabels Stücke sollten 1-2 mm sein. </li><li> Übertragen Sie Ihre Schnur Stücke mit der sterilen Pinzette in das pre-markierten Kultur Platte. Indem Sie die Platte für 5 Minuten vor dem Befüllen mit Medium öffnen, wird die Anlage der Stücke auf der Kunststoffoberfläche gestärkt. </li><li> Sobald die Schnur Stücke angemessen auf die Kunststoff verbunden sind, sanft in 30-35 ml vorgewärmten alpha geändert MEM hinzuzufügen. Versuchen Sie, die niedrigste Geschwindigkeit nutzen, um sicherzustellen, dass alle Stücke verbunden bleiben. </li><li> Schließen Sie die Platte und lege sie in einen Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, 95% Luftfeuchtigkeit). </li></ol> Teil 3: Cell Expansion und Bestätigung der Immun-Phänotyp mittels Durchflusszytometrie Zell-Expansion EFCFs: <ol><li> Überprüfen Sie die Befestigung der Endothelzellen am nächsten Tag auf einem inversen Mikroskop und Austausch ganze EGM-2 Medium, um loszuwerden, alle nicht-anhaftenden Zellen und Partikeln. </li><li> Erweitern Sie die Zellen bis zur Mündung und zum Austausch ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche. Wenn Konfluenz erreicht ist, lösen die Zellen mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Abhängig von der Anzahl der Zellen innerhalb Ihres T75 Kolben, sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen zu niedrigen Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen. </li></ol> MSCs: <ol><li> Der Auswuchs von MSCs aus der Nabelschnur wird länger dauern, so können Sie warten mindestens 3-4 Tage, bis Sie überprüfen, auf einem inversen Mikroskop für das Auftreten von spindelförmigen Zellen in der Umgebung des angeschlossenen Gewebestücke. Wenn es genügend Zellen aus-Wachstum, neigen die Stücke zu trennen, weil sie Kontakt mit dem Kunststoff zu verlieren. </li><li> Nach 10-12 Tagen entfernen Sie die Gewebestücke, nehmen Sie den MSCs aus dem Kunststoff mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und sie auf neue Kulturgefäße. Je nach der Menge der Zellen in Ihrem Teller sollten Sie die Größe und Anzahl der neuen Flaschen entscheiden, niedrige Aussaatdichte für die weitere Expansion zu gewährleisten. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal in der Woche während der Expansion der Zellen. </li></ol> Durchflusszytometrie Benötigte Ausrüstung: Durchflusszytometer (BD FACSCalibur), Micronic Röhrchen (Corning), Rohrhalter, Schaf-Serum (Blockierungsreagenz), Eppifuge (Eppendorf), monoklonale Antikörper MSCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD73, CD90, CD105, Isotypkontrollen ECFCs: CD45, CD14, CD19, HLA-DR, CD31, CD34, CD90, CD105, CD144, CD146, Isotypkontrollen <ol><li> Nach Erreichen der Konfluenz, trennen Sie die Zelle mit 0,05% Trypsin/0.7 mM EDTA und Zentrifuge bei 300g für 7 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Zellen in einer Konzentration von 1x10 6 Zellen / ml in modifizierter PBS und blockieren unspezifische Bindung des Antikörpers mit 10% v / v Schafserum für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Beschriften Sie die Micronic Röhrchen und fügen Sie die entsprechende Konzentration der fluoreszenzmarkierten Antikörpern. </li><li> Dann werden 50 ul Zellsuspension (gesperrt) in jedes Röhrchen pipettieren und 30 min bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von modifizierten PBS, um nicht-bindende Antikörper zu entfernen. </li><li> Gehen Sie mit Ihrem markierten Zelle auf die Durchflusszytometer und führen Sie die Analyse. </li></ol> Teil 4: ECFC Koloniewachstum, Fixierung, Färbung und Hierarchie-Analyse <ol><li> Seed das praktisch reine geerntet ECFCs bei sehr niedrigen Plattierungsdichte von 3 oder 10 Zellen pro Quadratzentimeter in Zellkultur-Platten für einzelne Kolonie Wachstum zu ermöglichen. </li><li> Börse ein Drittel des Mediums zweimal pro Woche. </li><li> Nach 14 Tagen (Ende der Kultur) zu entfernen Medium, zweimal waschen mit PBS und fixieren den Kolonien mit eiskaltem Fixierung Lösung (Aceton: Methanol = 3: 2) für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen. </li><li> Entsorgen Sie die Fixierung Lösung und lassen die Platten offen für 10 Minuten trocknen lassen. </li><li> Rehydrieren die Zellen mit destilliertem Wasser für 10 Minuten. </li><li> Add Harris Hämatoxylin-Lösung und färben die feste Kolonien für 12 Minuten. </li><li> Entfernen H matoxylin und spülen Sie die Platten mit Leitungswasser, um loszuwerden, die restlichen Färbelösung. </li><li> Machen Sie Fotos von jeder Kolonie vonmit einem Stereomikroskop und Import *. jpg oder *. tif-Format-Dateien auf Ihrem Computer. </li><li> Öffnen Sie die Fotos mit ImageJ-Software und zu analysieren, die genaue Zellzahl jeder Kolonie wie in der Animation beschrieben. </li><li> Öffnen Sie die ImageJ-Software und importieren Sie eine Kolonie Bild mit dem &quot;File \ Open&quot;-Funktion in dem Pulldown-Menü. </li><li> Fahren Sie mit dem &quot;Process \ Subtract Background&quot;-Funktion </li><li> Verwenden Sie die &#39;* * elliptische oder Pinsel Auswahl &quot;-Funktion in der ImageJ Menü, um die Kolonie-Marge zu markieren. </li><li> Deaktivieren Sie das umgebende Bild mit dem &quot;Bearbeiten \ Klare Outside&quot;-Funktion und beschneiden Sie das Bild, indem Sie &#39;Bild \ Crop&#39;. </li><li> Stellen Sie die Schwelle manuell mit Hilfe der &#39;Bild \ Stellen \ Threshold &quot;-Funktion, so dass alle Zellen vollständig sind rot gefärbt. </li><li> Zählen Sie die Zellzahl der Kolonie, indem Sie &#39;Analyze \ Analyze Particles &quot;. Wählen Sie die entsprechenden Einstellungen (optimiert für jeden Zelltyp) und wählen Sie &#39;OK&#39;. Die Ergebnisse Box, einschließlich Zellzahl und ein neues Bild mit den entsprechenden Konturen der gezählten Zellen erscheint. <img src="/files/ftp_upload/1525/1525op2.jpg" alt="Abbildung 1" /></li></ol>

<ol>
	<li>Schallmoser, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+lysate+can+replace+fetal+bovine+serum+for+clinical-scale+expansion+of+functional+mesenchymal+stromal+cells.">Human platelet lysate can replace fetal bovine serum for clinical-scale expansion of functional mesenchymal stromal cells.</a> Transfusion. 47, 1436-1446 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+system+to+propagate+cord+blood-derived+multipotent+mesenchymal+stromal+cells+for+clinical+application.">Humanized system to propagate cord blood-derived multipotent mesenchymal stromal cells for clinical application.</a> Regen Med. 2, 371-382 (2007).</li><li>Reinisch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+large-scale+expanded+endothelial+colony-forming+cells+function+in+vitro+and+in+vivo.">Humanized large-scale expanded endothelial colony-forming cells function in vitro and in vivo.</a> Blood. 113, 6716-6725 (2009).</li><li>Strunk, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+preclinical+production+of+human+lineage-negative+cells+for+regenerative+stem+cell+therapy.">Phenotypic characterization and preclinical production of human lineage-negative cells for regenerative stem cell therapy.</a> Transfusion. 45, 315-326 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben keine finanziellen Interessenkonflikte zu erklären.

Es gibt eine Vielzahl von Quellen, aus denen MSCs oder ECFCs einschließlich Knochenmark, Fettgewebe, Nabelschnurblut, etc. zu bekommen, um Es ist notwendig, um beide Arten von Vorläuferzellen aus der gleichen Quelle direkt miteinander zu vergleichen die Beteiligung der verschiedenen Zelltypen in Prozesse wie Gewebe-und Gefäß Regeneration oder Beitrag zur Tumorprogression. Die Leichtigkeit, mit der zu isolieren und anschließend studieren autologen Paare ECFCs...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>alpha modified MEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-GLutamin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Penicillin/Streptomycin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EBM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Single cytokine quots</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lonza</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>75 cm2 flasks</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>150 cm2 plates</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cell scraper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin/EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monoclonal antibodies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Becton Dickenson</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>50 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>500 mL filter 20 &mu;m pore size </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Preservative free heparin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biochrom</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (mscs) and endothelial colony forming progenitor cells (ecfcs)

Die Nabelschnur ist eine reiche Quelle für Stammzellen mit hoher proliferative Potenzial, einschließlich mesenchymale Stromazellen (auch als mesenchymale Stammzellen, MSCs) und Endothelzellen koloniebildenden Progenitorzellen (ECFCs). Beide Zelltypen sind wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der Integrität des Gewebes und sind wahrscheinlich auch in regenerative Prozesse und Tumorbildung beteiligt. Zur Untersuchung ihrer Biologie und Funktion in einer vergleichenden Weise ist es wichtig, beide Zelltypen Verfügung vom gleichen Spender haben. Es kann auch nützlich sein für regenerative Zwecke abzuleiten MSCs und ECFCs aus dem gleichen Gewebe. Da zelluläre Therapeutika schließlich finden sollten ihren Weg vom Labor zum Krankenbett haben wir eine neue Methode zur Isolierung und weiter ausbauen Vorläuferzellen ohne die Verwendung von tierischem Eiweiß. Pooled menschlichen Thrombozyten-Lysat (PHPL) ersetzt Rinderfötenserum in alle Schritte unseres Protokolls vollständig vermeiden Sie den Kontakt der Zellen an xenogenen Proteinen. Dieses Video zeigt eine Methodik für die Isolierung und Expansion von Vorläuferzellen aus einer Nabelschnur. Alle Materialien und Verfahren beschrieben werden.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Isolation und tierisches Serum Freie Expansion der menschlichen Nabelschnur Derived mesenchymale Stromazellen (MSCs) und Endothelial Colony Forming Progenitorzellen (ECFCs)

The umbilical cord is a rich source for progenitor cells with high proliferative potential including mesenchymal stromal cells (also termed mesenchymal ...

isolation-animal-serum-free-expansion-human-umbilical-cord-derived

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells (ECFCs)

15.4K Aufrufe.  Medical University of Graz, Austria. Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung und anschließende Expansion von mesenchymalen Stromazellen und Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen, ohne die Verwendung von tierischen Serum autologen Paare für experimentelle Zwecke der Transplantation zu generieren.

Serie: Isolation and Animal Serum Free Expansion of Human Umbilical Cord Derived Mesenchymal Stromal Cells MSCs and Endothelial Colony Forming Progenitor Cells ECFCs

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and Separation of Single-colony Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and can be easily separated from the hematopoietic stem cells (HSCs) due to their plastic adherence. This protocol describes how to isolate MSCs from rat femurs and tibias. The isolated cells were further enriched against two MSCs surface markers CD54 and CD90 by magnetic cell sorting. Expression of surface markers CD54 and CD90 were then confirmed by flow cytometry analysis. HSC marker CD45 was also included to check if the sorted MSCs were depleted of HSCs. MSCs are naturally quite heterogeneous. There are subpopulations of cells that have different shapes, proliferation and differentiation abilities. These subpopulations all express the known MSCs markers and no unique marker has yet been identified for the different subpopulations. Therefore, an alternative approach to separate out the different subpopulations is using cloning cylinders to separate out single-colony derived cells. The cells derived from the single-colonies can then be cultured and evaluated separately.

Isolation and Enrichment of Rat Mesenchymal Stem Cells MSCs and Separation of Single-colony Derived MSCs

Rat MSCs were isolated from femurs and tibias and then enriched by magnetic cell sorting. Sorted cells were confirmed for the expression of surface markers by flow cytometry. These cells were also cultured at clonal density to form single colonies and then these colonies were separated by cloning cylinders.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

MSCs are a population of adult stem cells that is a promising source for therapeutic applications. These cells can be isolated from the bone marrow and ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Phenotypic and Functional Characterization of Endothelial Colony Forming Cells Derived from Human Umbilical Cord Blood

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of circulating endothelial progenitor cells (EPCs) were first identified in adult human peripheral blood by Asahara et al. in 1997 2 bringing an infusion of new hypotheses and strategies for vascular regeneration and repair. EPCs are rare but normal components of circulating blood that home to sites of blood vessel formation or vascular remodeling, and facilitate either postnatal vasculogenesis, angiogenesis, or arteriogenesis largely via paracrine stimulation of existing vessel wall derived cells3. No specific marker to identify an EPC has been identified, and at present the state of the field is to understand that numerous cell types including proangiogenic hematopoietic stem and progenitor cells, circulating angiogenic cells, Tie2+ monocytes, myeloid progenitor cells, tumor associated macrophages, and M2 activated macrophages participate in stimulating the angiogenic process in a variety of preclinical animal model systems and in human subjects in numerous disease states4, 5. Endothelial colony forming cells (ECFCs) are rare circulating viable endothelial cells characterized by robust clonal proliferative potential, secondary and tertiary colony forming ability upon replating, and ability to form intrinsic in vivo vessels upon transplantation into immunodeficient mice6-8. While ECFCs have been successfully isolated from the peripheral blood of healthy adult subjects, umbilical cord blood (CB) of healthy newborn infants, and vessel wall of numerous human arterial and venous vessels 6-9, CB possesses the highest frequency of ECFCs7 that display the most robust clonal proliferative potential and form durable and functional blood vessels in vivo8, 10-13. While the derivation of ECFC from adult peripheral blood has been presented14, 15, here we describe the methodologies for the derivation, cloning, expansion, and in vitro as well as in vivo characterization of ECFCs from the human umbilical CB.

Endothelial colony forming cells (ECFCs) are circulating endothelial cells with robust clonal proliferative potential that display intrinsic in vivo vessel forming ability. Phenotypic and functional characterization of outgrowth endothelial cells derived from CB are important to identify and isolate bona fide ECFCs for potential clinical application in repairing damaged tissues.

Phänotypische und funktionelle Charakterisierung von Endothelial Kolonie-bildenden Zellen aus humanem Nabelschnurblut

Longstanding views of new blood vessel formation via angiogenesis, vasculogenesis, and arteriogenesis have been recently reviewed1. The presence of ...

Isolation and Differentiation of Stromal Vascular Cells to Beige/Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat. Development of UCP1-positive brown adipocytes in white adipose tissues (so called beige or brite cells) is highly induced by a variety of environmental cues such as chronic cold exposure or by PPAR&gamma; agonists, therefore, this cell type has potential as a therapeutic target for obesity treatment. Although most immortalized adipocyte lines cannot recapitulate the process of "browning" of white fat in culture, primary adipocytes isolated from stromal vascular fraction in subcutaneous white adipose tissue (WAT) provide a reliable cellular system to study the molecular control of beige/brite cell development. Here we describe a protocol for effective isolation of primary preadipocytes and for inducing differentiation to beige/brite cells in culture. The browning effect can be assessed by the expression of brown fat-selective markers such as UCP1.

Primary white preadipocytes isolated from white adipose tissues in mice can be differentiated into beige/brite cells. Presented here is a reliable cellular model system to study the molecular regulation of "browning" of white fat.

Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells

Brown adipocytes have the ability to uncouple the  respiratory chain in mitochondria and dissipate chemical energy as heat.  Development of UCP1-positive ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides the use of bone marrow and umbilical cord MSCs for exogenous cell therapy, there is also increasing interest in the repair and regenerative potential of resident tissue MSCs. Moreover, they likely have a role in normal organ development, and have been attributed roles in disease, particularly those with a fibrotic nature. The main hurdle for the study of these resident tissue MSCs is the lack of a clear marker for the isolation and identification of these cells. The isolation technique described here applies multiple characteristics of lung resident MSCs (L-MSCs). Upon sacrifice of the rats, lungs are removed and rinsed multiple times to remove blood. Following mechanical dissociation by scalpel, the lungs are digested for 2-3 hr using a mix of collagenase type I, neutral protease and DNase type I. The obtained single cell suspension is subsequently washed and layered over density gradient medium (density 1.073 g/ml). After centrifugation, cells from the interphase are washed and plated in culture-treated flasks. Cells are cultured for 4-7 days in physiological 5% O2, 5% CO2 conditions. To deplete fibroblasts (CD146-) and to ensure a population of only L-MSCs (CD146+), positive selection for CD146+ cells is performed through magnetic bead selection. In summary, this procedure reliably produces a population of primary L-MSCs for further in vitro study and manipulation. Because of the nature of the protocol, it can easily be translated to other experimental animal models.

Isolation of CD146+ Resident Lung Mesenchymal Stromal Cells from Rat Lungs

This protocol describes an isolation technique for obtaining primary lung resident mesenchymal stromal cells from rats, through the use of enzymatic digestion, density gradient separation, plastic adherence and CD146+ magnetic bead selection.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Mesenchymal stromal cells (MSCs) are increasingly recognized for their therapeutic potential in a wide range of diseases, including lung diseases. Besides ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...