Nur bindende Proteine steuern mehrere biologische Prozesse. Diese FLAG-Biotin CLIP-seq Methode, um die spezielle und zeitliche Anordnung von RNAs und RBPs in Säugetierzellen global zu profilieren. Diese Methode ermöglicht eine effiziente Detektion von direkten proteingebundenen RNAs ohne SDS-PAGE und die Membranübertragungsverfahren.
Im Vergleich zu herkömmlichen CLIP-seq ist isotopfrei und es erfordert keine proteinspezifischen Antikörper. Beginnen Sie damit, etwa 3 Millionen embryonale Mundzellen mit einer 10-Zentimeter-Platte zu beschichten und über Nacht zu inkubieren. Am nächsten Tag das Medium mit einem Vakuum entfernen und die Zellen mit zwei Millilitern 0,25%Trypsin EDTA für zwei Minuten bei Raumtemperatur behandeln.
Das Trypsin mit vier Millilitern frischem MESC-Medium ablöschen und die Zellen in ein 15-Milliliter-Zentrifugenrohr übertragen. Dann zentrifugieren Sie sie bei 300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius und entfernen Sie den Überstand. Die Zellen in vier Milliliterkaltem PBS aufhängen und zur Vernetzung wieder auf die 10-Zentimeter-Platte übertragen.
Strahlen Sie die Zellen mit einem 254 Nanometer UV-Licht aus und übertragen Sie die vernetzten Zellen dann in eine 15-Milliliter-Röhre. Drehen Sie diese Zellen bei 300 mal G für drei Minuten bei vier Grad Celsius, entfernen Sie dann den Überstand und lysen Sie die Zellen mit 500 Mikroliter Puffer A, die nach Manuskriptanweisungen hergestellt werden. Übertragen Sie die Zellen in ein RNAse-freies 1,5-Milliliter-Rohr und bebrüten Sie sie bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation für 30 bis 60 Minuten.
Behandeln Sie das Lysat mit 30 Mikroliter DNAse 1 bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann stoppen Sie die Reaktion, indem Sie vier Mikroliter 0,5 Molaren EDTA hinzufügen. Drehen Sie das unlösliche Pellet durch Zentrifugieren bei 12.000 mal G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius, und übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 1,5-Milliliter-Rohr.
Übertragen Sie das Zelllysat in vorausgeglichene FLAG-Perlen, und brüten Sie die Probe bei vier Grad Celsius, während Sie sich für zwei bis vier Stunden drehen. Zentrifugieren Sie nach der Inkubation die Perlen zwei Minuten lang bei 3000 mal G und entfernen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 Mikroliter Puffer A in die Probe und inkubiert bei 4 Grad Celsius für fünf Minuten, dann drehen Sie die Perlen und entfernen Sie den Überstand.
Wiederholen Sie die Wäsche mit Puffer A, gefolgt von zwei Wäschen mit vorgekühltem Puffer B.To elute mit einem drei X FLAG-Peptid, bereiten Sie die Elutionslösung vor, wie im Textmanuskript beschrieben, und drehen Sie die FLAG-Perlen herunter. Entfernen Sie den Überstand mit einer schmalen Endpipettenspitze und fügen Sie 200 Mikroliter der drei X FLAG Elutionslösung zu jeder Probe hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 Minuten bei vier Grad Celsius mit sanfter Rotation.
Dann drehen Sie die Perlen für zwei Minuten bei 3000 mal G.Transfer die Supernate auf ein frisches Rohr und wiederholen Sie die Elution zweimal. Sparen Sie 5% der Eluenten für western blot analysis oder Silberfärbung, um die Wirksamkeit der FLAG-Immunpräzipitation zu überprüfen. Übertragen Sie die gezogenen Eluenten auf vorbereitete Streptavidinperlen und drehen Sie die Proben sanft bei vier Grad Celsius für ein bis drei Stunden oder über Nacht.
Dann sammeln Sie die Perlen auf einem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Puffer C mit sanfter Rotation für fünf Minuten pro Wäsche. Als nächstes waschen Sie die Perlen zweimal mit 500 Mikroliter Puffer D und zweimal mit 500 Mikrolitereiseis PNK-Puffer, sammeln Sie die Perlen auf dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Überstand zwischen den Waschungen.
Um eine partielle RNA-Verdauung durchzuführen, fügen Sie 100 Mikroliter MNA-Lösung zu jeder Probe hinzu und Wirbel auf 37 Grad Celsius mit einem thermischen Mischer für 10 Minuten eingestellt. Sammeln Sie die Perlen mit einem magnetischen Ständer für 30 Sekunden und entfernen Sie den Überstand. Waschen Sie sie dann mit PNK-EDTA-Puffer, Puffer C und PNK-Puffer gemäß Manuskriptanweisungen.
Sammeln Sie die Perlen mit dem magnetischen Ständer und entfernen Sie den Puffer. Dann fügen Sie die CIP-Reaktionsmischung hinzu und wirbeln Sie die Perlen bei 37 Grad Celsius mit einem thermischen Mischer für 10 Minuten. Waschen Sie die Perlen schnell zweimal mit 500 MikrolitereisepEDTA-Puffer, gefolgt von zwei Wäschen mit 500 Mikrolitereiskaltem PNK-Puffer.
Nach den Wassen 40 Mikroliter dreier Hauptlinkerligationsmischungen zu den Perlen hinzufügen und bei 16 Grad Celsius mit einem Thermomischer drei Stunden oder über Nacht wirbeln. Eine effiziente Ligation des Linkers zu den Verbündeten ist für dieses Experiment von entscheidender Bedeutung. Überprüfen Sie das Reaktionsrohr gelegentlich, um sicherzustellen, dass diese während der Ligation nicht ausfallen.
Wiederholen Sie nach der Inkubation die Waschungen mit PNK EDTA- und PNK-Puffern, fügen Sie 40 Mikroliter PNK gemischt in die Perlen und wirbeln Sie sie bei 37 Grad Celsius mit dem Thermomischer für 10 Minuten. Waschen Sie die Perlen mit PNK EDTA- und PNK-Puffern, und fahren Sie dann mit der RNA-Isolierung fort, wie im Textmanuskript beschrieben. Im Vergleich zu FLAG-vermittelten oder Streptavidin vermittelte ein Schritt Affinitätsreinigung, FLAG-Biotin Tandem-Reinigung entfernt fast alle Kern gereinigtproteine, Vermeidung der Kontamination der indirekten Protein-RNA-Wechselwirkungen.
LIN28 und WDR43, Fbio CLIP-seq wurde mit Maus embryonalen STEM-Zellen durchgeführt. Insgesamt wurden für LIN28 bzw. WDR43 rund 7,7 Millionen bzw. 2,2 Millionen Eindeutige Lesevorgänge abgerufen. Der Vergleich der Trackansichten zeigt unterschiedliche Bindungsmuster im RN45 Pre-rRNA-Lokus.
Die vernetzten Seiten auf dem GGA G Motiv der pre-let7-g RNA von LIN28, Fbio CLIP-seq oder identifiziert. Darüber hinaus wurden angereicherte RNA-Motive in den Bindungsstellen und der Prozentsatz mutierter Nukleotide in verschiedenen Mutationsarten bestimmt. Zeigt, dass LIN28 es vorzieht, an das Gennukleotid zu binden.
Nun, um 22:00 Uhr, dieses Protokoll, ist es wichtig, die Wirksamkeit der Immunpräzipitation zu bestätigen, um sicherzustellen, dass das Protein nur Komplexe erfolgreich gereinigt wurden.
