Optische Methoden wie die Optogenetik können die präzise Modulation zellulärer molekularer Signale ermöglichen. Unser Protokoll zeigte eine orale optische Manipulation von zellulären Signalmolekularen durch Femtosekunden-Laserstimulation. Durch die Kopplung unseres Femtosekundenlasers in ein konfokales Mikroskop kann unsere Technik eine einzellige oder subzelluläre Operation durch Femtosekunden-Laserstimulation und die molekulardynamische Echtzeitüberwachung durch konfokale Mikroskopie ermöglichen.
Diese Methode kann auf alle fluoreszierenden Mikroskopiesysteme angewendet werden, indem ein Femtosekundenlaser auf die richtige Weise in das System gekoppelt wird. Für alle, die unsere Methode zum ersten Mal ausprobieren, folgen Sie bitte den separaten Anweisungen der Laseranlage oder suchen Sie Rat von Fachleuten beim Betrieb einer Labor femtosekunden Laserquelle. Schalten Sie zunächst den Femtosekundenlaser und das konfokale Mikroskop ein.
Verwenden Sie reflektierende Spiegel, um den Femtosekunden-Laserstrahl durch einen mechanischen Verschluss zu lenken. Als nächstes stellen Sie ein Relaisteleskop ein, das aus einem Linsenpaar besteht, um die Transmissionsstrahlbreite zu erweitern. Dies sollte mit der Hintertür des Ziels im Einklang stehen.
Steuern Sie nun die reflektierenden Spiegel, um den erweiterten Strahl in das Mikroskop auszurichten. Passen Sie die beiden reflektierenden Spiegel an, auf die hier hingewiesen wird, um den Fokus des Femtosekundenlasers auf die Mitte des Sichtfeldes abzustimmen. Schließlich messen und stimmen Sie die Laser, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben.
Kultur Hela Zellen mit Standard-Techniken. Wenn Sie bereit sind, das Experiment durchzuführen, transfezieren Sie die Zellen mit ERK2-GFP, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Schalten Sie als Nächstes das konfokale Laserscanning-Mikroskop und den Femtosekundenlaser ein.
Stellen Sie sicher, dass der Verschluss des Lasers geschlossen ist. Öffnen Sie dann die Mikroskopsoftware. Stellen Sie den Anregungslaser auf 488 Nanometer und seinen Leistungspegel auf 0,1 Milliwatt ein.
Legen Sie die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Intervallzeit jedes Pixels auf 2,4 Mikrosekunden fest. Legen Sie dann die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf sechs Sekunden fest, um Fotobleichungen und Fotoschäden an den Zellen zu minimieren. Stellen Sie außerdem die gesamten Bildgebungsrahmen auf rund 300 Frames ein, um in einem einzelnen Experiment etwa 30 Minuten kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen.
Nehmen Sie die Schale mit den mit ERK2-GFP transfizierten Hela-Zellen aus dem Inkubator und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe. Starten Sie in der Software den schnellen Scanmodus, und stimmen Sie das Ziel ein, um klare fluoreszierende Bilder der Zellen zu erfassen. Beenden Sie dann das schnelle Scannen und wechseln Sie mit der CCD-Kamera in den Hellfeld-Bildgebungsmodus.
Öffnen Sie den Verschluss und passen Sie den Abstand zwischen den beiden Linsen des Relaisteleskops an, um sicherzustellen, dass der Durchmesser des Femtosekunden-Laserfokus etwa zwei Mikrometer beträgt. Schließen Sie dann den Verschluss, um die Einstellung abzuschließen. Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15 bis 40 Milliwatt für einen 810-Nanometer-Laser oder 20 bis 60 Milliwatt für einen 1040-Nanometer-Laser ein.
Stellen Sie dann die Öffnungszeit des Verschlusses auf 05 auf 0,2 Sekunden ein. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um eine Zielzelle auszuwählen, die ERK2-GFP stark ausdrückt. Verschieben Sie die Bühne, um den Zytosolbereich der ausgewählten Zielzelle so zu lokalisieren, dass sie sich in der Mitte des Sichtfeldes befindet, wenn sie unter HellerFeld-Bildgebung steht.
Sobald Sie zentriert sind, klicken Sie auf den Startknopf, um mit der kontinuierlichen Bildgebung zu beginnen. Öffnen Sie den Verschluss zu jedem vordefinierten Zeitfenster, um die Femtosekunden-Laserstimulation in die Zielzelle zu liefern. Wenn der Bildgebungsprozess abgeschlossen ist, speichern Sie die Bildgebungsdaten zur weiteren Analyse.
Stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf 15 bis 40 Milliwatt und 810 Nanometer und 20 bis 60 Milliwatt und 1040 Nanometer an der Probe ein. Nehmen Sie dann die mit ERK2-GFP transfizierte Schale aus dem Inkubator und stellen Sie sie auf die Mikroskopstufe. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um die Zielzelle auszuwählen, die ERK2-GFP ausdrückt.
Legen Sie dann den konfokalen Bildgebungsprozess fest und definieren Sie einen speziellen Scanrahmen als Stimulationsrahmen im Bildprozess. Definieren Sie den Parameter des Stimulationsrahmens. Legen Sie einen Scanbereich von zwei mal zwei mal drei mal drei Quadratmikrometern im Cytosolbereich in der Nähe des Kerns in der Zielzelle fest.
Legen Sie die Gesamtscanzeit auf 0,1 bis 0,2 Sekunden fest. Legen Sie die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf sechs Sekunden fest, und legen Sie die gesamten Bildgebungsrahmen auf etwa 300 Frames fest, um etwa 30 Minuten kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen. Speichern Sie die Bilddaten für weitere Datenanalysen.
Synchronisieren Sie den Verschluss des Femtosekundenlasers mit dem des konfokalen Scannens entsprechend dem vordefinierten Fotostimulationsbereich, der nur geöffnet ist, wenn das Laserscannen in den Stimulationsrahmen fällt. Klicken Sie auf die Starttaste, um den kontinuierlichen Mikroskopie-Bildprozess zu starten. Um die mitochondriale morphologische Dynamik zu beobachten, transfetieren Sie Hela-Zellen mit Mito-GFP, um die Mitochondrien zu fluoreszierend anzugeben, oder eine Basis mit Mito-cpYFP zur Beobachtung von Mitoflashes.
Schalten Sie nach der Transfektion den Femtosekundenlaser ein und stellen Sie sicher, dass der Verschluss geschlossen ist. Schalten Sie dann das konfokale Laserscanning-Mikroskop ein. Stellen Sie den Anregungslaser auf 488 Nanometer ein.
Stellen Sie dann den Leistungspegel des 488-Nanometer-Lasers auf 0,1 Milliwatt ein. Legen Sie außerdem die Bildgröße auf 512 x 512 Pixel und die Gesamtbildzeit jedes Frames auf 2,2 Sekunden fest. Legen Sie dann die Intervallzeit zwischen zwei Frames auf null Sekunden und die gesamten Bildgebungsrahmen auf 200 Frames fest, um in einem einzelnen Experiment etwa 440 Sekunden kontinuierliche Mikroskopie bereitzustellen.
Nehmen Sie die Schale mit Zellen, die mit Mito GFP oder mitochondrial gezielt entrisiertes kreisförmiges, permutiertes gelbes Fluoreszenzprotein aus dem Inkubator transfiziert wurden, und stellen Sie die Schale auf die Mikroskopstufe. Überprüfen Sie den Status des Femtosekundenlasers, um sicherzustellen, dass sich der Fokus des Femtosekundenlasers in der Mitte des Sichtfeldes befindet. Legen Sie dann einen Referenzpfeil in der Mitte des fluoreszierenden Bildgebungsfensters fest, um die Position des Fokus anzuzeigen.
Als nächstes stellen Sie die Leistung des Femtosekundenlasers auf fünf bis 30 Milliwatt mit dem Laser auf 810 Nanometer und 10 bis 40 Milliwatt für den Laser auf 1040 Nanometer. Stellen Sie die Öffnungszeit des Verschlusses auf 05 bis 0,1 Sekunden ein. Verwenden Sie den schnellen Scanmodus, um die Zielzelle auszuwählen, die gut mito GFP exdrückt, oder das mitochondrial ausgerichtete kreisförmige permutierte gelbe Fluoreszenzprotein.
Wählen Sie ein Mitochondrion nach dem Zufallsprinzip in der Zielzelle als Versuchsgegenstand aus. Als nächstes bewegen Sie die Mikroskopstufe, um die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels in der Mitte des Sichtfeldes durch einen schnellen Scanmodus zu lokalisieren, wie durch den Referenzpfeil angegeben. Klicken Sie auf die Startschaltfläche, um die kontinuierliche Bildgebung zu starten.
Öffnen Sie schließlich den Verschluss zu jeder vordefinierten Zeit, um die Femtosekunden-Laserstimulation in die mitochondriale Röhrenstruktur des Ziels zu liefern. Warten Sie, bis der Imaging-Prozess abgeschlossen ist, und speichern Sie dann die Bildgebungsdaten für weitere Datenanalysen. Mit der in diesem Protokoll vorgestellten Methode transloziert ERK2 in den Kern, nachdem es mit einem kurzen Blitz des Femtosekundenlasers behandelt wurde.
DIE ERK2-GFP-Fluoreszenz erreicht nach einigen Minuten Femtosekunden-Laserstimulation das Maximum. Die ERK2-Moleküle werden nach aktivierung nachgeschalteter Substrate im Zellkern dephosphoryliert und dann kommt das ERK2 zum Zytoplasma zurück, das durch eine Abnahme der kernnuklearen GFP-Fluoreszenz angezeigt wird. ERK2 kann mehrfach durch mehrere Fotostimulationen aktiviert werden.
Daher ist es möglich, das ERK2-Signalmuster präzise zu manipulieren, indem die Intervallzeit zwischen mehreren Reizen gesteuert wird. Darüber hinaus kann ERK2 gelegentlich in benachbarten Zellen um die stimulierte Zelle aktiviert werden. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass einige diffusible Moleküle von der zelle freigesetzt werden können, die mit dem Femtosekundenlaser behandelt wird, um ERK2 in den angrenzenden Zellen zu aktivieren.
Die Phosphorylierung des ERK2-nachgeschalteten Proteins eIF4E kann durch Immunfluoreszenzmikroskopie individuell bestätigt werden. Dieses Ergebnis zeigt an, dass die Femtosekunden-Laserstimulation den ERK-Signalweg erfolgreich aktivieren kann. Mitochondriale oxidative Blitze oder Mitoflashes sind oxidative Ausbrüche in Mitochondrien, die aus der komplexen molekularen Dynamik wurzeln.
Die Implementierung dieses Fotostimulationsschemas führte zu einer erfolgreichen Mitoflash-Erregung. Diese Fotostimulation zeigt auch Varianten der mitochondrialen Molekulardynamik, einschließlich Fragmentierung und Wiederherstellung der mitochondrialen Morphologie sowie Oszillation des mitochondrialen Membranpotentials. Ähnlich wie bei fotoaktivierten Mitoflashes weisen diese Mitochondrien-Ereignisse unterschiedliche Leistungen mit unterschiedlichen Leistungsintensitäten auf.
Das Wichtigste ist, dass der Fokus, die Größe und die Präzision des Femtosekundenlasers eine Eigenschaft für die Stimulation in Zellen ist. Der Nahinfrarot-Femtosekundenlaser kann für Benutzer gefährlich sein. Wenn Sie diesem Protokoll folgen, tragen Sie den richtigen Schutz und verhindern, dass sich der Laser vom optischen Tisch austauft.
