Es ist schwierig, das Wirtsinfektionsstadium von T.cruzi in Experimenten zu verwenden, da Amastigot ein obligate intrazellulärer Parasit ist. Unsere Kultivierungstechnik ermöglicht es dem Amastigot, sich vorübergehend außerhalb der Wirtszelle zu replizieren, so dass wir Experimente direkt auf diesem klinisch relevanten Stadium des Parasiten durchführen können. Demonstriert wird das Verfahren von Yukie Akutsu, einem Techniker unseres Instituts.
Pflegen Sie eine WirtParasiten-Kokultur gemäß den Manuskriptanweisungen. Wenn der Cas9-exemittierende Parasit zur Differenzierung bereit ist, sammeln Sie den Überstand in ein konisches Rohr und überprüfen Sie die Probenqualität unter dem Mikroskop. Wenn es eine signifikante Anzahl von extrazellulären Amastigoten gibt, führen Sie ein Ausschwimmverfahren durch, um die Trypomastigoten zu isolieren.
Drehen Sie die Mischung aus Trypomastigotes und Amastigotes für fünfzehn Minuten als 2, 100 mal G.Dann entsorgen sie den größten Teil des Überstandes und lassen Sie 0,5 bis 1 Milliliter Medium in der Röhre. Kappen Sie das Rohr locker und bebrüten Sie das Pellet bei 37 Grad Celsius für ein bis zwei Stunden, wodurch die aktiven Trypomastigoten aus dem Pellet schwimmen können. Nach der Inkubation den Überstand mit den Trypomastigoten auf ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen.
Drehen Sie es nach unten, und setzen Sie das Pellet mit 5 Milliliter DMEM wieder aus. Übertragen Sie den Parasiten in einen T-25-Kulturkolben und bebrüten Sie den Kolben bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid in einem befeuchteten Inkubator. Rund 95% der Parasiten werden sich nach 24 Stunden in Amastigoten differenzieren.
Zentrifugieren Sie die Kultur der extrazellulären Amastigoten für 15 Minuten bei 2, 100 mal G, und entsorgen Sie den Überstand. Setzen Sie das Pellet mit Elektroporationspuffer mit bereitgestellter Ergänzungslösung für eine endgültige Zelldichte von ein mal 10 bis 8. Zellen pro Milliliter aus. Aliquot 100 Mikroliter der resuspendierten Parasiten in 1,5 Liter Mikrozentrifugenröhren.
Dann fünf bis 10 Mikrogramm Guide RNA hinzufügen und vorsichtig durch Pipettieren mischen. Übertragen Sie das Gemisch auf eine Zwei-Millimeter-Elektroporationsküvette und wenden Sie einen Impuls mit der Elektroporationsvorrichtung an. Dann den Küvetteninhalt in einen T-25-Kolben geben, der fünf Milliliter vorgewärmtes LIT-Medium enthält, die Kappe locker lassen und den Kolben bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid brüten lassen.
Überwachen Sie das Zellwachstum entweder durch Fortsetzung der axtischen Kultivierung oder als intrazelluläre Amastigoten nach einer Wirtszellinfektion. Wenn Sie das Zellwachstum als axtische Amastigoten überwachen, schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um die extrazellulären Amastigoten in die Lösung wieder auszusetzen, und mischen Sie 20 Mikroliter der Kultur mit einem Mikroliter Propidiumjodidlösung in einem Mikrozentrifugenrohr. Es ist wichtig, den Kulturkolben nicht länger als nötig außerhalb des Inkubators zu lassen, da die Temperatur einer der Faktoren ist, die eine axtische Proliferation von Amastigoten ermöglichen.
Tragen Sie die Probe auf ein Hämozytometer auf und beobachten Sie sie unter einem Fluoreszenzmikroskop. Dann zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Amastigoten, die nicht durch Propidiumiodid gefärbt sind. Um das Wachstum von Knockout-Zellen als intrazelluläre Amastigoten zu überwachen, wirt Seed 3T3-Zellen in einer 12-Well-Platte mit DMEM.
Einen Tag nach der Elektroporation sammeln Sie die Knockout-Amastigoten durch Zentrifugation, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Parasiten mit zwei MilliliterDM. Entfernen Sie das Medium aus der Hostzellenkultur, und fügen Sie die resuspendedn amastigotes hinzu. Inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius unter 5% Kohlendioxid für zwei Tage, was es den Amastigoten ermöglicht, eine Infektion zu etablieren.
Nach den zwei Tagen die extrazellulären Amastigoten außerhalb der Wirtszellen mit DMEM wegwaschen und frisches DMEM hinzufügen. Setzen Sie die Inkubation für weitere zwei Tage fort, und visualisieren Sie dann die Kerne der Wirtszellen und die intrazellulären Amastigoten. Es wurde nachgewiesen, dass T.Cruzi-Amastigoten, die mit Guide RNA gegen das essentielle Gen TcCGM1 transfiziert wurden, einen signifikanten Wachstumsfehler im Vergleich zu einer Kontrollgruppe aufweisen.
Bei der Überwachung des Wachstums als intrazelluläre Amastigoten ist der Anteil der Mitwirtskerne, die mit T.Cruzi-Kernen assoziiert sind, in der TcCGM1-Knockout-Gruppe im Vergleich zur Kontrolle deutlich niedriger. Im Gegenteil, die Transfektion von Guide RNA gegen eines der Paraflagellar-Stabproteine TcPAR1 hat keinen signifikanten Einfluss auf das Zellwachstum nach vier Tagen axtischer Kultivierung oder hemmt das Wachstum von intrazellulären Amastigoten. Fünf Tage nach der Infektion ist die Anzahl der Trypomastigoten, die aus der Wirtszelle entstehen, in der TcPAR1-Knockout-Kokultur jedoch deutlich geringer als in der Kontroll-Kokultur.
Darüber hinaus wirkten die differenzierten Trypomastigoten innerhalb der Wirtszelle in der Kontrollgruppe aktiver als die in der K.o.-Gruppe. Diese Methode kann auch verwendet werden, um die Auswirkungen von exogenen Genen auf amastigote Stadium zu studieren, anstatt Guide RNA in Cas9-exprimierendes Amastigot zu transfizieren, können Sie das Plasmid in ein Wildtyp-Amastigot transsektieren, um ein exogenes Gen auszudrücken.
