Die Untersuchung der Genfunktion und Krankheit wird durch die Auszucht der menschlichen Bevölkerung behindert. Die unterschiedlichen genetischen Hintergründe patientenspezifischer und kontrollierbarer iPS-Zelllinien können die Differenzierungseffizienz und Phänotypen in einem gegebenen funktionellen Test beeinflussen. Die Verwendung genetisch identischer oder isogener Linien, bei denen der einzige Unterschied darin besteht, dass die besondere Mutation von Interesse entscheidend ist, um diese Probleme zu überwinden.
Viele menschliche Krankheiten werden durch heterozygote Mutationen verursacht, die mit dem CRISPR-Cas9-System nur schwer zu erzeugen sind. Dies ist auf die Erzeugung von Indelmutationen im nicht zielgerichteten Allel zurückzuführen, die bei sehr hoher Frequenz auftreten können. Unsere Technik überwindet dieses Problem, indem sie zwei Reparaturvorlagen verwendet, von denen nur eine die Mutation des Interesses birgt.
Jeder Forscher, der diese Technik ausprobiert, sollte in der menschlichen pluripotenten Stammzellkultur versiert sein. Die Video-Demonstration der Kolonie-Picking wird hilfreich sein, um die richtige Größe und Morphologie sowie Technik für die Kommissionierung und Dassiebung zu zeigen. Die Demonstration dieses Verfahrens wird Leo Cardenas sein.
Zu Beginn, Platte menschliche ESCs auf bestrahlte MEFs in einer 6-Well-Platte. Bereiten Sie den Transfektionsmaster-Mix vor. Durch Pipettieren mischen und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubieren.
Wenn die Zellen 70 bis 80% Konfluenz erreichen, dann fügen Sie die Transfektion Master-Mix tropfen klug zu jedem Brunnen mit Zellen und inkubieren bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden. Wechseln Sie die Medien alle 24 Stunden. Um die Zellen zu ernten, bebrüten Sie zunächst die Zellen mit Triple E für drei Minuten bei Raumtemperatur, um MEFs enzymatisch zu entfernen.
Fügen Sie 0,5 Milliliter HESC-Medium mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer hinzu. Pelletzellen bei 300 mal g für drei Minuten und re-suspend in 0,5 Milliliter des menschlichen ESC-Mediums mit 10 Mikromolaren ROCK-Hemmer. Filtern Sie die Zellsuspension durch eine 35-Mikron-Zell-Siebkappe in ein Fünf-Milliliter-Rohr.
Mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung, Gate auf lebenden Zellen und sortieren Sie die grünen fluoreszierenden protein-positiven Zellen. Als nächstes übertragen Sie maximal 1,5 mal 10 auf die vier sortierten Zellen direkt in eine 10-Zentimeter-Schale, die mit einer bis drei Kellermembranmatrix und bestrahlten MEFs und menschlichem ESC-Medium mit ROCK-Hemmer beschichtet ist. Täglich mit dem menschlichen ESC-Medium ohne ROCK-Hemmer das Medium wechseln.
Nach 10 bis 15 Tagen haben kolonien einen Durchmesser von etwa einem bis zwei Millimetern. Verwenden Sie unter dem Mikroskop eine P200-Pipette, um vorsichtig einen einzelnen Klon zu kratzen und Zellen in die Pipette zu ziehen. Dispergieren Sie die Zellen in einem Brunnen einer 96-Well-Platte, indem Sie drei- bis viermal in dem mit der Kolonie erstellten Medium sanft pipetieren.
Dann pflücken Sie 20 Kolonien für jede Führungs-RNA und geben Sie in PCR-Streifenröhren zum Screening aus. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Jetzt, inkubieren Zellpellets in 20 Mikroliter Proteinase K Puffer, um DNA und Wirbel kräftig zu isolieren.
Zentrifuge bei 10.000 mal G für fünf Minuten. Führen Sie als Nächstes die PPCR der bearbeiteten DNA durch. Fügen Sie in die Röhren 20 Mikroliter einer Master-Mischung, einschließlich Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen, entwickelt, um die Region des Interesses zu verstärken, sowie fünf Mikroliter der Proteinase K Digest.
Verwenden Sie genomische DNA, die aus der Kontroll-iPSC-Leitung isoliert ist, um ein sauberes Amplikon zu bestätigen, wenn Sie die Screening-PCR durchführen. Bewerten Sie Größenänderungen von PCR-Produkten nach einer Stunde Elektrophorese bei 70 bis 90 Volt bei einem Volumen-Agarose-Gel von 2,5 % volumenmäßig. Jeder Größenunterschied deutet auf Spaltung hin.
Um die einsträngige Oligo-DNA und die CRISPR-Cas9-Plasmide zu transfekten, verfestigen Sie die Zielzelllinie in einer 6-Well-Schale auf bestrahlten MEFs, um nach einer nächtlichen Inkubation 70 bis 80 % Konfluenz zu erreichen. Richten Sie die Transfektionsreaktion wie beschrieben ein. Mischen Sie die Reaktion durch Pipetten und inkubieren Sie für 15 Minuten bei Raumtemperatur.
Dann fügen Sie die Transfektion Reaktion Mischung Tropfen klug zu den Zellen. Bereiten Sie die Zellen nach 48 Stunden wie bisher auf die Zellensortierung vor. Etwa 10 Tage nach der Beschichtung einzelner Zellen verwenden Sie eine 200-Mikroliter-Pipette, um Kolonien in PCR-Streifenröhren und in einen Brunnen einer 12-Well-Platte zu pflücken, die mit Gelatine und MEFs vorbeschichtet ist.
Übertragen Sie 100 Mikroliter der Zellen auf jeden Brunnen einer 24- oder 48-Well-Platte, die zuvor mit Gelatine beschichtet war und bestrahlte MEFs im menschlichen ESC-Medium mit ROCK-Hemmer. Verwenden Sie die restlichen 100 Mikroliter für die DNA-Isolierung. Um die erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA zu überprüfen, nehmen Sie fünf Mikroliter DNA, die aus jeder Kolonie isoliert sind, um PCR mit den zuvor entwickelten Screening-Primern durchzuführen.
Reinigen Sie die PCR-Produkte und bereiten Sie die 40 Mikroliter reparierender Enzymverdauung mit der einzigartigen Enzym-Site vor, die in der Einstrang-Oligo-DNA erstellt wurde. Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und inkubieren Sie bei der vom Hersteller empfohlenen Temperatur für ein bis drei Stunden. Dann visualisieren Sie die verdauten PCR-Produkte, die mit einem Ladefarbstoff auf einem Volumenvon 1,5% Gewicht von Ethidiumbromid Agarose Gel, Elektrophorese bei 80 bis 100 Volt für 40 Minuten hinzugefügt.
Wenn eine erfolgreiche Integration der einstrangigen Oligo-DNA stattgefunden hat, sequenzspezifische Mutationen mit einem verschachtelten Primer. In dieser Studie wurde für die RNA-Führung ein 100-Basispaar-Band aus einem 1,5%agarose Gel entfernt. Nach der Zelltransfektion wurde die Validierung des RNA-Schnitts mit einem 2,5%agarose Gel visualisiert.
Ein PCR-Produkt mit 180 Basenpaaren zeigte eine ungeschnittene Steuerung und verschiedene Klone mit Bandverschiebungen, die auf die Indelbildung hindeuten. Verschiedene Führungs-RNAs hatten unterschiedliche Schnitteffizienzen. Um ein erneutes Schneiden der bearbeiteten Allele durch CRISPR-Cas9 zu vermeiden, wurde die PAM-Sequenz mit einer G-zu-A-Stummmutation modifiziert.
Eine stille Mutation in der PAM-Sequenz erzeugte eine eindeutige Einschränkungssite, die eine erfolgreiche Integration in ein oder zwei Allele ermöglicht. Genombearbeitete Stammzelllinien können in nachgelagerten Differenzierungen und funktionellen Assays verwendet werden, um die Wirkung einer bestimmten Mutation auf die menschliche Entwicklung und Krankheit zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die Erzeugung von isogenen Zelllinien mit einer spezifischen heterozygoten oder homozygoten Mutation, die in einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten involviert ist.
Diese Krankheitsmodelle ebnen den Weg für die Entwicklung neuer zellulärer Therapien und bieten Plattformen für die Arzneimittelentdeckung.
