Die Radiokennzeichnung carbon-11 ermöglicht die Verwendung kleiner Verbindungen für die Positronenemissionstomographie oder PET, ohne das Molekül zu verändern. Dies ist wichtig für die Untersuchung der Rezeptor-Expressionsspiegel. Der Vorteil der Carbon-11-Radiolabeling ist, dass wir PET verwenden können, um die Bindungskinetik von SNAP direkt auf den Melanin-konzentrierenden Hormonrezeptor in Echtzeit zu bewerten.
SNAP als Melanin-konzentrierender Hormonrezeptor-Antagonist wird zu einem besseren Verständnis dieses Rezeptors und seiner Assoziation mit stoffwechselmetabolischen Bedingungen wie Fettleibigkeit und Diabetes beitragen. Efflux-Transporter, die an der Blut-Hirn-Schranke ausgedrückt werden, können die Verwendung von Radiopharmaka für die Bildgebung zentraler Rezeptorexpression erheblich behindern. Daher ist es wichtig, Spuren in vitro zu bewerten.
Die automatisierte Radiosynthese von SNAP ist weitgehend auf radioaktiv markierte niedermolekulare Verbindungen mit einer leicht zu bewertten Methylgruppe anwendbar. Einmal etabliert, kann dieses Verfahren für andere Verbindungen angepasst werden. Mit dabei sind die Senior-Doktoranden Sarah Pfaff und Theresa Balber.
Um mit der Carbon-11 SNAP-Synthese zu beginnen, richten Sie ein sauberes automatisiertes Synthesemodul für Kohlenstoff-11 mit den entsprechenden Reagenzien und Materialien ein. Starten Sie den SNAP-Syntheseprozess auf dem Modulcomputer, der mit Systemprüfungen und Konditionierung beginnt. Etwa 30 bis 40 Minuten, bevor das Modul für die C-11-Lieferung bereit ist, wählen Sie das C-11-Kohlendioxidziel auf dem Zyklotron aus und starten Sie den Strahl bei 65 Mikroamperen.
Sobald das Modul lieferbereit ist, schließen Sie das Innenfenster und die Außentür. Bestätigen Sie, dass die CO2-Falle auf mindestens 40 Grad Celsius abgekühlt ist und dass die Methanfalle mit der Kühlung begonnen hat. Sobald das Zyklotron etwa 120 Gigabecquerel C-11 CO2 produziert hat, klicken Sie in der Modulsoftware auf OK, um den Weg vom Ziel durch die CO2-Falle zu öffnen.
Am Cyclotron-Computer beginnen C-11 CO2 an das Modul zu liefern. Überwachen Sie die Aktivitätsübertragung am Modulcomputer und stellen Sie sicher, dass sie nach drei Minuten zur Reduktion von CO2 auf Methan führt. Überwachen Sie den Prozess, da das entstehende Methan in die Methanfalle gespült und durch Zirkulation durch den Jodofen in Methyljodid umgewandelt wird.
Warten Sie am Ende der Umwandlungssequenz, wie Nebenprodukte aus der Methyljodidfalle gespült werden, um auszupuffen, und bestätigen Sie dann, dass der Reaktor bereit ist, Aktivität zu empfangen, indem Sie auf OK klicken. Überwachen Sie das System, während das Methyljodid aus der Falle freigesetzt, durch den Methyltriflate-Ofen gespült und im Reaktor eingeschlossen wird. Wenn die Aktivität in den Reaktorplateaus bestätigt, dass das Fangen abgeschlossen ist. Warten Sie, während die Reaktionsmischung bei 75 Grad Celsius für drei Minuten reagiert.
Überwachen Sie dann das System, wenn das Reaktionsgemisch auf unter 35 Grad Celsius abgekühlt und mit 1,5 Milliliter Wasser abgeschreckt wird. Überwachen Sie das System, wenn das Reaktionsgemisch in die HPLC-Injektionsschleife geladen und in die halbvorbereitende HPLC-Säule injiziert wird. Beobachten Sie die UV- und Gammadetektorspuren, während die Chromatographie voranschreitet.
Wenn die Produktspitze manuell angezeigt wird, beginnen Sie mit dem Sammeln des Produkts im runden Bodensammelkolben im Modul. Manuelle End-Sammlung, wenn das Gamma-Signal unter etwa 400 Zählungen pro Sekunde fällt. Beobachten Sie den Flüssigkeitsstand im runden Bodenkolben, während das Produkt unter Heliumdruck auf eine Festphasen-Extraktionspatrone geladen wird.
Sobald der Kolben leer ist und die Flüssigkeit durch die SPE-Patrone gelangt ist, klicken Sie auf OK, um mit dem Waschen der auf der Patrone gefangenen Produkte zu beginnen. Überwachen Sie dann die Aktivität in der Produktsammelflasche, da das Produkt zuerst von der Patrone in die Durchstechflasche eluiert und dann mit 0,9% Saline-Lösung verdünnt wird. Beobachten Sie, wie die Produktlösung durch sterilen Filter unter Heliumdruck auf die Produktdurchstechflasche übertragen wird.
Wenn die Übertragung abgeschlossen ist, schließen Sie das Produktausgangsventil. Wenn der Radiotracer in der Produktdurchstechflasche ankommt, messen Sie den absoluten radioaktiven Ertrag. Dann verwenden Sie eine bleiabgeschirmte Spritze, um 100 Mikroliter des Tracers auf eine kleine Durchstechflasche zur Qualitätskontrolle zu übertragen.
Bringen Sie die Qualitätskontrollprobe in einen abgeschirmten Arbeitsbereich der Qualitätskontrolle. 40 Mikroliter der QC-Probe in eine gasdichte Spritze ziehen, in ein vorbereitetes HPLC-Instrument mit analytischer Säule laden und das Produkt injizieren. Führen Sie während des HPLC-Laufs weitere Qualitätskontrollmessungen durch.
Sobald der HPLC-Lauf abgeschlossen ist, integrieren Sie alle Spitzen im Chromatogramm des Radioaktivitätsdetektors, um festzustellen, ob die radiochemische Reinheit von SNAP größer als 95% ist. Integrieren Sie die Spitzen im UV-Chromatogramm, um die chemische Reinheit des Produkts zu bestimmen. Verwenden Sie den Bereich unter der UV-Produktspitze, um die spezifische Aktivität zu berechnen. Sobald das Produkt bestätigt wurde, um die Anforderungen für die Verwendung zu erfüllen, lassen Sie den Radio Tracer an das kinetische Echtzeit-Experimentlabor frei.
Mindestens 30 Minuten vor dem Experiment den vorbereiteten Wildtyp oder transfizierte Zellen mit DPBS waschen und zwei Milliliter serumfreies Wachstumsmedium hinzufügen. Um transfizierte Zellen zu blockieren, fügen Sie 0,98 Mikroliter einer 20,4 Millimolaren Lösung des racemischen Verapamilhydrochlorids in Dimethylsulfoxid hinzu. Inkubieren Sie die Zellen auf einer schrägen Ebene für 30 Minuten.
Schalten Sie dann das Echtzeit-Assay-Instrument und den zugehörigen Computer ein. Öffnen Sie die Steuerungssoftware und wählen Sie ein Ziel aus. Legen Sie die Anzahl der Positionen auf zwei, die Erkennungszeit auf drei Sekunden, die Erkennungsverzögerungszeit auf zwei Sekunden und den Namen der ersten Phase auf die Basislinie fest.
Setzen Sie die Zellkulturschale in die geneigte Unterstützung des Geräts mit dem Zellpol auf der Unterseite ein. Stellen Sie sicher, dass der Zellpol mit dem Zellkulturmedium bedeckt ist. Starten Sie eine 10-minütige Hintergrundmessung, und legen Sie den Dateinamen und den Pfad fest.
Stellen Sie die Zeitskala auf Minuten und die Nuklidsammlung auf Carbon-11 ein. Konfigurieren Sie das Diagramm so, dass die subtrahierten Zieldaten für Hintergrund, Ziel und Hintergrund angezeigt werden. Sobald der Radio-Tracer geliefert und für den Einsatz zugelassen wurde, nehmen Sie eine kleine Probe für den Test.
Berechnen Sie das benötigte Volumen der Radio-Tracer-Lösung und bereiten Sie eine Pipette vor. In der Instrumentensoftware halten Sie den Lauf an und warten Sie, bis die Tellerrotation beendet ist. Öffnen Sie den Deckel des Geräts, drehen Sie die Stütze um 90 Grad nach links, fügen Sie den Radiotracer mit der vorbereiteten Pipette hinzu und bringen Sie das Gerät in seine Ausgangsposition zurück.
Schließen Sie den Deckel des Geräts und setzen Sie das Experiment sofort fort. Lassen Sie das Experiment 20 Minuten lang laufen, bevor Sie es beenden. Verarbeiten und analysieren Sie die Daten, um die SNAP-Aufnahme in den Zellen auszuwerten.
Nun kann das Verfahren für die DMSO-behandelte Kontrollzellkulturschale und die Wildtyp-Zelllinie wiederholt werden. Echtzeit-kinetische Assays wurden mit Nicht-PGP-Exzessen wildtypisierter Zellen, PGP-exemitten Zellen, vorblockiert mit Verapamil als PGP-Hemmer und entsperrten PGP-Zellen durchgeführt. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen nicht behandelten Zellen und fahrzeugbehandelten Zellen beobachtet.
Carbon-11 SNAP akkumulierte sich schnell in Wildzellen, während keine Akkumulation in PGP-exemitten Zellen beobachtet wurde. Die Vorblockierung des PGP-Efflux-Transporters mit Verapamil führte zu einer SNAP-Akkumulation in den PGP-Zellen, die mit der von Wildzellen vergleichbar war. In Kombination mit kinetinen Echtzeitmessungen ermöglicht dieser Aufbau ein breites Verständnis der Pharmakokinetik von niedermolekularen Verbindungen und ist daher für die präklinische Entwicklung von Radiopharmazeutika von großer Bedeutung.
Timing und Organisation sind die Hauptbestandteile für eine erfolgreiche Kohlenstoff-11-Radiosynthese mit nachfolgenden kinetinen Echtzeitexperimenten, da die Halbwertszeit von Carbon-11 nur 20 Minuten beträgt. Aufgrund einer kurzen Halbwertszeit von Carbon-11 werden viele Teile dieses Verfahrens gleichzeitig durchgeführt. Es ist wichtig, dass alle Beteiligten den Umfang und den Zeitpunkt ihrer Rolle verstehen.
Sowohl die Produktsicherheit als auch der Strahlenschutz sind für die Herstellung von Radiopharmazeutika von entscheidender Bedeutung. Alle Experimente müssen dem so niedrigen wie vernünftigerweise erreichbaren oder ALARA-Prinzip folgen, um die Strahlenexposition des Bedieners zu begrenzen.
