Die Autoren bedanken sich bei Dr. danken. Heping Cheng, Huiliang Zhang und Stephen Kolwicz für ihre hilfreichen Kommentare und technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Methode. Diese Studie wurde vom NIH Zuschüsse und der Entwicklung Scientist Grant von der American Heart Association WW unterstützt.

1. Experiment Vorbereitung <ol><li> Bereiten Sie die isotonische balancierte Salzlösung (50 ml), enthaltend 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,2) für die in vivo-Bildgebung Skelettmuskel. </li><li> Herstellung von 1 l Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) enthält: 118 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 0,5 mM EDTA und 25 mM NaHCO3. </li><li> Blasen die KHB mit Gas, das 95% O 2/5% CO &amp;sub2; für 10-15 min vor der Zugabe von 2 mM CaCl 2. In metabolischen Substrate (z. B. 10 mM Glucose und 0,5 mM Pyruvat). </li><li> Vorbereitung der chirurgischen Instrumente durch Sterilisieren der Klemme, Scheren und Pinzetten in 70% Ethanol und anschließendes Spülen in sterilisiertem ddH 2 O. </li><li> Schalten Sie den Herzdurchblutung System, stellen Sie die Temperatur auf dem Wasserbad und Thermostaten, die Geschwindigkeit der Schlauchpumpe bis 6 ml / min. </li><li> Blase der KHB mit 95% O 2/ 5% CO 2-Gases und die Durchflussrate und Temperatur (37 ° C, durch eine faseroptische Temperatursonde) des Abwassers zu überwachen. Das System benötigt etwa 20 Minuten für Gas-und Temperaturausgleich. </li></ol> 2. Die konfokale Bildgebung der Skelettmuskulatur In Vivo <ol><li> Maus anästhesiert mit Pentobarbital (80 mg / kg, ip). Das Tier wird chirurgische Anästhesie (keine Reaktion auf Zehenklemm) innerhalb von 10-15 min erreicht und bleibt in diesem Zustand für 1-1,5 h, ausreichend für die in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln. </li><li> Haare entfernen auf einem der Hinterbeine und Sterilisieren der Haut mit 70% Ethanol. </li><li> Einen Einschnitt auf der Haut entlang der Außenseite der Schenkel um die Wadenmuskeln freizulegen. </li><li> Nehmen Sie den Epimysium vorsichtig mit einem scharfen Zangen und einen Einschnitt durch sie mit einer Schere. Weitere sezieren, um die Epimysium entfernen und setzen die Muskelfasern unter ihm. </li><li> Für die in vivo Belastung der TMRM in die SkelettMuskel, gehören TMRM (500 nM) in der isotonischen Salzlösung ausgeglichen, um Muskeln für 30 Minuten eintauchen und dann waschen von Anzeige-freie Lösung. </li><li> Setzen Sie die Maus auf seiner Seite auf dem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM 510) Stufe und der hinteren Gliedmaßen in einer Position, die der freiliegenden Skelettmuskel zugewandt ist gegen das Deckglas, das den Boden der Kammer bildet, zurückhalten. Das Deckglas ist zwischen dem Muskelgewebe und dem invertierten Objektiv (40x Öl). </li><li> Drücken Sie das Bein leicht nach unten, um einen engen Kontakt zwischen dem Gewebe und dem Deckglas zu machen. Tauchen Sie die freiliegenden Muskeln in isotonischer Salzlösung ausgeglichen. </li><li> Datensatz zweidimensionale (2D, xy) konfokale Bilder mit einer Abtastrate von einer Sekunde pro Rahmen. Die Intensität jedes Pixels wird in 8-Bit-Auflösung digitalisiert. Normalerweise enthält eine serielle Scan 100 Bilder. </li><li> Sammeln aufeinanderfolgenden Bildern von aufregenden ersten bei 405 nm und Sammeln bei&gt; 505 nm dann bei 488 nm, während das Sammeln bei&gt; 505 nm für zwei Wellenlängen excitation Bild von mt-cpYFP. Verwenden sequentielle Anregung bei 405, 488 und 543 nm und Emission bei 505 bis 545 zu sammeln, 505-545 und&gt; 560 nm, jeweils für Dreifachanregungswellenlänge Bildgebung von mt-cpYFP und TMRM. </li></ol> 3. Die konfokale Bildgebung von perfundierten Maus Herz <ol><li> Unmittelbar nach der in vivo-Abbildung von Skelettmuskeln, injizieren die Maus mit 200 Einheiten Heparin (ip). Zehn Minuten später einschläfern der Maus durch Thorakotomie und schnell zu entfernen, die das Herz mit Lunge und Thymus attached to it. </li><li> Entfernen Sie schnell die Lunge in eiskaltem Puffer. Identifizieren Sie die Lappen des Thymus und vorsichtig abziehen, um den aufsteigenden Aorta aus. </li><li> Entfernen Sie den Thymus und isolieren die Aorta durch vorsichtiges Entfernen von umgebenden Gewebe. </li><li> Machen Sie einen Schnitt am oberen Ende der aufsteigenden Aorta vor dem ersten Zweig der Aortenbogen. </li><li> Halten Sie die Wand der Aorta vorsichtig mit zwei Mikronahtzange, um den Hohlraum freizulegen, und vorsichtig die Aorta auf die ca.nnula (PE50-Rohr). Die Aorta wird an Ort und Stelle mit einem Mikro-Gefäßklemme gehalten, während Nähte werden schnell um die Aorta verbunden. </li><li> Entfernen Sie die Klemme, sorgfältig zu prüfen, die Kanüle mit einer Pinzette, um sicherzustellen, dass die Spitze der Kanüle über Aortenwurzel ist. Zusätzliche Verbindungen werden nach Bedarf hinzugefügt, um das Herz in Position zu halten. </li><li> Schalten Sie die peristaltische Pumpe und Perfusion des Herzens bei 1 ml / min. Das Herz wird wieder schlagen auf Perfusion. </li><li> Stellen Sie die Position des Perfusionssystems legte das Herz auf dem Mikroskoptisch. Die Bühne hat einen Adapter, der Erwärmung der Kammer, die das Herz hält kann. </li><li> 1 ml KHB Perfusionslösung in der Kammer, um das Herz teilweise eintauchen. Überwachung der Temperatur der Kammer bei 37 ° C Entfernen Abfluß aus der Kammer unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe. </li><li> Erhöhen die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe allmählich auf eine ausreichende Strömung (ca. 2 ml / min), um das Herz zu liefern. </li><li> Nach 10 min Stabilisierung versorgen die HEArt mit 10 uM blebbistatin und 100-500 nM TMRM. Herzschlag wird nach 10 min zu verlangsamen. </li><li> Sanften Druck auf das Herz, um engen Kontakt des Herzens mit dem Deckglas auf dem Boden der Kammer zu gewährleisten und um weiter zu unterdrücken Herzschlag. </li><li> Verfahren Sie ebenso für die konfokale Bildgebung von intakten Herzmuskel, wie in Schritt 2.8 oben beschrieben. Die Brennebene sorgfältig anpassen, um das klarste Bild möglich zu offenbaren. </li></ol> 4. Bildverarbeitung und Datenanalyse <ol><li> Verwenden Sie Tools von der &quot;Physiologische Analysis&quot;-Modul des konfokalen Software, um Einzel mitochondriale Membranpotential Wallungen und Veränderungen zu analysieren ist. Dieses Modul ist häufig in der Bildaufnahme-Software des konfokalen Systems enthalten und ermöglicht die Bestimmung bestimmter Bildbereiche sowie Ausgangs der Fluoreszenzintensität mit der Zeit Etiketten. </li><li> Öffnen Sie die Datenbank und dann die Serien 2D-Image-Datei zu analysieren. </li><li> Klicken Sie auf die &quot;Regionof Interest (ROI) bedeuten Mittelwert von ROIs &quot;, um zum Schalter&quot; &quot;-Modus. Klicken Sie auf die&quot; Region of Interest (ROI) Mittelwert Mittelwert von ROIs &quot;-Modus&quot;, um zum Schalter. &quot; </li><li> Schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle außer dem Kanal der cpYFP 488 nm für die Auswahl der blinkt. </li><li> Zoom in das Bild und bewegen manuell Schieberegler, um die seriellen 2D-Bildern zu spielen. </li><li> Identifizieren Einzel mitochondrialen Superoxid blinkt durch Anordnen der Ort, an dem Fluoreszenzsignal steigt vorübergehend. Verwenden Sie den entsprechenden ROI-Tool, um die Blitze zu markieren. Die Spur, die zeitabhängige Fluoreszenzänderung jedes ROI zeigen sich neben dem Bild. </li><li> Nach der Auswahl aller blinkt, schalten Sie die Anzeige der anderen Kanäle. Wählen Sie eine ROI auf das Bild außerhalb der Zelle für die Hintergrundsignal Subtraktion. Ausgangs die durchschnittliche Fluoreszenz jedes ROI zusammen mit den Zeit Etiketten. </li><li> Notieren Sie die Anzahl der Blitze in jeder der seriellen Scan-Image-Datei zusammen mit der Scan-Zeit und Flächedie Zelle. Verwenden von Excel zum Blitzfrequenz als Anzahl der Blitze pro 100 sec / 1000 um 2 Zellfläche zu berechnen. </li><li> Verwenden Sie eine benutzerdefinierte entwickelte Programm in Interactive Data Language (IDL, ResearchSystems) geschrieben, um die Parameter der einzelnen Flash-(Amplitude, Zeit, Höhepunkt erreichen und Abfallzeit) zu berechnen. IDL-Software ist im Handel erhältlich und der speziell entwickelten Programm für Flash-Parameteranalyse können beim Autor angefordert werden. </li></ol>

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Cardiol. 50, 940-950 (2011).</li><li>Pasdois, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+diazoxide+on+flavoprotein+oxidation+and+reactive+oxygen+species+generation+during+ischemia-reperfusion:+a+study+on+Langendorff-perfused+rat+hearts+using+optic+fibers.">Effect of diazoxide on flavoprotein oxidation and reactive oxygen species generation during ischemia-reperfusion: a study on Langendorff-perfused rat hearts using optic fibers.</a> Am. J. Physiol. 294, H2088-H2097 (2008).</li><li>Granville, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+ischemia+and+reperfusion-induced+myocardial+damage+by+cytochrome+P450+inhibitors.">Reduction of ischemia and reperfusion-induced myocardial damage by cytochrome P450 inhibitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Imaging Einzel mitochondriale Ereignisse in lebenden Tier oder durchbluteten Organen hat erhebliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden für die mitochondriale Funktion Auswertung 17,19,21,22,24,25. Die hier beschriebene Technik kann Echtzeit-in-situ-Bestimmung der mitochondrialen Funktion in einem echten physiologischen Zustand auf subzellulärer Auflösung zu erreichen. Dies ist besonders nützlich, wenn sie mit anderen Messungen kombiniert werden, um systemisch Studium der Rolle von Mitoch...

Mitochondrien spielen eine zentrale Rolle in der Zell Bioenergetik, Radikal Signalisierung, Redox-Homöostase, Ionenregulation und Zellschicksal Bestimmung 1,2. Mitochondrien Dysfunktion oft begleitet und die Voraussetzung für die Entstehung von Krankheiten 6.3. Insbesondere in den Muskelsysteme wie Herz-und Skelettmuskulatur liefert mitochondrialen Atmung der meisten ATP rechtzeitige Regulierung der intrazellulären Calcium und robuste Kraftentwicklung 7,8 unterstützen. Diese Muskeln besitzen eine große Anzahl von Mitochondrien, die oft besetzen bis 20-40% des gesamten Zellvolumens und &quot;fixiert&quot; zwischen Myofilamenten 2. Trotz der zahlreichen Studien, das Verständnis der Regulation der mitochondrialen Funktion, insbesondere in vivo und unter physiologisch relevanten Bedingungen, begrenzt. Einer der Gründe ist, dass die Mehrheit der zur Auswertung der mitochondrialen Funktion entwickelten Methoden beruhen auf in vitro-oder ex vivo-Ansätze, wie die Überwachung des Sauerstoffverbrauchs von isolierten Mitochondrien mit künstlichen Substraten ergänzt, und die indirekte Bestimmung der mitochondrialen Funktion durch Morphologie (z. B. Elektronenmikroskopie), Enzymaktivität (z. B. Aconitaseaktivität) oder intrazellulären ATP-Spiegel 9-11 . Kürzlich, kleines Molekül Fluoreszenzindikatoren mit relativer mitochondrialen Bereicherung wurden angewendet, um einen Einblick in die mitochondriale Signale, einschließlich Membranpotential, Kalzium und reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), in intakten Zellen 11-13 bieten. Außerdem haben mehrere grün fluoreszierende Protein (GFP) und ROS basierten Redox-Indikatoren entwickelt worden, um genauere Beurteilung des Fachintrazellulären Redox-oder ROS Signale 14-16 zu erreichen. Unter diesem, eine genetisch kodierte Superoxid-Indikator, der Kreis permutierter gelb fluoreszierendes Protein und Targete entwickelten wird in Mitochondrien (mt-cpYFP) 17. mt-cpYFP kann bei 405 oder 488 nm mit beiden Emissionspeaks bei 515 nm angeregt werden. Die Emission bei 488 nm Anregung, die auf Superoxid-spezifisch, wie durch vorherige in vitro-und in-vivo-Kalibrierung 17,18 dargestellt. Die Emission bei 405 nm Anregung wird als interne Kontrolle verwendet (siehe hierzu detaillierte Informationen über die Emissions-und Anregungsspektren von mt-cpYFP unter verschiedenen Bedingungen Abbildung 1 von Lit. 17). Mit Zeitraffer-konfokale Bildgebung, erkennt diese Anzeige platzen Superoxid-Produktion Veranstaltungen, namens Superoxid Wallungen, in Einzel Mitochondrien intakter Zellen. Superoxid-Flash dient als eine zusammengesetzte Funktion der mitochondrialen Atmung, vorübergehende Begleitmitochondrienmembran Depolarisation und ROS-Produktion 17-20. Kürzlich haben wir die pan-Gewebe mt-cpYFP transgenen Mäusen mit dem pUC-CAGGS-mt-cpYFP Vektor 17,19 auf C57/BL6 Hintergrund generiert und verifiziert die starken Ausdrucksion dieses Indikators in Herz, Skelettmuskeln und anderen Geweben (Abbildung 2). Die transgenen Mäuse werden auf Anfrage und MTA Genehmigung durch die Universität von Washington sein für interessierte akademischen Forschern zur Verfügung. In dieser Studie beschreiben wir in situ-Bildgebung von Superoxid blinkt Langendorff perfundierten Herzen als auch in vivo-Abbildung von von Blitzereignissen in der Skelettmuskulatur von betäubten mt-cpYFP transgenen Mäusen 17,19. Diese Technologie ermöglicht die Echtzeitüberwachung der einzelnen mitochondrialen ROS-Produktion Ereignisse in einem physiologisch relevanten Bedingungen oder in vivo 21,22. Es ist auch möglich, das System zu verwenden, um andere einzelne Parameter wie mitochondriale Membranpotential und Calcium mit geeigneten fluoreszierenden Indikatoren. Ferner gleichzeitige oder parallele Auswertung der mitochondrialen Funktion mit intrazelluläre Ereignisse (z. B. Calcium Transienten) oder Herzfunktion (z. B.. Ejektionsfraktion) erreicht werden. Pathologischen Störungen, wie Ischämie und Reperfusion kann perfundierten Herzen angewandt werden, um die Auswirkungen von Stress auf die einzelnen mitochondrialen Funktion im intakten Myokard zu beurteilen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Toronto Research Chemicals</td>
			<td>B592500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>AC34961-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP120-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7006-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1880-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP358-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8282-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T-668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Confocal Line Scanning Microscope (LSM 510 Meta, Zeiss), software version 4.2 SP1 including &#34;Physiological Analysis&#34; module.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal imaging of single mitochondrial superoxide flashes in intact heart or in vivo

Mitochondrium ist ein wichtiger intrazellulären Organellen für die Energieproduktion und intrazelluläre Signal in eukaryontischen Systemen verantwortlich. Mitochondriale Dysfunktion oft begleitet und trägt zur menschlichen Krankheit. Mehrzahl der Ansätze, die entwickelt wurden, um die mitochondriale Funktion und Dysfunktion beurteilen sich auf in vitro oder ex vivo-Messungen. Ergebnisse aus diesen Versuchen sind die Fähigkeit zur Bestimmung der mitochondrialen Funktion in vivo begrenzt. Hier beschreiben wir einen neuen Ansatz, die konfokale Scanning-Mikroskopie für die Abbildung von intakten Geweben im Live Aminalen, die die Bewertung der einzelnen Funktion der Mitochondrien in einer Echtzeitweise in vivo ermöglicht nutzt. Zunächst erzeugen wir transgene Mäuse, die mitochondriale gezielte Superoxid-Indikator, zirkular permutiert gelb fluoreszierende Protein (mt-cpYFP) ausdrückt. Betäubt mt-cpYFP Maus auf eine maßgeschneiderte Tischadapter und Zeitraffer-Bilder werden f genommen Festrom die freiliegenden Skelettmuskeln der hinteren Gliedmaßen. Die Maus wird anschließend getötet und das Herz wird für Langendorff-Perfusion mit physiologischen Lösungen bei 37 ° C eingestellt Perfundierten Herzen in einer speziellen Kammer auf der konfokalen Mikroskoptisch positioniert und leichtem Druck aufgebracht wird, um das Herz zu immobilisieren und Herzschlag induzierten Bewegungsartefakte zu unterdrücken. Superoxid Wallungen werden durch Echtzeit-2D-konfokale Bildgebung bei einer Frequenz von einem Bild pro Sekunde erfasst. Die Perfusionslösung können modifiziert werden, um verschiedene Substrate Atmung oder andere Fluoreszenzindikatoren enthalten. Die Perfusion kann auch eingestellt werden, um Krankheitsmodellen wie Ischämie und Reperfusion zu erzeugen. Diese Technik ist ein einzigartiger Ansatz zur Bestimmung der Funktion von Einzel Mitochondrium in intakten Geweben und in vivo.

Gemäß diesem Protokoll können in vivo Bildgebung von Einzel mitochondriale Ereignisse in der Skelettmuskulatur von betäubten Mäusen durchgeführt werden, gefolgt von in situ-Bildgebung in perfundierten Herzen (Fig. 1). Die optimale Einstellung der Aufnahmebedingungen wird dafür sorgen, klare Bilder der intakten Muskeln und mit Einzel Mitochondrium Auflösung (Abbildung 2). TMRM wird oft verwendet, um die Position der mt-cpYFP überprüfen und sollte eine vollstä...

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Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

14.5K Aufrufe.  University of Washington.  Die konfokale Scanning-Mikroskopie zur Abbildung Einzel mitochondriale Ereignisse in perfundierten Herz-oder Skelettmuskulatur in lebenden Tieren angewendet. Echtzeit-Überwachung von einzelnen mitochondrialen Prozesse wie Superoxid blinkt und Membranpotentialschwankungen ermöglicht die Auswertung der mitochondrialen Funktion in einer physiologisch relevanten Kontext und bei pathologischen Störungen. 

Serie: Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Single Cell Electroporation in vivo within the Intact Developing Brain

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. The distinct advantage of this technique is that experimental manipulations may be performed on individual cells while leaving the surrounding tissue unaltered, thereby distinguishing cell-autonomous effects from those resulting from global treatments. When combined with advanced in vivo imaging techniques, SCE of fluorescent markers permits direct visualization of cellular morphology, cell growth, and intracellular events over timescales ranging from seconds to days. While this technique is used in a variety of in vivo and ex vivo preparations, we have optimized this technique for use in Xenopus laevis tadpoles. In this video article, we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the albino Xenopus tadpole. We also discuss methods to optimize yield, and show examples of live two-photon fluorescence imaging of neurons fluorescently labeled by SCE.

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact tissue, including in vivo preparations. Here we detail the procedure for SCE of a fluorescent dye or plasmid DNA into neurons within the intact brain of the Xenopus laevis tadpole.

Single Cell Elektroporation in vivo innerhalb der intakten sich entwickelnde Gehirn

Single-cell electroporation (SCE) is a specialized technique allowing the delivery of DNA or other macromolecules into individual cells within intact ...

Forschung

Biologie

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Assessment of Calcium Sparks in Intact Skeletal Muscle Fibers

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in the striated muscle fibers that appear as highly localized Ca2+ release events mediated by ryanodine receptor (RyR) Ca2+ release channels on the sarcoplasmic reticulum (SR) membrane. Proper assessment of muscle Ca2+ sparks could provide information on the intracellular Ca2+&#160;handling properties of healthy and diseased striated muscles. Although Ca2+ sparks events are commonly seen in resting cardiomyocytes, they are rarely observed in resting skeletal muscle fibers; thus there is a need for methods to generate and analyze sparks in skeletal muscle fibers.
Detailed here is an experimental protocol for measuring Ca2+ sparks in isolated flexor digitorm brevis (FDB) muscle fibers using fluorescent Ca2+ indictors and laser scanning confocal microscopy. In this approach, isolated FDB fibers are exposed to transient hypoosmotic stress followed by a return to isotonic physiological solution. Under these conditions, a robust Ca2+ sparks response is detected adjacent to the sarcolemmal membrane in young healthy FDB muscle fibers. Altered Ca2+ sparks response is detected in dystrophic or aged skeletal muscle fibers. This approach has recently demonstrated that membrane-delimited signaling involving cross-talk between inositol (1,4,5)-triphosphate receptor (IP3R) and RyR contributes to Ca2+ spark activation in skeletal muscle. In summary, our studies using osmotic stress induced Ca2+ sparks showed that this intracellular response reflects a muscle signaling mechanism in physiology and aging/disease states, including mouse models of muscle dystrophy (mdx mice) or amyotrophic lateral sclerosis (ALS model).

Described here is a method to directly measure calcium sparks, the elementary units of Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum&#160;in intact skeletal muscle fibers. This method utilizes osmotic-stress-mediated triggering of Ca2+ release from ryanodine receptor in isolated muscle fibers. The dynamics and homeostatic capacity of intracellular Ca2+ signaling can be employed to assess muscle function in health and disease.

Bewertung von Calcium in Sparks Intact Skelettmuskelfasern

Maintaining homeostatic Ca2+ signaling is a fundamental physiological process in living cells. Ca2+ sparks are the elementary units of Ca2+ signaling in ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical coherence microscopy (OCM) has been demonstrated to be capable of imaging small animal hearts with high spatial resolution and ultrahigh imaging speed. The high image contrast and noninvasive properties make OCM ideal for performing longitudinal studies without requiring tissue dissections or staining. Drosophila has been widely used as a model organism in cardiac developmental studies due to its high number of orthologous human disease genes, its similarity of molecular mechanisms and genetic pathways with vertebrates, its short life cycle, and its low culture cost. Here, the experimental protocols are described for the preparation of Drosophila and optical imaging of the heartbeat with a custom OCM system throughout the life cycle of the specimen. By following the steps provided in this report, transverse M-mode and 3D OCM images can be acquired to conduct longitudinal studies of the Drosophila cardiac morphology and function. The en face and axial sectional OCM images and the heart rate (HR) and cardiac activity period (CAP) histograms, were also shown to analyze the heart structural changes and to quantify the heart dynamics during Drosophila metamorphosis, combined with the videos constructed with M-mode images to trace cardiac activity intuitively. Due to the genetic similarity between Drosophila and vertebrates, longitudinal study of heart morphology and dynamics in fruit flies could help reveal the origins of human heart diseases. The protocol here would provide an effective method to perform a wide range of studies to understand the mechanisms of cardiac diseases in humans.

Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy OCM

Here, the experimental protocols are described for preparing Drosophila at different developmental stages and performing longitudinal optical imaging of Drosophila heartbeats using a custom optical coherence microscopy (OCM) system. The cardiac morphological and dynamical changes can be quantitatively characterized by analyzing the heart structural and functional parameters from OCM images.

Drosophila Vorbereitung und Longitudinal Imaging der Herzfunktion in vivo unter Verwendung optischer Kohärenzmikroskopie (OCM)

Longitudinal study of the heartbeat in small animals contributes to understanding structural and functional changes during heart development. Optical ...

Confocal Imaging of Neuropeptide Y-pHluorin: A Technique to Visualize Insulin Granule Exocytosis in Intact Murine and Human Islets

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study insulin granule exocytosis either use electrophysiology or microscopy coupled to the expression of fluorescent reporters. However most of these techniques have been optimized for clonal cell lines or require dissociating pancreatic islets. In contrast, the method presented here allows for real time visualization of insulin granule exocytosis in intact pancreatic islets. In this protocol, we first describe the viral infection of isolated pancreatic islets with adenovirus that encodes a pH-sensitive green fluorescent protein (GFP), pHluorin, coupled to neuropeptide Y (NPY). Second, we describe the confocal imaging of islets five days after viral infection and how to monitor the insulin granule secretion. Briefly, the infected islets are placed on a coverslip on an imaging chamber and imaged under an upright laser-scanning confocal microscope while being continuously perfused with extracellular solution containing various stimuli. Confocal images spanning 50 &#181;m of the islet are acquired as time-lapse recordings using a fast-resonant scanner. The fusion of insulin granules with the plasma membrane can be followed over time. This procedure also allows for testing a battery of stimuli in a single experiment, is compatible with both mouse and human islets, and can be combined with various dyes for functional imaging (e.g., membrane potential or cytosolic calcium dyes).

We describe a protocol for visualization of insulin exocytosis in intact islets using pHluorin, a pH-sensitive green fluorescent protein. Isolated islets are infected with adenovirus encoding pHluorin coupled to the vesicle cargo neuropeptide Y. This allows for the detection of insulin granule fusion events by confocal microscopy.

Confocal Imaging von Neuropeptid Y-pHluorin: eine Technik, um Insulin Granulat Exozytose in intakten murinen und menschliche Inseln visualisieren

Insulin secretion plays a central role in glucose homeostasis under normal physiological conditions as well as in disease. Current approaches to study ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Single-Cell Resolution Dreidimensionale Bildgebung intakter Organoide

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und der Superoxidspiegel

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, various mitochondrial quality control mechanisms cooperate to maintain a healthy mitochondrial network. One such pathway is mitophagy, where PTEN-induced kinase 1 (PINK1) and Parkin phospho-ubiquitination of damaged mitochondria facilitate autophagosome sequestration and subsequent removal from the cell via lysosome fusion. Mitophagy is important for cellular homeostasis, and mutations in Parkin are linked to Parkinson's disease (PD). Due to these findings, there has been a significant emphasis on investigating mitochondrial damage and turnover to understand the molecular mechanisms and dynamics of mitochondrial quality control. Here, live-cell imaging was used to visualize the mitochondrial network of HeLa cells, to quantify the mitochondrial membrane potential and superoxide levels following treatment with carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP), a mitochondrial uncoupling agent. In addition, a PD-linked mutation of Parkin (ParkinT240R) that inhibits Parkin-dependent mitophagy was expressed to determine how mutant expression impacts the mitochondrial network compared to cells expressing wild-type Parkin. The protocol outlined here describes a simple workflow using fluorescence-based approaches to quantify mitochondrial membrane potential and superoxide levels effectively.

Autor im Fokus: Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und der Superoxidspiegel mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen  

This technique describes an effective workflow to visualize and quantitatively measure mitochondrial membrane potential and superoxide levels within HeLa cells using fluorescence-based live imaging.

Fluoreszenzbasierte Quantifizierung des mitochondrialen Membranpotentials und des Superoxidspiegels mittels Live-Bildgebung in HeLa-Zellen

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...