Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die molekularen und zellulären Veränderungen zu untersuchen, die während der normalen myeloischen Differenzierung von humanen CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen auftreten. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass es die Differenzierung von CD34-positiven Zellen entlang aller vier myeloischen Linien einschließlich Megakaryozyten, Erythrozyten, Granulozyten und Monozyten ermöglicht. Demonstriert wird das Verfahren aditi Bapat, ein Post-Doc aus meinem Labor.
Zur mononukleären Zellisolierung aus einer menschlichen Nabelschnurblutprobe sterilisieren Sie die Außenfläche eines Beutels nabel schnurblut mit 70 % Ethanol, bevor Sie den Beutelinhalt in eine sterile 250 Milliliter Plastikflasche innerhalb eines biologischen Sicherheitsschranks übertragen. Verdünnen Sie das Blut mit einem gleichen Volumen der Raumtemperatur Hanks gepufferte Saline-Lösung, und fügen Sie 15 Milliliter mononukleäre Zellfraktionierung Medium zu jeder von fünf sterilen 50 Milliliter konischen Röhren. Gießen Sie nach sanftem Mischen vorsichtig 30 Milliliter des verdünnten Nabelschnurblutes auf das mononukleare Fraktionierungsmedium in jedem Rohr, wobei die 50 Milliliter-Röhren in einem Winkel gehalten werden, um das Mischen der Schichten zu vermeiden.
Trennen Sie die Zellen durch Dichtegradientenzentrifugation, und entfernen Sie die oberen 15 bis 20 Milliliter Plasma über der mononukleären Zellschicht. Verwenden Sie eine Pipette, um die exponierte mononukleäre Zellschicht sorgfältig in ein neues 50-Milliliter-Rohr zu übertragen, wobei die mononukleären Zellen von zwei bis drei Röhren zusammengepoolt werden, und bringen Sie das Endvolumen in jedem Rohr bis zu 50 Milliliter mit kaltem PBE-Puffer. Pellet die mononukleären Zellproben durch Zentrifugation, und aspirieren die Überstand.
Tippen Sie vorsichtig auf jedes Rohr, um die Zellpellets zu lockern, und verdünnen Sie die Pellets in fünf Milliliter eiskalten PBE-Puffer. Kombinieren Sie die Zellen von drei bis vier Röhren zu einem 50 Milliliter konischen Rohr und waschen Sie alle Rohre mit fünf Millilitern frischen PBE-Puffer, um alle verbleibenden Zellen zu sammeln. Nach dem Zählen das Endvolumen in die Röhre bis zu 50 Milliliter mit frischem eiskaltem PBE-Puffer bringen und die Zellen per Zentrifugation sammeln.
Um die CD34-positiven mononukleären Zellen zu isolieren, setzen Sie das Pellet in 50 Milliliter n. PBE-Puffer wieder auf, bevor Sie die Zellen mit einer weiteren Zentrifugation sammeln. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, tippen Sie vorsichtig, um das Pellet zu lösen, und setzen Sie die Zellen einmal 10 zu den acht mononukleären Zellen pro 300 Mikroliter eiskalter PBE-Pufferkonzentration wieder auf. Blockieren Sie jede unspezifische Bindung mit 100 Mikroliter fc-Rezeptor-BlockierungReagenz, mischen Sie vorsichtig, und fügen Sie dann 100 Mikroliter CD34 Mikroperlen aus einem magnetisch aktivierten Zell-Sortierung menschlichen CD34 Mikroperlen-Kit pro mal 10 zu den acht Zellen mit sanfter Mischung, und inkubieren die Zellen für 30 Minuten bei vier Grad Celsius.
Während die Zellen inkubieren, legen Sie eine LS-Säule und einen Vortrennfilter in ein MACS-Trennfeld. Die Säule mit zwei Millilitern eiskalten PBE-Puffer und dem Vortrennfilter mit einem Milliliter Puffer ausstatten. Lassen Sie die Spalte in ein 15 Milliliter konisches Rohr entleeren und den Durchfluss entsorgen.
Am Ende der Inkubation das Endvolumen der mononukleären Zellprobe bis zu 15 Milliliter mit frischem eiskaltem PBE-Puffer bringen und die Zellen durch Zentrifugation sedimentieren. Setzen Sie das Pellet in einem Milliliter eiskalten PBE-Puffer wieder auf und laden Sie die Zellen auf den Vortrennfilter auf der Säule. Spülen Sie das Rohr mit drei Millilitern frischer eiskalter PBE-Puffer und fügen Sie den Puffer dem Vortrennfilter hinzu.
Waschen Sie die Säule viermal mit einem zusätzlichen drei Milliliter eiskalten PBE-Puffer pro Wäsche ohne Filter, so dass die Säule zwischen jedem Waschen vollständig abfließen kann. Nach der letzten Wäsche die Säule in ein neues 15-Milliliter-Rohr bewegen und fünf Milliliter frische eiskalte PBE durch die Säule in die Röhre stürzen. Um die Fraktionen von Stamm- und Vorläuferpopulationen in den frisch isolierten CD34-positiven hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu bestimmen, sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation und setzen Sie das Pellet um ein mal 10 bis zu den sechs Zellen pro 50 Mikroliter Durchflusszytometriepufferkonzentration wieder auf.
Als nächstes übertragen Sie die Zellen in 50 Mikroliter Aliquots pro fünf Milliliter Fluoreszenz aktivierte Zellsortierröhre nach dem experimentellen Durchflusszytometrie-Färbungsprotokoll. Fügen Sie den entsprechenden Antikörpercocktail und lebende/tote Färbung zu den Zellen hinzu, indem Sie das Volumen auf 100 Mikroliter insgesamt einstellen. Nach 20 Minuten im Dunkeln vor Licht geschützt, waschen Sie die Zellen mit einem Milliliter frischer Durchflusszytometriepuffer pro Rohr, und setzen Sie die Zellen in 500 Mikroliter Frischflusszytometriepuffer pro Tube wieder auf.
Analysieren Sie dann die Zellen auf einem Durchflusszytometer nach standardzytometrischen Standardprotokollen. Um die mikroperlenisolierten CD34-positiven Stamm- und Vorläuferzellen in myeloische Abstammungszellen zu differenzieren, beschichten Sie zunächst die Brunnen einer sterilen, unbeschichteten 48-Well-Platte mit 200 Mikrolitern pro Brunnen rekombinanter humaner Fibronectinlösung in PBS für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Am Ende der Inkubation die Fibronectin-Lösung aus jedem Brunnen entsorgen und die Brunnen mit 200 Mikrolitern 2%Rinderserumalbumin blockieren.
Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur die Brunnen zweimal mit 500 Mikrolitern sterilem PBS pro Waschgang waschen. Setzen Sie die frisch isolierten CD34-positiven Zellen bei fünf mal 10 der fünf Zellen pro Milliliter warmer Stimulationsmediumkonzentration wieder auf. Als nächstes säen Sie 200 Mikroliter Zellen in jeden Brunnen der Fibronectin-Fragment beschichteten Platte und legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator für 48 Stunden.
Am Ende der Inkubation sammeln Sie die Zellen mit sanfter Pipettierung und waschen Sie die Brunnen mit 500 Mikrolitern des modifizierten Dulbecco-modifizierten Eagle-Mediums, wobei die Waschungen mit der Zellsuspension gebündelt werden. Nach dem Zählen, setzen Sie die Zellen bei einer 2,5 mal 10 zu den vier Zellen pro milliliter myeloiden Differenzierung mittlere Konzentration. Schicht 200 Mikroliter CD34-positive Zellen pro Brunnen in einer MS-5-Stromzelle gesät 48 Brunnengewebe Kulturplatte.
Dann legen Sie die Platte in den Zellkultur-Inkubator und ersetzen Sie sanft 100 Mikroliter des Überstandes in jedem Brunnen durch 100 Mikroliter frisches 2X Myeloid-Differenzierungsmedium alle drei bis vier Tage. Ernten Sie am 21. Tag die Zellen zur Analyse des myeloischen Linienmarker-Ausdrucks durch Durchflusszytometrie, wie gerade gezeigt. Der typische Prozentsatz der gesamten CD34-positiven Zellen, die durch Mikroperlentrennung aus Nabelschnurblut isoliert wurden, liegt zwischen 80 und 90% Immunophenotypic-Analyse und zeigt, dass diese CD34-positiven Zellen typischerweise aus einer etwa 20%igen negativen CD34-positiven CD34-positiven cd38-positiven hämatopoetischen Stammzellpopulation und einer 72%igen negativen CD34-positiven CD34-positiven CD38-positiven CD34-positiven CD34-positiven CD34-positiven Cd38-positiven Cd38-positiven Cd38-positiven Progenitor-Zellpopulation bestehen.
Innerhalb der multipotenten Vorläuferzellpopulation exprimieren etwa 25% der Zellen gemeinsame myeloische Vorläufermarker, etwa 15% Granulozytenmonozyten-Vorläufermarker und etwa 56% Megakaryozyten-Erythroid-Vorläufermarker. Die Immunophenotypisierung zeigt auch, dass der Anteil der CD34-positiven Zellen von etwa 90 % bei Isolation auf weniger als 25 % am 21. Tag sinkt. Die Analyse der CD34-Negativpopulation zeigt einen gleichzeitigen Anstieg des Prozentsatzes der Zellen, die reife myeloische Abstammungsmarker exdrücken.
Darüber hinaus zeigen Die gefärbten Wright-Giemsa-Zellen an den Tagen eins und 21 unterschiedliche morphologische Eigenschaften, wobei die undifferenzierten Kulturen große, runde Kerne und sehr wenig Zytoplasma aufweisen und die differenzierten Kulturen morphologische Eigenschaften von Linienzellen aufweisen, einschließlich der Monozyten, Granulozyten und Erythroblasten. Denken Sie daran, das verdünnte Nabelschnurblut auf das mononukleäre Zellfraktionierungsmedium zu gießen, ohne die Schichten zu mischen, und stören Sie die MS-5- und CD34-positiven Zellen nicht, wenn Sie das Medium wechseln. Nach diesem Differenzierungsprotokoll können die CD34-positiven Zellkulturen auf morphologische Veränderungen, apoptotische Effekte, Veränderungen der Zellzyklusmuster und den Grad der Differenzierung analysiert werden.
