Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, 2R01DK59558 (GN) unterstützt. UAMS Translational Research Institute der National Institutes of Health National Center for Research Resources Gewährung UL1 RR029884 abstützt Teilfinanzierung für die Durchflusszytometrie Core bei UAMS. Wir danken Dr. Peipei Ping (University of California in Los Angeles, Los Angeles, CA) zur Bereitstellung eines aliquoten von Adenovirus trägt codierende cDNA der dominant negative (inaktiv) Mutante von PKC-ε und Dr. Allen Samarel (Loyola University Medical Center; Maywood, IL) zum Bereitstellen eines Aliquots Adenovirusvektor Codieren des konstitutiv aktiven Mutanten von PKC-ε. Wir danken auch Drs. Peter Parker und Peter Sugden (Imperial College London, London, UK) für die Bereitstellung von cDNA konstitutiv aktive PKC-ε.

Ein. Isolation der proximalen Nierentubuli für primäre Kultur <ol><li> Anesthetize das Kaninchen, Verbrauchssteuern beide Nieren und legen Sie sie in einer Petrischale mit sterilem prep Puffer (DMEM/F12-Medium) in einer Laminarströmungshaube gefüllt. </li><li> Perfundieren jeder Niere mit 50 ml Puffer durch prep 50 ml sterilem gefolgt phosphatgepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4 (PBS) und PBS-Eisenoxid-Lösung (45 ml + 5 ml). De-kapseln Nieren und übergeben sie an die prep Puffer mit Deferoxamin. </li><li> Ernten die Rinde jeder Niere. </li><li> Homogenisieren des Gewebes mit einer 15 ml Dounce Homogenisator. Gießen des Homogenats auf 2 sterile Mesh Siebe (85 um auf der Unterseite und auf der Oberseite 235 um) über einen 1 L sterilen Becherglas gegeben. Spülen Sie die Siebe mit Deferoxamin-haltigem Puffer. </li><li> Sammeln Sie alle Gewebe auf der 85 um-Sieb in einen sterilen konischen Zentrifugenröhrchen mit 35-40 ml der Deferoxamin-haltigen Puffer gefüllt gelassen. Vorsichtig mischen die Zellsuspension. </li><li> Legen Sie einen starken magnet außerhalb der Röhre zu entfernen Eisen gefüllt Glomeruli und damit sich das Fahrwerk zu begleichen. Absaugen Eisen vom Magneten mit einer Pasteurpipette. Wiederholen Sie diesen Vorgang. </li><li> Planen 1 ml Medium, enthaltend Verdauung 2,400-2,500 Einheiten Collagenase I und 0,6 mg Sojabohnentrypsininhibitor in der Deferoxamin-haltigen Puffer gelöst. Filtern sterilisieren die Verdauung Medium. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke der Zellsuspension zu 40 ml und 1 ml der Verdauung Medium. Inkubation bei Raumtemperatur für 17 min sanft Mischen der Suspension, Zentrifuge bei 50 xg für 2 min bei 4 ° C, saugen das Medium, und fügen Sie frische Deferoxamin Puffer. </li><li> Wiederhole die Eisen-entfernenden Prozedur mit dem Magneten mehrfach, drehen die Suspension wieder absaugen Mediums, und geben 46 ml Medium ohne Glucose. </li><li> Vorsichtig mischen und messen Sie 500 ul der Suspension in zwei vorgewogenen Eppendorf-Röhrchen. Spin Zellen nach unten bei 10.000 xg für 1 min, saugen die Medien, und wiegen das Pellet. Berechnen der Gesamtausbeute an feuchten Masse und Protein. </li><li> Platte die Zellen in steriler 35 mm Kulturschalen bei der Dichte von 1 mg Protein / Schale mit Glucose-freie DMEM/F12 Medium. Kultur-Zellen in 2 ml Glucose-frei DMEM/F12-Medium immer auf einem Schüttler im Brutschrank bei 37 ° C (95% Luft / 5% CO 2). 1,2 </li></ol> 2. Renal proximalen Tubulus Cell Culture <ol><li> Das Kulturmedium ist eine 50:50-Mischung aus DMEM und Hams F-12 Nährstoffmix ohne Phenolrot, Pyruvat und Glucose, mit 15 mM NaHCO3, 15 mM HEPES, 6 mM und Lactat (pH 7,4, 295 mosmol / kg H ergänzt 2 O). Die Medien werden mit L-Ascorbinsäure-2-phosphat (50 uM), Rinderinsulin (10 nM), humanes Transferrin (5 mg / ml), Hydrocortison (50 nM) und Selen (5 ng / ml) unmittelbar vor ergänzt täglichen Medien-Wechsel. </li><li> Absaugen alten Medien von Speisen mit einer sterilen Technik. 2 ml warmes, frisches Medium zu jedem Gericht mit einer sterilen Technik. Renal proximalen Tubuluszellen (RPTC) erreichen Konfluenz in ca. 5-6 Tage nach dem Ausplattieren. 1,2 </li></ol> 3. Adenoviralen Infektion RPTC <ol><li> Adenoviralen Infektion erfolgt in konfluenten, ruhenden Kulturen RPTC nach dem täglichen Medienwechsel durchgeführt. Dominant negative PKC-ε-Mutante (dnPKC-ε) wurde durch den Ersatz aufgebaut: 1) Lysin mit Arginin an Position 436 des ATP-Bindungsstelle und 2) Alanin mit Glutamat an Position 159 des Pseudosubstrat Domäne. Diese Mutationen zerstört das Konstrukt der Kinase-Aktivität, ohne die aktive Konformation von PKC-ε. 3 PKC-ε gemacht wurde konstitutiv aktiv durch Deletion der Reste 154-163 der hemmenden Pseudosubstrat Domäne. 4 </li><li> Hinzufügen Stammlösung des Adenovirus trägt caPKC-ε-cDNA oder dnPKC ε cDNA zu jeder Schale zu wünschen Multiplizität der Infektion (MOI), was zu deutlichen PKC-&amp; Epsil erhaltenauf; Proteinspiegel. Inkubieren RPTC mit Adenovirus für 24 Stunden. Ändern Medien und Kultur Zellen für weitere 24 Stunden. Signifikant erhöhte phosphorylierten und insgesamt PKC-ε Proteine ​​können unter Verwendung 25-50 MOI von adenoviralen Vektor Kodierung caPKC-ε werden. Größere MOI Ergebnisse in noch größeren Anstieg in der Höhe der aktiven PKC-ε, aber es ist nicht in RPTC empfohlen aufgrund der raschen Zelltod und Verlust. Deutlich erhöhte Mengen des inaktiven PKC-ε Protein kann unter Verwendung 50-100 MOI in RPTC werden, ohne negative Auswirkungen. 5 </li><li> Bei 48 Stunden nach der Infektion, Aspirat Medien, wäscht die Monoschichten mit PBS, und sammeln Zellen für Immunoblot-Analyse, um Proteinspiegel von PKC-ε zu bestimmen. 5 </li></ol> 4. Messung des RPTC Respiration <ol><li> Bereiten Sie ein Assay-Puffer zur Messung Zustand 3 Atmung (120 mM KCl, 5 mM KH 2 PO 4, 10 mM HEPES, 1 mM MgSO 4, und 2 mM EGTA, pH 7,4). Zum Messen Komplex I-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 5 mM Glutamat, 5 mM Malat und 0,1 mg / ml Digitonin. Für komplexe II-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 10 mM Succinat, Rotenon 0,1 uM und 0,1 mg / ml Digitonin. Für komplexe IV-gekoppelten Zustand 3 Atmung, ergänzen das Assay-Puffer mit 1 mM Ascorbat, 1 mM N, N, N &#39;, N&#39;-Tetramethyl-p-Phenylendiamin (TMPD) und 0,1 mg / ml Digitonin. Legen Sie die Lösungen in einem 37 ° C Wasserbad. </li><li> Saugen Sie Medien aus einer Kulturschale mit RPTC Monoschicht, 2 ml warmem Zustand 3 Atmung Puffer, vorsichtig abkratzen Zellen aus der Schale mit einem Gummihammer Polizist, und übertragen Sie die Suspension auf den Sauerstoffverbrauch Kammer mit einer Clark-Elektrode ausgestattet. </li><li> Measure Zustand 2 Atmung (in Abwesenheit von ADP). Initiieren Zustand 3 Atmung durch Zugabe ADP zu einer Endkonzentration von 0,4 mM. Initiieren Zustand 4 Atmung indem Oligomycin zu einer endgültigen konzentration von 0,5 ug / ml. Entkoppelt die Atmung wird durch Zugabe von 0,5 uM FCCP die Zellen atmenden an staatlichen 3 gemessen. 6,7 </li><li> Sammeln Sie die Zellsuspension aus der Kammer, fallen Proteins mit Perchlorsäure und Spin-down des Niederschlags. Bestimmen Proteinkonzentration im Zellpellet. </li></ol> 5. Analyse des mitochondrialen Membranpotentials (ΔΨm) <ol><li> Bereiten 0,5 mM JC-1-Lösung in der sterilen Kulturmedium. </li><li> Fügen Sie langsam 20 ul JC-1-Lösung zu jedem Gericht bis zur endgültigen Konzentration von 5 uM erhalten. Swirl das Gericht, um den Farbstoff gründlich mischen. Bringen Sie die Speisen in den Inkubator für 30 min. </li><li> Setzen Gerichte auf Eis, absaugen Medien, und waschen Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS. Aspirate PBS, 1 ml frischem PBS, kratzen Zellen aus der Schüssel und übertragen Sie sie auf einem Eppendorf-Röhrchen. Break up Monoschichten in einzelne Zellen durch Pipettieren sie rauf und runter. </li><li> Spin die Aussetzung hinunter auf 1.000 xg für 2 min, aspwütend den Überstand, 1 ml PBS zu dem Pellet und wieder aussetzen, um eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Schritt bei Bedarf erneut. </li><li> Spin Zellen nach unten bei 1.000 xg für 2 min, den Überstand aspirieren, 0,5 ml PBS und Resuspendieren des Pellets. Analysieren Fluoreszenz durch Durchflusszytometrie unter Verwendung der Anregung durch einen 488-nm Argon-Ionen-Laser ist. Lesen der Emission in zwei separaten Kanälen, FL1 bei 525 nm und bei 590 nm FL2. Mitochondrienmembranpotentials als FL2/FL1 Fluoreszenz-Ratio ausgedrückt. 6 </li></ol> 6. Isolierung von Mitochondrien <ol><li> Planen Isolationspuffern: Puffer A (10 mM HEPES, 225 mM Mannitol, 75 mM Sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4), Puffer B (Puffer A, enthaltend Protease-Inhibitoren, 1 mM Na 3 VO 4, 1 mM NaF), und Puffer C (10 mM HEPES, 395 mM Sucrose, 0,1 mM EGTA, pH 7,4). Führen Sie alle Schritte auf dem Eis. </li><li> Waschen RPTC Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer. Kratzen Monoschichten in Eppendorf-Röhrchen und drehen siebei 500 × g für 5 min. Waschen des Pellets in 1 ml Puffer A </li><li> Resuspendieren des Pellets in 1 ml Puffer B, und übertragen Sie die Suspension auf eine 2 ml Dounce Homogenisator. </li><li> Homogenisieren Zellen im Dounce-Homogenisator, bis die meisten der Zellen im Homogenat gebrochen werden, wenn es unter einem Mikroskop untersucht. </li><li> Zentrifuge das Homogenat bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Den Überstand nach unten und Spin bei 15.000 × g für 10 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen und erneut zu suspendieren das Pellet enthaltende rohe Mitochondrien in 1 ml Puffer C Drehen Sie die Überstände unten bei 15.000 xg für 10 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie das Waschen der Pellets zwei weitere Male. 5 </li><li> Um die Aktivitäten von Atemwegs-Komplexe zu messen, resuspendieren mitochondrialen Pellet in 50-100 ul Assaypuffer und Einfrieren in flüssigem Stickstoff. Auftauen Proben langsam auf Eis. </li></ol> 7. Messung der Aktivität der NADH-Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex I) <ol><li> Bereiten Sie die Assay-Puffer: 10 mM KH 2 PO 4, 5 mM MgCl 2, pH 7,2. Hinzufügen Fettsäure-freies BSA und NADH zu Endkonzentrationen von 0,25% und 0,25 mM zu erhalten sind. Add 2 ul Antimycin A-Lösung (1 mg / ml) auf eine Endkonzentration von 2 ug / ml. </li><li> Führen Sie die Proben in einem 48-Well-transparente Platte. Fügen Sie eine Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem Well, 500 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min. </li><li> Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 3,25 mM Ubichinon in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (340 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 5 ul Rotenon-Lösung (1 mg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen Komplex I Aktivität wie das Rotenon-sensitive NADH Oxidation. 7 </li></ol> 8. Messung der Aktivität der Succinat-Ubichinon Oxidoreduktase (Komplex II) <ol&gt; <li> Bereiten Sie die Assay-Puffer, der 0,25% Fettsäure-freies BSA, 20 mM Kaliumsuccinat, 0,25 mM 2,6-Dichlorindophenol, 2 pg / ml Antimycin A und 10 ug / ml Rotenon. </li><li> Führen Sie die Proben in Duplikate in einer 48-Well-transparente Platte, einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem Well, 500 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 2 min. </li><li> Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 10 ul 3,25 mM Ubichinon in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (595 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Berechnen Complex II-Aktivität, indem Sie die Reduktion von 2,6-Dichlorindophenol. 7 </li></ol> 9. Messung der Aktivität von Ubiquinol-Cytochrom c Oxidoreduktase (Komplex III) <ol><li> Bereiten Sie die Assay-Puffer mit 0,1% Fettsäure-freies BSA, 80 mM Kaliumsuccinat, 10 ug / ml Rotenon und 0,24 mM Kaliumcyanid. </li><li> Führen Sie die Probenin Duplikate in einer 48-Well-transparente Platte einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem gut, fügen 291 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min. </li><li> Starten Sie die Reaktion durch Zugabe von 3 ul 6 mM oxidiertes Cytochrom c in jede Vertiefung. Notieren Sie sich die Absorption (550 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 5 ul Antimycin A-Lösung (1 mg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen komplexer III Tätigkeit als Antimycin A-sensitive Cytochrom c Reduktion. 7 </li></ol> 10. Messung der Aktivität von Cytochrom-Oxidase (Komplex IV) <ol><li> Reduziert Cytochrom c durch Zugabe Natriumascorbat bis 9 mM Lösung von Cytochrom c und Dialysieren der Lösung über Nacht bei 4 ° C in 1 L Phosphatpuffer (10 mM KH 2 PO 4, pH 7,2), enthaltend 5 mM MgCl 2 vorzubereiten. Bereiten Sie die Assay-Puffer mit0,1% Fettsäure-freies BSA und Antimycin A (2 ug / ml). </li><li> Führen Sie die Proben in einem 48-Well-transparente Platte, einschließlich einer Blindprobe, die alle Zugänge, aber keine Mitochondrien. Zu jedem gut, fügen 233 ul der Assay-Puffer mit Ergänzungen und Mitochondrien und inkubieren Sie die Platte bei 30 ° C unter Mischen für 5 min. </li><li> Startet die Reaktion durch Zugabe von reduziertem Cytochrom c (90 uM Endkonzentration). Notieren Sie sich die Absorption (550 nm) für 3 min in 20 Sekunden-Intervallen. Fügen Sie 2 ul KCN-Lösung (8 pg / ml) in jede Vertiefung und Absorption für weitere 2 min. Berechnen komplexer IV Tätigkeit als KCN-sensitive Cytochrom c Oxidation. 7 </li></ol> 11. Messung der Aktivität von F 0 F 1-ATPase (ATP-Synthase) <ol><li> Planen F 0 F 1-ATPase-Assay-Puffer (10 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 2 mM MgCl 2, pH 8,2). Resuspendieren mitochondrialen Pellet im Assaypuffer, eingefroren mitochondrialen Proben in liquid Stickstoff und Auftauen der Proben langsam auf Eis. </li><li> Führen Sie die Proben in dreifacher Ausführung in einer 48-Well-transparente Platte. Für jede Behandlungsgruppe werden 2 Brunnen laufen, um insgesamt ATPase-Aktivität (275 ul der Assay-Puffer, 5 ul mitochondriale Suspension und 5 ul 95% Ethanol) und 1 messen gut Oligomycin-und Kleinschreibung ATPase-Aktivität zu messen (275 ul werden der Assay-Puffer, 5 ul mitochondrialen Suspension und 5 ul 1 mg / ml Oligomycin Lösung in 95% Ethanol). </li><li> Inkubieren Proben bei 31 ° C für 10 min unter ständigem Schütteln. Hinzufügen 16 ul 100 mM ATP-Lösung (pH 7,0) und Inkubation bei 31 ° C für 5 min unter ständigem Schütteln. </li><li> Übertragen 200 ul des Inkubationsgemisches mit einem Rohr mit 50 ul 3 M TCA. Inkubieren auf Eis für 10 min und Spin sie unten bei 10.000 × g für 5 min bei 4 ° C. Verwenden Überstände und Pellets zu Phosphat und Protein-Gehalt zu bestimmen sind. </li><li> Bestimmen Phosphatgehalt in den Überständen mit demanorganisches Phosphat-Assay. Bereiten 100 ml Sumner Reagenz, indem 0,88 g FeSO 4 bis 10 ml von 3,75 MH 2 SO 4 und die Anpassung an 90 ml mit H 2 O. Man gibt 10 ml Ammoniummolybdat-Lösung (0,66 g/10 ml H 2 O) zu der Lösung von FeSO 4 in H 2 SO 4. Vor Licht schützen. </li><li> Last 96-Well-Platte mit 50 ul jeder Phosphat-Standard (0 - 1.000 uM KH 2 PO 4) und 50 ul von jedem Überstand in Duplikate. Fügen Sie 250 ul der Sumner Reagenz in jedes Well pipettieren und die Platte bei 30 ° C für 15 min unter ständigem Schütteln. </li><li> Notieren Sie sich die Absorption bei 595 nm bei Raumtemperatur. F 0 F 1-ATPase-Aktivität durch Messen der Oligomycin-sensitive Freisetzung von P i von ATP, wie wir vorher beschrieben, bestimmt. 7,8 berechnen und Oligomycin-insensitive F 0 F 1-ATPase-Aktivitäten. Um die Oligomycin-ATPase aktiviert berechnenvität, subtrahieren Oligomycin-und Kleinschreibung Aktivität aus dem gesamten ATPase-Aktivität. 8,9 </li></ol> 12. Messung der intrazellulären ATP Inhalt <ol><li> Ort Kulturschalen mit RPTC Monoschichten auf Eis, absaugen Medium, und waschen Sie die Monoschichten zweimal mit eiskaltem PBS-Puffer. 1 ml PBS in jeder Monoschicht, kratzen jede Monoschicht in PBS, und sammelt die Zellsuspension in ein Eppendorf-Röhrchen. Drehen Sie die Eppendorf-Röhrchen in der Mikrozentrifuge für 5 sek. </li><li> Bestimmen ATP-Gehalt in jeder Probe durch die RPTC Luziferase unter Verwendung des ATP-Biolumineszenz-Assay-Kit II HS (Roche) und dem Protokoll des Herstellers. Bestimmen Proteinkonzentration in jeder Probe zu berechnen und ATP-Konzentration pro mg Protein. 8 </li></ol> 13. Visualisierung der mitochondrialen Morphologie <ol><li> Ändern Kulturmedien. Add 2 ul 100 uM Lösung von MitoTracker Red 580 zu jedem Gericht (Endkonzentration. 100 nM) und geben die Gerichte auf den incubator für 30 min. </li><li> Untersuchen Sie die Live-Monoschichten unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Eintauchen in Wasser Ziel. 5 </li></ol> 14. Analyse der Lebensfähigkeit der Zellen <ol><li> Bei 24 Stunden vor Beginn der Testdurchführung vorzubereiten 50 mM Lösung von Cisplatin an Zellen, die als positive Kontrolle für Apoptose (Annexin V-positive Zellen) dienen werden, zu behandeln. Auch bereiten 500 mM Lösung von tert.-Butylhydroperoxid zu Zellen, die als positive Kontrollen für oncosis (Propidiumiodid-positive Zellen) dienen werden, zu behandeln. </li><li> Gönnen 2 Gerichte mit 2 ul 50 mM Cisplatin und 2 Gerichte mit 2 ul 500 mM tert-Butylhydroperoxid. Widmen 1 Gericht für eine no-Fleck Kontrolle. </li><li> Bei 24 Stunden nach der Behandlung mit Cisplatin und TBHP, bereiten den Bindungspuffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1,8 mM CaCl 2) und Propidiumiodid (PI)-Lösung (50 g / ml) im Bindungspuffer. </li><li> Waschen Monoschichten einmal mit der Bindung Buffer. 1 ml der eiskaltem Puffer und 50 ul PI-Lösung zu jedem Gericht mit Ausnahme der no-Fleck und Annexin V-positiven Zellen. Titelbild Gerichte und auf Eis inkubieren für 15 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert. </li><li> Waschen Monoschichten mit dem Bindungspuffer (10 min) und 1 ml Bindungspuffer und 2 ul Annexin V-FITC-Lösung zu jedem Gericht außer no-Fleck und PI-positiven Zellen. Titelbild Gerichte und Inkubation bei RT für 10 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert. </li><li> Saugen Sie die Puffer und waschen Sie die Monoschichten mit 1 ml der eiskalten Bindungspuffer auf Eis für 10 min mit sanften kreisförmigen Schütteln inkubiert. Wiederholen Sie den Waschschritt. </li><li> Saugen Sie die Bindungspuffer und 500 ul Bindungspuffer zu jedem Gericht. Vorsichtig kratzen die Zellen unter Verwendung eines Gummi-Polizist und übertragen die Zellen Durchflusszytometrie Rohre fließen. Disperse die Zellen zu einer einzigen Zelle Suspension durch Pipettieren Proben nach oben und unten. Break up keine Zellhaufen. </li><li> PI und quantifizieren Annexin V-FITC-Fluoreszenz sofort durch flow Zytometrie mit Anregung bei 488 nm und Emission bei 590 und 530 nm für PI und FITC sind. Count 10.000 Ereignisse pro Probe. </li><li> Legen Sie die FITC Fluoreszenz auf der X-Achse und der PI-Fluoreszenz auf der Y-Achse der Durchflusszytometrie Punktgraph Zahlen. Zellen positiv für Annexin V und negativ für PI werden als apoptotisch. Zellen positiv für PI und negativ für Annexin V gelten onkotischen. 10,11 </li></ol>

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	<li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+culture+conditions+stimulate+gluconeogenesis+in+primary+cultures+of+renal+proximal+tubule+cells.">Improved culture conditions stimulate gluconeogenesis in primary cultures of renal proximal tubule cells.</a> Am. J. Physiol. 268, C1053-C1061 (1995).</li><li>Nowak, G., Schnellmann, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=L-ascorbic+acid+regulates+growth+and+metabolism+of+renal+cells:+improvements+in+cell+culture.">L-ascorbic acid regulates growth and metabolism of renal cells: improvements in cell culture.</a> Am. J. Physiol. 271, 2072-2080 (1996).</li><li>Ping, P., Takano, H., Zhang, J., Tang, X. L., Qiu, Y., Li, R. C., Banerjee, S., Dawn, B., Balafonova, Z., Bolli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-selective+activation+of+protein+kinase+C+by+nitric+oxide+in+the+heart+of+conscious+rabbits:+a+signaling+mechanism+for+both+nitric+oxide-induced+and+ischemia-induced+preconditioning.">Isoform-selective activation of protein kinase C by nitric oxide in the heart of conscious rabbits: a signaling mechanism for both nitric oxide-induced and ischemia-induced preconditioning.</a> Circ. Res. 84, 587-604 (1999).</li><li>Wotton, D., Ways, D. K., Parker, P. J., Owen, M. 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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Der hier vorgestellte Ansatz ermöglicht Überexpression einzelner Isoenzyme der PKC in der primären Kultur der renalen proximalen Tubuluszellen. Es gibt mehrere Stärken dieses Ansatzes: 1. Es erlaubt zum Untersuchen Regulationsmechanismen in einer homogenen Population von Zellen (renalen proximalen röhrenförmigen Zellen), die das primäre Ziel für verschiedene Beleidigungen (Ischämie, Hypoxie, oxidativem Stress), Drogen und nephrotoxicants innerhalb der Niere befinden. 2. Mitochondrialen Funktionen in di...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Laminarströmungshaube </td><td> Thermo Electron Corporation </td><td> FORMA 1104 </td></tr><tr><td> 2 ml und 15 ml Dounce Gewebemühle </td><td> WHEATON </td><td> 989-24607, 357544 </td></tr><tr><td> 85 und 235 micron Nylonnetz </td><td> Kleinteile </td><td> CMN - 0085 - 10YD CMN - 0250 - 10YD </td></tr><tr><td> 50 ml sterile Zentrifugenröhrchen </td><td> Biologix </td><td> BCT-P 50BS </td></tr><tr><td> 1,5 ml Mikro-Schlauch </td><td> Sarstedt </td><td> 72.690.001 </td></tr><tr><td> 35 x 10 mm sterile Kulturschalen </td><td> Corning </td><td> 430165 </td></tr><tr><td> Jouan Zentrifuge </td><td> Jouan </td><td> Jouan CR3 11175704 Rotoren: Jouan T40 </td></tr><tr&gt; <td> Einstellbare Mikro-Zentrifuge </td><td> SIGMA </td><td> Modell 1 bis 15 </td></tr><tr><td> Biologischer Sauerstoffbedarf Überwachung </td><td> YSI Incorporated </td><td> YSI Modell 5300A </td></tr><tr><td> Einkammer Micro Oxygen System </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5356S </td></tr><tr><td> Sauerstoffsonde </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5331A </td></tr><tr><td> Zirkulierende Bath </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5310 </td></tr><tr><td> KCl und Standard Membrane Kit </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5775 </td></tr><tr><td> Magnetrührer </td><td> YSI Incorporated </td><td> 5222 </td></tr><tr><td> Flatbed Recorder </td><td> Kipp &amp; Zonen </td><td> BD 11E </td></tr><tr><td> 48-well und 96-well transparenten Platten </td><td> Costar </td><td> 3548, 3679 </td></tr><tr><td> Thermomixer R </td><td> Eppendorf </td><td> 5355 21919 </td></tr><tr><td> Kreisschüttler MAXQ 2000 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SHKA 2000 </td></tr><tr><td> Spectra FLUOR Plus (Absorption / Fluoreszenz / Lumineszenz-Reader) </td><td> Tecan </td><td> F129005 </td></tr><tr><td> Water-Jacketed US Autoflow Automatische CO 2-Inkubator </td><td> NUAIRE </td><td> NU 4850 </td></tr><tr><td> 12x75 mm Polystyrol Kultur Reagenzgläser für die Durchflusszytometrie </td><td> Fisher Marke </td><td> 14-961-20 </td></tr><tr><td> Axioskop Wasser Immersionsobjektiv 63x / 0,90 W </td><td> Carl Zeiss </td><td> 114846 ACHROPLAN 44 00 67 </td></tr><tr><td> DMEM / F12 </td><td> Cellgro </td><td> 99 bis 830 - PB </td></tr><tr><td> DMEM / F12 Ham </td><td> Sigma </td><td> D 2906 - 1L </td></tr><tr><td> Deferoxaminmesylat </td><td> Hospira </td><td> D110 </td></tr><tr><td> Collagenase Typ I </td><td> Worthington </td><td> 4196 </td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor </td><td> Sigma </td><td> T 6522 - 500mg </td></tr><tr><td> 5,5 &#39;, 6,6&#39;-Tetrachlor-1, 1 &#39;, 3,3&#39;-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine Iodid (JC-1) </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Mitotracker Red </td><td> Invitrogen </td><td> M22425 </td></tr><tr><td> ATP-Biolumineszenz-Assay-Kit HS II </td><td> Roche </td><td> 11 699 709 001 </td></tr><tr><td> Annexin V - FITC-Lösung </td><td> BioVision </td><td> 1001 - 200 </td></tr><tr><td> Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td> BD FACSCalibur </td></tr></tbody></table>

assessment of mitochondrial functions and cell viability in renal cells overexpressing protein kinase c isozymes

Die Proteinkinase C (PKC)-Familie von Isozymen sind in zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen beteiligt. Unsere jüngsten Daten zeigen, dass PKC Funktion der Mitochondrien und zellulärer Energie-Status regelt. Zahlreiche Berichte zeigten, dass die Aktivierung von PKC-a und PKC-ε mitochondrialen Funktion im ischämischen Herz und vermittelt Kardioprotektion verbessert. Im Gegensatz dazu haben wir gezeigt, dass PKC-α und PKC-ε in nephrotoxicant-induzierte mitochondriale Dysfunktion und Zelltod in Nierenzellen beteiligt sind. Daher war das Ziel dieser Studie, um eine In-vitro-Modell der Nierenzellen erhalten aktive mitochondriale Funktionen, in denen PKC Isoenzyme selektiv aktiviert werden könnten oder gehemmt, um ihre Rolle in der Regulation der oxidativen Phosphorylierung und das Überleben der Zelle zu bestimmen entwickeln. Primäre Kulturen der renalen proximalen Tubuluszellen (RPTC) in verbesserten Bedingungen, die die mitochondriale Atmung und die Aktivität der mito kultiviertmitochondrialen Enzyme ähnlich denen in RPTC in vivo. Da herkömmliche Transfektionstechniken (Lipofectamin, Elektroporation) ineffizient primären Kulturen und haben negative Auswirkungen auf die Funktion der Mitochondrien, wurden PKC-ε mutierten cDNAs RPTC durch adenovirale Vektoren geliefert. Dieser Ansatz führt zu Transfektion von über 90% kultivierten RPTC. Hier präsentieren wir Methoden für die Beurteilung der Rolle von PKC-ε in: 1. Regulation der mitochondrialen Morphologie und Funktionen mit ATP-Synthese und 2 zugeordnet. Überleben RPTC in Primärkultur. PKC-ε wird durch Überexpression der konstitutiv aktiven PKC-ε-Mutante aktiviert. PKC-ε wird durch Überexpression inhibiert die inaktive Mutante von PKC-ε. Mitochondriale Funktion wird durch die Untersuchung der Atmung, Integrität der Atmungskette, Aktivitäten der Atemwege Komplexe und beurteilt F 0 F 1-ATPase, ATP Produktionsrate und ATP-Gehalt. Atmung ist einssessed in Digitonin-permeabilisierten RPTC als Zustand 3 (maximal Atmung in Gegenwart eines Überschusses an Substraten und ADP) und entkoppelt Atmung. Integrität der Atmungskette wird durch Messen Aktivitäten aller vier Komplexe der Atmungskette in isolierten Mitochondrien beurteilt. Kapazität der oxidativen Phosphorylierung wird durch Messen des mitochondrialen Membranpotentials ausgewertet, ATP Produktionsrate und Aktivität von F 0 F 1-ATPase. Energiezustand RPTC wird durch Bestimmung der intrazellulären ATP-Gehalt untersucht. Mitochondrienmorphologie in lebenden Zellen visualisiert MitoTracker Red 580, ein fluoreszierender Farbstoff, der spezifisch akkumuliert in Mitochondrien und Live-Monoschichten sind unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. RPTC Lebensfähigkeit wird anhand Annexin V / Propidiumiodid-Färbung durchflusszytometrisch gefolgt, um Apoptose und oncosis bestimmen. Diese Methoden ermöglichen eine selektive Aktivierung / Hemmung der einzelnen PKC-Isozymeum ihre Rolle in der zellulären Funktionen in einer Vielzahl von physiologischen und pathologischen Zuständen, die in in vitro reproduzieren lässt beurteilen.

Abbildung 1 zeigt, dass adenoviralen Lieferung von cDNA, welche die konstitutiv aktiv (caPKC-ε) und inaktiv (dnPKC-ε) Mutanten von PKC-ε zu einer signifikant erhöhten Proteingehalt von PKC-ε in RPTC und in Mitochondrien. Zellen mit cDNA tragenden caPKC-ε Vektor infiziert überexprimiert das phosphorylierte (aktiver) Form von PKC-ε während Zellen mit cDNA kodierenden dnPKC-ε überexprimierte PKC-ε die inaktiv war (nicht phosphoryliert) (Abbildung 1) infiziert. Die Anwesenheit v...

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Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Beurteilung der mitochondrialen Funktionen und Zellviabilität in Renal Überexpression Protein Kinase C-Isoenzyme

The protein kinase C (PKC) family of isozymes is involved in numerous physiological and pathological processes. Our recent data demonstrate that PKC ...

assessment-mitochondrial-functions-cell-viability-renal-cells

Research

JoVE Journal

Biology

18.1K Aufrufe.  University of Arkansas for Medical Sciences. Die Wirkungen der Aktivierung der Proteinkinase C (PKC) Isozyme auf die mitochondriale Atmung und Funktionen mit oxidativen Phosphorylierung und auf Lebensfähigkeit der Zellen assoziiert werden beschrieben. Der Ansatz paßt adenoviralen Technik, um selektiv überexprimieren PKC-Isozyme in primären Zellkultur und einer Vielzahl von Assays, um mitochondriale Funktionen und Energiezustand der Zelle zu bestimmen.

Serie: Assessment of Mitochondrial Functions and Cell Viability in Renal Cells Overexpressing Protein Kinase C Isozymes

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

Zählen und Bestimmung der Lebensfähigkeit von kultivierten Zellen

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

Forschung

Biologie

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

Die Aktivierung der Apoptose durch cytoplasmatische Mikroinjektion von Cytochrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Assessment of GFP Expression and Viability Using the Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide different information. Flow cytometry gives quantitative multi-parametric information about physical characteristics and staining or expression, but doesn't allow for visualization. Stand-alone fluorescence microscopy provides visual data, but doesn't allow for straightforward quantitative measurements1.
Image-based cytometry bridges the gap between these two methods, enabling the quick visualization and simultaneous quantitative analysis of thousands of cells in heterogeneous populations2. Here, we present a method for performing cell viability and green fluorescent protein (GFP) expression assays using the Tali Image-Based Cytometer3. The Tali instrument is a 3-channel (bright field, green fluorescence, red fluorescence) benchtop assay platform that offers several advantages over flow cytometry and fluorescence microscopy. The Tali cytometer is less expensive, takes up less bench space, requires less maintenance, and the work flow has been simplified so that the operation and analysis is much simpler and quicker. The Tali cytometer is capable of performing a range of suspension cell-based assays, including GFP and red fluorescent protein (RFP) expression, apoptosis4-6 and cell viability analysis with propidium iodide (PI)7-11.
Here, we demonstrate the use of the Tali instrument in performing a cell viability assay in cells expressing GFP. GFP-transduced cells are stained using the Tali Viability Kit - Dead Cell Red. The cells are then pipetted into a Tali Cellular Analysis Slide and loaded into the cytometer. Bright field, red fluorescence and green fluorescence images are captured and analyzed using assay specific algorithms. Histograms are then generated to display cell size, PI fluorescence intensity, and GFP fluorescence intensity. These parameters can then be thresholded to home in on a specific cell population.
A side-by side comparison of the Tali Image-Based Cytometer and traditional flow cytometry demonstrates that the two methods provide comparable data regarding cell viability and protein expression. However, the Tali instrument provides additional visual information about the cell population that cannot be obtained using a flow cytometer.

This protocol describes how to perform cell viability and fluorescence expression assays using the Tali Image-Based Cytometer.

Beurteilung der GFP Expression und Lebensfähigkeit Mit der Tali Image-Based Cytometer

Single-cell and population information are commonly obtained either by flow cytometry or fluorescence microscopy. However, these two methods provide ...

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental conditions and an intracellular environment that is tightly packed, sticky, and hazardous to protein stability1. The ability to dynamically balance protein production, folding and degradation demands highly-specialized quality control machinery, whose absolute necessity is observed best when it malfunctions. Diseases such as ALS, Alzheimer's, Parkinson's, and certain forms of Cystic Fibrosis have a direct link to protein folding quality control components2, and therefore future therapeutic development requires a basic understanding of underlying processes. Our experimental challenge is to understand how cells integrate damage signals and mount responses that are tailored to diverse circumstances.
The primary reason why protein misfolding represents an existential threat to the cell is the propensity of incorrectly folded proteins to aggregate, thus causing a global perturbation of the crowded and delicate intracellular folding environment1. The folding health, or "proteostasis," of the cellular proteome is maintained, even under the duress of aging, stress and oxidative damage, by the coordinated action of different mechanistic units in an elaborate quality control system3,4. A specialized machinery of molecular chaperones can bind non-native polypeptides and promote their folding into the native state1, target them for degradation by the ubiquitin-proteasome system5, or direct them to protective aggregation inclusions6-9.
In eukaryotes, the cytosolic aggregation quality control load is partitioned between two compartments8-10: the juxtanuclear quality control compartment (JUNQ) and the insoluble protein deposit (IPOD) (Figure 1 - model). Proteins that are ubiquitinated by the protein folding quality control machinery are delivered to the JUNQ, where they are processed for degradation by the proteasome. Misfolded proteins that are not ubiquitinated are diverted to the IPOD, where they are actively aggregated in a protective compartment.
Up until this point, the methodological paradigm of live-cell fluorescence microscopy has largely been to label proteins and track their locations in the cell at specific time-points and usually in two dimensions. As new technologies have begun to grant experimenters unprecedented access to the submicron scale in living cells, the dynamic architecture of the cytosol has come into view as a challenging new frontier for experimental characterization. We present a method for rapidly monitoring the 3D spatial distributions of multiple fluorescently labeled proteins in the yeast cytosol over time. 3D timelapse (4D imaging) is not merely a technical challenge; rather, it also facilitates a dramatic shift in the conceptual framework used to analyze cellular structure.
We utilize a cytosolic folding sensor protein in live yeast to visualize distinct fates for misfolded proteins in cellular aggregation quality control, using rapid 4D fluorescent imaging. The temperature sensitive mutant of the Ubc9 protein10-12 (Ubc9ts) is extremely effective both as a sensor of cellular proteostasis, and a physiological model for tracking aggregation quality control. As with most ts proteins, Ubc9ts is fully folded and functional at permissive temperatures due to active cellular chaperones. Above 30 &deg;C, or when the cell faces misfolding stress, Ubc9ts misfolds and follows the fate of a native globular protein that has been misfolded due to mutation, heat denaturation, or oxidative damage. By fusing it to GFP or other fluorophores, it can be tracked in 3D as it forms Stress Foci, or is directed to JUNQ or IPOD.

Cellular viability depends on timely and efficient management of protein misfolding. Here we describe a method for visualizing the different potential fates of a misfolded protein: refolding, degradation, or sequestration in inclusions. We demonstrate the use of a folding sensor, Ubc9ts, for monitoring proteostasis and aggregation quality control in live cells using 4D microscopy.

4D-Bildgebung von Protein Aggregation in lebenden Zellen

One of the key tasks of any living cell is maintaining the proper folding of newly synthesized proteins in the face of ever-changing environmental ...

Viability Assays for Cells in Culture

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized viability assays are expensive in terms of equipment but can be faster and more objective than manual cell counts. The present report describes the use of three such viability assays. Two of these assays are infrared and one is luminescent. Both infrared assays rely on a 16&#160;bit Odyssey Imager. One infrared assay uses the DRAQ5 stain for nuclei combined with the Sapphire stain for cytosol and is visualized in the 700 nm channel. The other infrared assay, an In-Cell Western, uses antibodies against cytoskeletal proteins (&#945;-tubulin or microtubule associated protein 2) and labels them in the 800 nm channel. The third viability assay is a commonly used luminescent assay for ATP, but we use a quarter of the recommended volume to save on cost. These measurements are all linear and correlate with the number of cells plated, but vary in sensitivity. All three assays circumvent time-consuming microscopy and sample the entire well, thereby reducing sampling error. Finally, all of the assays can easily be completed within one day of the end of the experiment, allowing greater numbers of experiments to be performed within short timeframes. However, they all rely on the assumption that cell numbers remain in proportion to signal strength after treatments, an assumption that is sometimes not met, especially for cellular ATP. Furthermore, if cells increase or decrease in size after treatment, this might affect signal strength without affecting cell number. We conclude that all viability assays, including manual counts, suffer from a number of caveats, but that computerized viability assays are well worth the initial investment. Using all three assays together yields a comprehensive view of cellular structure and function.

Therapeutic compounds are often first examined in vitro with viability assays. Blind cell counts by a human observer can be highly sensitive to small changes in cell number but do not assess function. Computerized viability assays, as described here, can assess both structure and function in an objective manner.

Die Lebensfähigkeit Assays für Zellen in Kultur

Manual cell counts on a microscope are a sensitive means of assessing cellular viability but are time-consuming and therefore expensive. Computerized ...

Experimental Approaches to Study Mitochondrial Localization and Function of a Nuclear Cell Cycle Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The nuclear-encoded proteins are transported into mitochondria guided by their mitochondria targeting sequences (MTS); however, a majority of mitochondrial localized proteins lack an identifiable MTS. Nevertheless, the fact that MTS can instruct proteins to go into the mitochondria provides a valuable tool for studying mitochondrial functions of normally nuclear and/or cytoplasmic proteins. We have recently identified the cell cycle kinase CyclinB1/Cdk1 complex in the mitochondria. To specifically study the mitochondrial functions of this complex, mitochondrial overexpression and knock-down of this complex without interfering with its nuclear or cytoplasmic functions were essential. By tagging CyclinB1/Cdk1 with MTS, we were able to achieve mitochondrial overexpression of this complex to study its mitochondrial targets as well as functions. Via tagging dominant-negative Cdk1 with MTS, inhibition of Cdk1 activity was accomplished particularly in the mitochondria. Potential mitochondrial targets of CyclinB1/Cdk1 complex were identified using a gel-based proteomics approach. Unlike traditional 2D gel analysis, we employed 2-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE) technology followed by phosphoprotein staining to fluorescently label differentially phosphorylated proteins in mitochondrial Cdk1 expressing cells. Identification of phosphoprotein spots that were altered in wild type versus dominant negative Cdk1 bearing mitochondria revealed the identity of mitochondrial targets of Cdk1. Finally, to determine the effect of CyclinB1/Cdk1 mitochondrial localization in cell cycle progression, a cell proliferation assay using a synthetic thymidine analogue EdU (5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine) was used to monitor the cells as they go through the cell cycle and replicate their DNA. Altogether, we demonstrated a variety of approaches available to study mitochondrial localization and activity of a cell cycle kinase. These are advanced, yet easy to follow methods that will be beneficial to many cell biology researchers.

Here, we outline how to study mitochondrial localization of a (cell cycle) kinase, and how to determine its sub-mitochondrial location as well as potential mitochondrial substrates/targets. Forced expression of proteins into the mitochondria provides a useful tool for studying the functional consequences of mitochondrial localization of a protein of interest.

Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Although mitochondria possess their own transcriptional machinery, merely 1% of mitochondrial proteins are synthesized inside the organelle. The ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ concentration. To do this, mitochondria utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester Ca2+. The influx of Ca2+ into the mitochondria stimulates three rate-limiting dehydrogenases of the citric acid cycle, increasing electron transfer through the oxidative phosphorylation (OXPHOS) complexes. This stimulation maintains &#916;&#936;m, which is temporarily dissipated as the positive calcium ions cross the mitochondrial inner membrane into the mitochondrial matrix.
We describe here a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using confocal microscopy. By permeabilizing the cells, mitochondrial Ca2+ can be measured using the fluorescent Ca2+ indicator Fluo-4, AM, with measurement of &#916;&#936;m using the fluorescent dye tetramethylrhodamine, methyl ester, perchlorate (TMRM). The benefit of this system is that there is very little spectral overlap between the fluorescent dyes, allowing accurate measurement of mitochondrial Ca2+ and &#916;&#936;m simultaneously. Using the sequential addition of Ca2+ aliquots, mitochondrial Ca2+ uptake can be monitored, and the concentration at which Ca2+ induces mitochondrial membrane permeability transition and the loss of &#916;&#936;m determined.

Mitochondria can utilize the electrochemical potential across their inner membrane (&#916;&#936;m) to sequester calcium (Ca2+), allowing them to shape cytosolic Ca2+ signaling within the cell. We describe a method for simultaneously measuring mitochondria Ca2+ uptake and &#916;&#936;m in live cells using fluorescent dyes and confocal microscopy.

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

Eine grafische Benutzeroberfläche für die softwaregestützte Verfolgung der Proteinkonzentration in dynamischen zellulären Vorsprüngen

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Primary Culture of Rat Adrenocortical Cells and Assays of Steroidogenic Functions

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary cultured rat adrenal cells and related functional assays (immunofluorescence staining of lipid droplet surface protein, as well as corticosterone analysis). Unlike an in vivo model, the variation of interexperiments in adrenal monolayer cultures is less and the experimental condition is easy to control. Besides, the source of rats is also more stable than other animals, like bovine ones. There are also several human adrenal cell lines (NCI-H295, NCI-H295R, SW13, etc.) that can be used in adrenal studies. However, the steroid production of these lines will still be influenced by numerous factors, which include serum lot number, passage number, mutant/loss of distinct genes, etc. Except for lacking 17&#945;-hydroxylase, the primary culture of rat adrenocortical cells is a better and more convenient technique for studying adrenal physiology. In summary, primary rat adrenal cultures could be a good in vitro platform for researchers to investigate the mechanisms of the reagent of interest in the adrenal gland system.

The hormone secreted by the adrenal cortex is vital for animals against stress and diseases. Here, we present a protocol to culture the primary rat adrenal cells. It could be a good in vitro platform for investigating the mechanisms of the reagent of interest in adrenal steroidogenesis and lipid biosynthesis.

Primärkultur von Ratte Nebennierenrindeninsuffizienz Zellen und Assays Steroidogenic Funktionen

The hormone which the adrenal cortex secretes is vital for animals against stress and diseases. The method described here is the procedure of primary ...

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase (ERK) Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation can simultaneously activate multiple cellular molecular signaling pathways. In this protocol, we show that through coupling femtosecond laser into a confocal microscope, cells can be stimulated precisely by the tightly-focused laser. Some molecular processes that can be simultaneously observed are subsequently activated. We present detailed protocols of the photostimulation to activate extracellular signal regulated kinase (ERK) signaling pathway in Hela cells. Mitochondrial flashes of reactive oxygen species (ROS) and other mitochondrial events can be also stimulated if focusing the femtosecond laser pulse on a certain mitochondrial tubular structure. This protocol includes pretreating cells before photostimulation, delivering the photostimulation by a femtosecond laser flash onto the target, and observing/identifying molecular changes afterwards. This protocol represents an all-optical tool for related biological researches.

Photostimulation by Femtosecond Laser Activates Extracellular-signal-regulated Kinase ERK Signaling or Mitochondrial Events in Target Cells

Tightly-focused femtosecond laser can deliver precise stimulation to cells by being coupled into a confocal microscopy enabling the real-time observation and photostimulation. The photostimulation can activate cell molecular events including ERK signaling pathway and mitochondrial flashes of reactive oxygen species.

Photostimulation durch Femtosecond Laser aktiviert extrazellulär-signalregulierte Kinase (ERK) Signalisierung oder Mitochondrienereignisse in Zielzellen

Direct control of cellular defined molecular events is important to life science. Recently, studies have demonstrated that femtosecond laser stimulation ...