Diese Forschung wurde durch USDA-NIFA Award 2015-67015-23488, Roger Cone finanziert. Die Autoren danken Dr. Ronald Phelps für die Beschreibung der Brut Aktienauswahl Kriterien im Video. Ahmed Elaswad und Karim Khalil möchte der ägyptischen kulturellen und pädagogischen Bureau in Washington DC zu danken, für ihre Promotion Forschungsförderung.

Dieses Experiment wurde durchgeführt am Fisch Genetics Research Unit, E. W. Shell Fisheries Research Center, Auburn University, AL. Alle experimentelle Protokolle in diesem Experiment verwendet wurden von der Auburn University institutionelle Animal Care und Use Committee (AU-IACUC) genehmigt, bevor das Experiment ins Leben gerufen wurde. In der Materialtabelle finden Sie eine Liste der Geräte und Zubehör in diesem Experiment verwendet. Im folgenden sind die Schritte und Verfahren für die Vorbereitung und Mikroinjektion Channel Catfish einzelligen Embryonen, wie in Abbildung 1dargestellt.
1. Brut Aktienauswahl und laichen
<ol><li>Wählen Sie gesunde Channel Catfish Brut bestand aus dem Stamm oder genetische Linie von Interesse. Channel Catfish Männchen und Weibchen sollen gute sekundären Geschlechtsmerkmale aufweisen.</li>
	<li>Wählen Sie Männer, die einen breiten muskulösen Kopf, der breiter als der Rest ihres Körpers mit gut ausgebauten Genital-Papille. Dunkle Farbe, Narben und Wunden von territorialen Kämpfen sind auch Anzeichen für eine sexuelle Bereitschaft. Wählen Sie Frauen, die Köpfe, die schmaler als der Rest ihres Körpers sind, und haben Sie weiche, greifbar, gut abgerundeten Bauch. Stoppen Sie für die Richtigkeit und um zu vermeiden, betont die Fische während der ersten Behandlung Fütterung die Weibchen ca. 2-3 Tage vor der Prüfung ihre Bereitschaft zum Laichen.</li>
	<li>Durchführen Sie Fisch, Handhabung, schnell, aber sorgfältig. Zum Umgang mit Stress zu reduzieren, führen Sie alle Prozeduren, die Handhabung Weibchen halten Fische laichen Taschen (32 mm Größe Mesh) erfordern.</li>
	<li>Kurz vor Hormon Injektion induzieren Eisprung messen Sie das Körpergewicht der Weibchen.</li>
	<li>Hängen Sie die laichen Taschen mit Frauen im Inneren in eine Durchströmung der Tank mit kontinuierlichen Wasserfluss und ausreichende Belüftung.</li>
	<li>Aseptisch, laden Sie die Implanter, die eine 14 G-Nadel mit 85 µg/kg luteinisierendes Hormon Hormon analog (LHRHa) Implantat die Freigabe hat. Spülen Sie die Injektionsstelle (dorsale Muskulatur) mit steriler Kochsalzlösung 0,9 % vor der Injektion. Legen Sie die Implanter in einem 45°-Winkel und lassen Sie das Implantat. Zurückziehen der Nadel und streichen Sie die Injektionsstelle mit einem zuvor in 70 % igem Ethanol getränkten Wattebausch.</li>
	<li>Ort der Laich Tasche in den Tank so, dass die Fische in vollständig eingetaucht sind Wasser 15-20 cm unter der Wasseroberfläche. Ausreichende Belüftung (über 5 ppm gelöste Sauerstoff) und gute Wasserqualität sind wichtig für den Eisprung hochwertige Eier.</li>
	<li>Vorherzusagen Sie der Eisprung-Zeit anhand der Wassertemperatur mit Grad-Stunde (h) Beziehung35. Grad-h Reaktionszeit = Zeit zwischen Hormon Injektion und Eisprung (h) * Wassertemperatur (° C). Zum Beispiel für eine Grad-h Reaktionszeit von 900-1000, ein Weibchen erwartet zum Laichen bei 36-40 h von Hormon Einspritzzeit bei 25 ° C. In der Regel erfolgt die erste Kontrolle nach Eiern ca. 36 h nach der Hormon-Injektion und dann in 4 h Intervall.</li>
	<li>Um Eisprung zu überprüfen, heben Sie vorsichtig die Laich Tasche über der Wasseroberfläche während Sie auf der Suche nach der Eiern, die in der Laichzeit Tasche angebracht sind. Mindestens 10 Eiern sehen bedeutet diese weibliche Eisprung und bereit zum Abisolieren von Hand.</li>
</ol>2. Sperma Vorbereitung
Hinweis: Spermien können ein paar h vor dem erwarteten Eisprung vorbereitet werden.
<ol><li>Einschläfern Sie Männchen durch ein perkussiver Schlag auf den Kopf ohne Narkose, da Anästhesie Spermienqualität negativ beeinflussen könnte.</li>
	<li>Sammeln Sie die Hoden in eine kleine Waagschale, entfernen Sie jedes Gewebe zu und waschen Sie sie mit 50 mL 0,9 % Kochsalzlösung, Blut, zu entfernen, wenn nötig. Gut entwickelte Hoden sind weiß mit vielen villiform Projektionen ( Abbildung 2).</li>
	<li>Bestimmen Sie das Gewicht der Hoden.</li>
	<li>Um die Sperma-Lösung für die Befruchtung der Eizelle vorzubereiten, übertragen Sie die Hoden in die Mitte eines 100 cm2 100 µm Netzes mit Pinzette. Falten Sie dem Netz mit den Hoden im Gedränge der Hoden und Filtern Sie das Sperma in ein 50 mL Sammelröhrchen. Dies kann durch Druck auf die Hoden innerhalb des Netzes gegen den Rand des dem Sammelrohr über den Daumen. Verwenden Sie 0,9 % Kochsalzlösung, um das Sperma aus dem Netz in dem Sammelrohr zu waschen. Kochsalzlösung kann bis zu 10 mL/g Hoden hinzugefügt werden.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Konzentration der Spermien, überprüfen Sie die Motilität und Durchführbarkeit zu. Hinweis: Konzentration kann durch zählen der Samenzellen in einem bekannten verdünnten Volumen Milt mit einem Hemocytometer bestimmt werden. Alternativ kann die Dichte der Spermien durch die Auswertung der optischen Dichte Milt mit einem Spektralphotometer geschätzt werden. Bei dieser Methode wird die Absorption bei 505 nm Wellenlänge im Vergleich zu einer Regelkarte, die zuvor für die Absorption der verschiedenen Konzentrationen von Spermien36vorbereitet wurde. Beweglichkeit der Spermien kann unter dem Mikroskop als die Zeit von der Aktivierung der Spermien bis Beendigung der Spermien Bewegung (Motilität Dauer genannt)37überprüft werden. Die Lebensfähigkeit der Spermien kann durch Färbung der Spermien mit selektiven Farbstoffe wie Trypan blau, die nur nicht lebensfähigen Samenzellen notwendig ist, während lebensfähige Samenzellen ungefärbten bleibt bestimmt werden. Diese Mikroinjektion Verfahren ist dies jedoch nicht erforderlich, wenn die Hoden gut entwickelt sind.</li>
	<li>Sperma in 0,9 % Kochsalzlösung aus Schritt 2.5 bei 4 ° C aufbewahren und innerhalb von 24 h nach der Zubereitung verwenden.</li>
</ol>3. Ei-Sammlung und Düngung
<ol><li>Eine sehr dünne Schicht Gemüse Verkürzung auf einen sauberen, trockenen Pfanne laichen 20 cm Durchmesser.</li>
	<li>Legen Sie das Weibchen in der Narkose Lösung mit 100 ppm gepufferten Tricaine Methan Sulfonate mit Natriumbicarbonat (pH-Wert Endlösung sollte 7.0) bis der Fisch vollständig betäubt38ist. Achtung: Tricaine Methan Sulfonate möglicherweise irritierend Einatmen aufgenommenen oder durch die Haut absorbiert.</li>
	<li>Sorgfältig, entfernen Sie die Fische aus dem Laich Beutel und Tauchen sie in 0,9 % Kochsalzlösung die Narkose Lösung abwaschen. Trocknen Sie die Fische ab, komplett mit einem sauberen Tuch, die Entfernung von der Schleimschicht auf der Körperoberfläche der Fische zu vermeiden.</li>
	<li>Die Gegend um den Schlot, einschließlich die Bauchflossen, zur Befestigung der Eier während der Hand abstreifen zu verhindern, dass zuweisen Sie pflanzliche Verkürzung.</li>
	<li>Hand Streifen die Eiern in die gefettete Pfanne Laichen durch sanften Druck auf die Eierstöcke. Gute Eiern sollte frei fließen, werden goldgelb in der Farbe und haben minimale oder keine Klumpen oder Blutgerinnsel (Abbildung 2). Vermeiden Sie den Kontakt zwischen Eiern und Wasser vor der Befruchtung, da Wasser Mikropyle Schließung fördert.</li>
	<li>Um die Eizellen für die Mikroinjektion befruchtet, übertragen Sie 200 – 300 Eiern auf eine gefettete Pfanne Laich. Gefettete Plastikpflanze Etiketten dient als ein Löffel, um Eiern in die gefettete Pfanne Laichen zu übertragen. 1 – 2 mL der Lösung Spermien (aus Schritt 2.5) die Eier hinzufügen und vorsichtig mischen. Das Verhältnis von Spermien zum Ei sollte ungefähr 11.000 Sperma/Ei.</li>
	<li>Fügen Sie Süßwasser, um die Eizellen, Spermien und Eizellen zu aktivieren. Fügen Sie genug Wasser, um etwas die Eiern bedecken. Vorsichtig schwenken die Eizellen für 1 – 2 min. 30 S. Befruchtung stattfinden sollte. Es ist wichtig, die Eizellen befruchtet, die in einer einzigen Schicht angeordnet sind. Wels-Eiern haften macht es schwierig, mehrere Schichten von Embryonen microinject zueinander.</li>
	<li>Fügen Sie mehr Süßwasser zu den befruchteten Eiern und lassen Sie die Eiern 10 – 15 Minuten aushärten.</li>
	<li>Decken Sie den Laichen Topf mit den restlichen unbefruchteten Eiern durch ein nasses Handtuch um zu verhindern, trocknen und in ein paar Stunden zu befruchten. Befruchtung kann in gewissem Sinne gestaffelt erfolgen, z. B., einer Charge von 200 – 300 Eiern lässt befruchtet alle 30 – 60 min um eine kontinuierliche Versorgung der Embryonen im einem Zell-Stadium für die Mikroinjektion und Kontrolle nicht injiziert Embryonen zu gewährleisten. Kontakt zwischen das nasse Handtuch und den Eiern zu vermeiden, da die Eizellen an das nasse Handtuch macht es schwierig, sie zu entfernen halten können. In diesem Protokoll Eiern innerhalb von 2 – 3 h nach dem Ausschalen befruchtet wurden effizient mikroinjiziert und hatte ähnliche Erfolge Eier befruchtet sofort nach dem Ausschalen.</li>
</ol>4. Nadel ziehen und be-
<ol><li>Ziehen Sie eine 1,0 mm OD Borosilikatglas Kapillare in 2 Nadeln (Abbildung 3). Speichern Sie die Nadeln in einer Pappschachtel mit einem Stück Schwamm, in denen mehrere Einschnitte vorgenommen wurden. Um die Nadel zu brechen zu vermeiden, sollte der Durchmesser des Schwammes kleiner als die Länge des Stiels Nadel.</li>
	<li>Öffnen Sie die Nadelspitze durch brechen ein kleines Stück von der Nadel dünnste Region mit einem spitzen Gegenstand. Alternativ öffnen Sie die Nadel durch Kneifen aus der dünnsten Region der Spitze mit der Pinzette unter die Lupe genommen.</li>
	<li>Bereiten Sie die Injektionslösung durch Mischen von gRNA(s) mit Cas9 Protein. Andere Arten von RNS oder Protein können auch mit dem gleichen Verfahren injiziert werden. In diesem Protokoll wurden gRNAs auf zwei der Channel Catfish immun Verwandte Gene, Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose bindende Lektin (RBL) gen entworfen und zubereitet nach Shah Et Al. mit dem Einsatz von einem High-Fidelity Taq Polymerase32,39. Die genomische Ziele für gRNAs waren 5' GGA GGT GAA GCA CGT CGA GGA 3' für TICAM 1-gen (Abbildung 4) und 5' GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' Exon 1 RBL-gen mit Protospacer angrenzenden Motiv (PAM) Sequenz unterstrichen (Abbildung 6).<ol>
<li>BLAST Guide RNA Ziele gegen das Channel Catfish Genom-Sequenz und wählen Sie die mit keine potenziellen Ziel-Sites.</li>
		<li>Farbe der gRNA/Cas9 Protein mischen sich zu einem Drittel des Gesamtvolumens fügen Sie Phenol Rot hinzu.</li>
		<li>Die Endkonzentration von gRNA/Cas9 Protein-Mix mit Nuklease freies Wasser so einstellen, dass jeder Embryo mit 50 eingespritzt wird nL, ca. 2,5 ng gRNA und 7,5 ng Cas9 Protein enthält. Inkubieren Sie die Mischung für 10 min auf Eis vor Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laden Sie mit einem Microloader 5 – 10 µL der gRNA/Cas9 Mischung in die Injektionsnadel durch Einfügen des Microloader in der Nadel Stamm und vertreiben die Mischung langsam beim Einfahren der Microloader Spitze (Abbildung 3). Einfangen von Luftblasen im Inneren zu vermeiden.</li>
	<li>Legen die Nadel auf die Mikropipette Halter sorgen für eine enge Verbindung und dann die Mikromanipulator Halterung befestigen. Stabile Freizügigkeit zu gewährleisten. Druck für die Mikroinjektion durch die Stickstoff-Zylinder öffnen und Anpassen des Druckreglers. Hinweis: Das Volumen der Injektion kann durch den Druck, der Durchmesser der Nadel Öffnung und Einspritzdauer beeinflusst werden. Bestimmen Sie die Lautstärke auf Spritzen, Spritzen in einen Tropfen von Mineralöl auf ein Hemocytometer gelegt. Bei Bedarf kann der Druck, Dauer der Spritze und Nadel Durchmesser angepasst werden erhöhen oder verringern Sie die Lautstärke der Injektion. Injizieren Sie mehrere Male in das Mineralöl, einheitliche Lautstärke zu gewährleisten.</li>
</ol>5. die Mikroinjektion von Wels Embryonen
<ol><li>Eine sehr dünne Schicht Gemüse zu einer sauberen Petrischale 100 mm kürzen.</li>
	<li>Eine gefettete Plastikpflanze Zeichennutzung, 50 – 100 Eiern aus der Befruchtung Pfanne auf der Petrischale übertragen und bedecke sie mit Holtfreter Lösung (Materialtabelle). Richten Sie die Eiern gegeneinander in einer einzigen Schicht. Diese Ausrichtung sollten die Eizellen bei der Mikroinjektion in Position zu halten.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale mit den Eiern auf der Bühne des Mikroskops und halten Sie ihn mit einer Hand. Senken Sie die Nadel mit der anderen Hand (Abbildung 3), bis es das Chorion und das Eigelb in einer glatten Bewegung durchbohrt. Die Spitze der Nadel sollte so nah wie möglich an der Blastodisc sein, vor der Auslieferung das Injektionsmaterial.<ol>
<li>Drücken Sie das Pedal um das Injektionsmaterial in das Eigelb zu liefern. Wenn die Blastodisc nicht deutlich sichtbar ist, kann das Injektionsmaterial in verschiedenen Orten im Eigelb verteilt werden. Um dies zu erreichen, wird die Nadel bis zum anderen Ende das Eigelb eingefügt, dann drücken des Pedals und zurückziehen der Nadelöhrs werden gleichzeitig durchgeführt, um das Injektionsmaterial durch verschiedene Bereiche der Dotter zu verbreiten. Bis zu 50 Nanoliter kann injiziert werden in das Eigelb von Channel Catfish Embryonen, aber, die Menge des Proteins gRNA/Cas9 für jedes Gen die besten Resultate für Mutation Rate und Embryo überleben32optimiert werden muss.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zurückziehen die Nadel glatt um das Ei zu beschädigen. Verschieben Sie die Petrischale, wieder ein Ei mit dem gleichen Verfahren zu injizieren. Vermeiden Sie Bewegung der Petrischale während des Einspritzvorgangs, da dies das Ei beschädigen oder Bruch der Nadel führen. Eiern, die gebrochen oder beschädigt durch Mikroinjektion zu entfernen. Injektion kann bei 15-20 min nach der Befruchtung begonnen werden und solange sind die Embryonen noch im Stadium einer Zelle (bis ca. 60-90 min nach der Befruchtung).</li>
	<li>Legen Sie injizierte Embryonen zurück in Holtfreter Lösung mit 10 ppm von Doxycyclin und kontinuierliche sanfte Belüftung für 6 – 7 Tage bis zum Schlupf40. Ändern Sie die Lösung täglich und entfernen Sie tote Embryonen.</li>
</ol>(6) Mutation Erkennung
<ol><li>Nach dem Zufallsprinzip, sammeln Sie einige injizierte Embryonen bei 72 h Post Düngung, entfernen Sie das Eigelb und extrahieren Sie genomischen DNA. Enthalten Sie 3 – 5 nicht injiziert Embryonen als Steuerelement. Hinweis: Genomic DNA kann Embryonen nach der Entfernung der Eierschalen und Eigelb Material mit Proteinase K-Verdauung und Ethanol Niederschlag32entnommen werden.</li>
	<li>Ein DNA-Segment flankieren die genomische Ziele für gRNA jedes Gen, wo Mutationen auftreten, mit einem High-Fidelity Taq Polymerase32, voraussichtlich, zu verstärken. Für TICAM 1, die Primer 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (vorwärts) und 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (rückwärts) wurden verwendet, um eine 750 verstärken bp während für RBL, die Primer 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (vorwärts) und 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (rückwärts) wurden verwendet, um ein 375 bp-Segment aus dem RBL-gen zu verstärken.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgende PCR-Reaktion: bis zu 20 µL PCR Grade Wasser; 1 X HiFi Taq Enzym Reaktion Puffer mit MgCl2, 0,2 mM dNTP-mix, 0,4 µM für jeden der die vorwärts- und Grundierung von den gleichen Satz, 100-300 ng genomischer DNA und 1,25 Einheiten der High-Fidelity Taq Enzym Mischung. Führen Sie PCR Radfahren Bedingungen: erste Denaturierung bei 94 ° C für 3 min; 35 Zyklen der Denaturierung bei 94 ° C für 30 s, Glühen bei 60 ° C für 55 s für TICAM und 40 s für RBL, Erweiterung bei 72 ° C für 1 min/kb; und letzte Erweiterung bei 72 ° C für 10 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die mutierten Embryonen mit einer Mutation Erkennungsmethode z. B. Sequenzierung des gereinigten PCR-Produkte, Landvermesser Mutation Erkennung Assay, Heteroduplex Mobility Assay, Verlust der Restriktionsenzym Anerkennung Website oder jeder andere Mutation Nachweisverfahren, das ist zu erkennen geeignet für das Ziel. Erkennen Sie in diesem Protokoll mutierte Embryonen mit Landvermesser Mutation Erkennung Assay für TICAM 1 und Verlust der Restriktionsenzym Schnitten SapI Website sowie Sequenzierung des gereinigten PCR-Produkte für RBL-gen.</li>
	<li>Ermittlung der mutierten Allele Klonen Sie PCR-Produkte und Sequenz Vektoren aus einzelnen Kolonien. Die mutierten Allele, dargestellt in Abbildung 4 und Abbildung 6 kam von injizierten Embryonen. PCR-Produkte von sechs mikroinjiziert und 3 Kontrolle Embryonen für jedes Gen wurden zusammengefasst in zwei getrennten Röhren, für mikroinjiziert Embryonen und die andere für Kontrolle Embryonen, schnell geklont und 86 Vektoren für TICAM 1 und 48 Vektoren für RBL gen sequenziert, darunter 8 Reaktionen von 3 Kontrolle nicht injiziert Embryonen für jedes Gen-Sequenzierung.</li>
	<li>Vergleichen Sie um verschiedene mutierten Allele zu identifizieren, die Sequenzen von mutierten Embryonen der Wildtyp-Sequenz mit einer DNA-Sequenz Alignment-Tool wie BLAST oder T-COFFEE.</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keinen Interessenskonflikt.

Ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen gen Knockout zu erreichen wurde vorgestellt. Injektion von CRISPR/Cas9 Eiweiß im Eigelb ist viel einfacher, spart Zeit und erfordert keine umfangreiche Ausbildung im Vergleich zu microinjecting die Blastodisc der einzelligen Embryonen, die die gängige Methode für die meisten Gentransfer und gen-Bearbeitung mit Fisch ist 30 , 42. das aktuelle Protokoll erwies sich als erfolgreich bei ...

Mikroinjektion ist eine verbreitete Labortechnik verwendet, um eine kleine Menge einer Substanz wie DNA, RNA, Proteine und andere Makromoleküle in Zellen oder Embryos durch eine Glas-Kapillare-1liefern. Mikroinjektion wird mit Sonderausstattung Einrichtung einschließlich einer Microinjector, Mikromanipulator und Mikroskop2durchgeführt. Die Technik wurde von den Forschern verwendet, um genetisch zu verändern viele Organismen durch die Generierung von gentechnisch veränderten Pflanzen, gen-Knockouts und Gentherapie, mit dem Ziel, Verständnis der Dynamik von intrazellulären Komponenten3,4 , 5.
Der Kanal Wels (Ictalurus Punctatus) ist die beliebteste Wels-Arten in der Aquakultur und Freizeitfischerei Aktivitäten in den Vereinigten Staaten. Gibt es ein zunehmender Bedarf FunktionsGenomics in Channel Catfish zu studieren, und Sequenzierung des kompletten Genoms Channel Catfish erhöht den Nutzen der jüngsten Fortschritte in der Genome editing Tools6,7. Genfunktion Verständnis würde nicht nur bereichern die Forschung, die auf Wels durchgeführt wird, sondern könnte auch zu effektiver genetischen Verbesserungsprogrammen, Wels-Industrie zu verbessern. Sobald wichtige Gene für ein bestimmtes Merkmal von Interesse identifiziert sind, können sie verwendet werden, genetisch Wels Produktion durch Erbgut Bearbeitung um vorteilhafte Allele generieren Auswahl für diese Allele, unterdrücken die schädlichen Allele, Übertragung zu verbessern die vorteilhafte Allele durch Transgenese oder eine Kombination dieser Optionen. Kombiniert die besten Gene für verschiedene wirtschaftlich vorteilhaften Eigenschaften von verschiedenen Arten in einen Fisch würde erheblich verbessern Produktivität und Rentabilität von Fisch Produktion Betrieb8.
Gen Knockout ist eine direkte Methode, gen Funktionen in Vivozu studieren. Mutationen in der DNA-Ebene werden von zukünftigen Generationen vererbt werden, die ihre Auswirkungen in verschiedenen Generationen erleichtern wird. Unterschiedliche Genom-Bearbeitungs-Tools wurden entwickelten einschließlich Zink Finger Nukleasen (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten Protein 9 (CRISPR/Cas9 ) System9,10,11,12.
Das CRISPR/Cas9-System ist eine leistungsstarke, effiziente Werkzeug, das verwendet wurde, um die genomische DNA-Sequenzen auch gen Knockout in Fische durch RNA-geführte Site-spezifische DNA-Spaltung5,13bearbeiten. Das System besteht aus einen Leitfaden RNA (gRNA), die die gezielte Reihenfolge in das Genom und eine DNA-Endonuklease Enzym, Cas9 bestimmt. Das CRISPR/Cas9-System kann in beliebiger Reihenfolge in das Genom mehrere Vorteile gegenüber ZFN und TALENs Ziel gestaltet werden: (1) niedriger Kosten (2) einfacher Technik (3) mehr spezifische Bindung der RNA Anleitungenzu Zielsequenz, und reduziert Ziel Mutationen (4) mehrere Sequenzen können mit verschiedenen gRNA mit der gleichen Zeit (5) hohe Mutagenese Rate in Gene gezielt eingesetzt werden, die nicht von TALENs und (6) verbesserte Keimbahn-Übertragungsrate von Mutationen für bis zu 6-Fach mutiert sein könnte im Vergleich zu ZFN und TALENs14, 15,16,17,18.
Die wichtigste alternative Methode für die Mikroinjektion ist Elektroporation, in denen elektrische Impulse auf Embryonen oder Zellen Membranpermeabilität und die Aufnahme von biologischen Molekülen19,20erhöhen angewendet werden. Mehrere transgene Fische wurden mit Elektroporation wie Medaka (Oryzias Latipes), Zebrafisch (Danio Rerio), Königslachs (Oncorhynchus Tshawytscha), Channel Catfish, Goldbrasse (Sparus Mitgleid) erzeugt und gemeinsamen Karpfen (Cyprinus Carpio)21,22,23,24,25,26.
Elektroporation wurde zur Plasmid DNA, RNA und Cas9 Protein für gen Knockout zu liefern. In Säugetierzellen, Cas9/gRNA Plasmid DNA, Cas9 mRNA/gRNA und Cas9 Protein/gRNA komplexe wurden geliefert mit Elektroporation und Mutagenese Preise waren mit Cas9 Protein/gRNA komplexe für die meisten Elektroporation Bedingungen getestet27am höchsten. In der Ascidian Chordate (Ciona Intestinalis) waren TALENs Konstrukte auszudrücken elektroporiert in befruchteten Eizellen, Ko von mehreren Genen28zu induzieren. ZFN auszudrücken Plasmid Konstrukte wurden elektroporiert, knock out luteinisierendes Hormon im Channel Catfish29. Einmal in die Zelle eingeführt, Plasmid Konstrukte werden müssen jedoch an RNA transkribiert und nach Funktionsproteine übersetzt, bevor sie die gewünschte DNA-Sequenz, die wahrscheinlich die Zeit der Mutagenese im Vergleich zur Mikroinjektion RNA verzögern würde ausrichten können / Protein. Ein Embryo entwickelt, mit zunehmender verzögerte Mutagenese Mosaikbildung der injizierten Gründer. Darüber hinaus dürfte die transgene Ausdruck den Ausdruck möglich mit Mikroinjektion, Senkung der Mutagenese-Effizienz zu erreichen.
Als Mittel für die Einführung von Genom-editing-Tools in Zellen hat Mikroinjektion mehrere Vorteile gegenüber Elektroporation. Genom Bearbeitung Moleküle kann zuverlässig in Zellen oder Embryos durch Mikroinjektion30eingeführt werden. Weniger Injektionsmaterial ist erforderlich. Es ist leicht zu bestimmen, die Mengen an Material gespritzt. Höheren Mutation werden Tarife mit niedrigen Mosaikbildung im Gründer Fisch erreicht die Keimbahn Übertragung der Mutationen, F1verbessern würde. Weniger Gründer Fische müssen analysiert werden, um die erste Generation, durch die höhere Mutationsrate zu produzieren. In Elektroporation müssen mehr Gründer Fische analysiert werden die Kosten steigen. Das Überleben der Channel Catfish mikroinjiziert Embryonen ist jedoch niedriger als elektroporiert diejenigen, obwohl dies durch die Injektion mehr Embryonen31,32überwunden werden kann. Im Channel Catfish, Überleben von Eigelb mikroinjiziert Embryonen reichte von 16 bis 55 %, abhängig von den Genen angestrebt und die Dosierung von gRNA/Cas9 Protein32.
Regelmäßige Mikroinjektion von Wels Embryonen ist technisch anspruchsvoll und zeitraubend, jedoch eine schnelle und effiziente CRISPR/Cas9 Protein Mikroinjektion Protokoll ist für Channel Catfish Embryonen vorgestellt. Dieses Protokoll erfordert weniger Zeit und Know-how, da die Proteinlösung CRISPR/Cas9 in das Eigelb von einer Zelle Embryonen injiziert wird. Hunderte von befruchteten Eizellen können in 1 h (etwa den Zeitaufwand für die erste Zellteilung auftreten) injiziert werden. Um das Protokoll zu überprüfen, wurden zwei Krankheit Anfälligkeit-Genen in Channel Catfish, die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose bindende Lektin (RBL) gen klopfte. TICAM 1 engagiert sich in den Signalweg initiiert von Toll-Like-Rezeptor (TLR) 3. Im Channel Catfish war TICAM 1 dramatisch hochreguliert nach bakteriellen Foulspiel mit Edwardsiella Ictaluri, während es herunterreguliert in blau Wels, eine Spezies resistent gegen E. Ictaluri33war. RBL spielt eine wichtige Rolle in frühe Infektion mit Flavobacterium Columnare, der Erreger der Columnaris Krankheit, wo akute und robuste Hochregulation verzeichnete eine Columnaris-anfälligen Channel Catfish-Belastung im Vergleich zu einem Columnaris-resistenten Stamm34.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="520">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:136px;">Reproboost implant</td>
			<td style="width:115px;">Center of Marine Biotechnology</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Luteinizing hormone releasing hormone analog (LHRHa) for induction of ovulation in channel catfish females</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">TRICAINE-S</td>
			<td style="width:115px;">Western Chemical. Inc.</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For sedation of brood stock fish during hormone injection and egg stripping.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:136px;">Phenol red</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:99px;">P0290</td>
			<td style="width:171px;">0.5%, sterile filtered</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:115px;">Olympus</td>
			<td style="width:99px;">213709</td>
			<td style="width:171px;">For visualizing the eggs during microinjection</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Microinjector</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MPPI-3</td>
			<td style="width:171px;">For the delivery of the injection material into the embryos</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:115px;">ASI-Applied Scientific Instrumentation&#160;</td>
			<td style="width:99px;">Model MM33&#160;</td>
			<td style="width:171px;">For holding and controlling the movement of the injection needle.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Eppendorf Microloader</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:99px;">5242956.003</td>
			<td style="width:171px;">For loading injection solution into microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:136px;">Vertical needle puller</td>
			<td style="width:115px;">David Kopf Instruments</td>
			<td style="width:99px;">Model 720</td>
			<td style="width:171px;">For pulling microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Cas9 protein</td>
			<td style="width:115px;">PNA Bio Inc.&#160;</td>
			<td style="width:99px;">CP01</td>
			<td style="width:171px;">Recombinant Cas9 protein from Streptococcus pyrogenes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Expand High FidelityPLUS PCR System</td>
			<td style="width:115px;">&#160;Roche Diagnostics, USA</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">For PCR and amplification of DNA templates to be used in gRNA preparation</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:136px;">Borosilicate glass capillaries</td>
			<td style="width:115px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">1 mm outer diameter (OD), for making microinjection needles.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:136px;">Petri dish</td>
			<td style="width:115px;">VWR</td>
			<td style="width:99px;">25384-302</td>
			<td style="width:171px;">For holding the embryos during the microinjection.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:136px;">Crisco</td>
			<td style="width:115px;">The J.M. Smucker Company</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">Vegetable shortening for coating spawning pans and petri dishes.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:136px;">Holtfreter`s solution</td>
			<td style="width:115px;">Home Made</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:171px;">59 mM NaCl, 0.67 mM KCl, 2.4 mM NaHCO3, 0.76 mM CaCl2, 1.67 mM MgSO4 to incubate the microinjected embryos till hatch.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:136px;">Doxycycline hyclate USP (monohydrate)</td>
			<td style="width:115px;">Letco Medical</td>
			<td style="width:99px;">690904</td>
			<td style="width:171px;">Antibiotic added to Holtfreter&#39;s solution to 10 ppm to prevent bacterial infections.</td>
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microinjection of crispr/cas9 protein into channel catfish, ictalurus punctatus, embryos for gene editing

Das komplette Genom von der Kanal-Wels Ictalurus Punctatus, wurde sequenziert, führt zu größeren Möglichkeiten für Channel Catfish Genfunktion zu studieren. Gen Knockout wurde verwendet, um diese gen Funktionen in Vivozu studieren. Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System ist ein mächtiges Werkzeug zum Bearbeiten von genomischer DNA-Sequenzen um Genfunktion zu ändern verwendet. Während der traditionelle Ansatz CRISPR/Cas9 mRNA in die einzelne Zelle Embryonen durch Mikroinjektion einbringen wurde, kann dies ein langsamer und ineffizienter Prozess in Wels. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Mikroinjektion Channel Catfish Embryonen mit CRISPR/Cas9 Protein beschrieben. Kurz, Ei- und Samenzellen wurden gesammelt und dann künstliche Befruchtung durchgeführt. Befruchtete Eizellen wurden in einer Petrischale mit Holtfreter Lösung überführt. Injektionsvolumen war kalibriert und dann leiten RNAs/Cas9 Ausrichtung, die die Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM 1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert waren. Die gen-Knockout war erfolgreich, DNA-Sequenzierung Indels bestätigt wurden. Die vorhergesagte Protein Sequenz Veränderungen durch diese Mutationen enthalten Frameshift und Proteins wegen vorzeitigen Stopp-Codons abgeschnitten.

Um die Effizienz des Protokolls Mikroinjektion zu demonstrieren, wurden entwickelt, um den Channel Catfish Maut/Interleukin-1 Rezeptor Domäne-haltigen Adapter Molekül (TICAM1) gen und Rhamnose Bindung Lektin (RBL) gen Ziel gRNAs mikroinjiziert.
TICAM 1 DNA-Sequenzierung von Vektoren aus einzelnen Kolonien von aggregiert, geklonten PCR-Produkte ergab die Indel Mutationen in TICAM 1 gen induziert. Die Mutatio...

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Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Eine einfache und effiziente Mikroinjektion Protokoll zur gen Bearbeitung im Channel Catfish Embryonen mit dem CRISPR/Cas9-System wird vorgestellt. In diesem Protokoll führen RNAs und Cas9 Protein wurden in das Eigelb von einzelligen Embryonen mikroinjiziert. Dieses Protokoll wurde bestätigt durch zwei Channel Catfish immunvermittelte Gene ausschlagen.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

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Serie: Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the identification and verification of a drug resistance gene in the Apicomplexan parasite Toxoplasma gondii, the method of Quantitative Trait Locus (QTL) mapping using a Whole Genome Sequence (WGS) -based genetic map and the method of Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 -based gene editing. The approach of QTL mapping allows one to test if there is a correlation between a genomic region(s) and a phenotype. Two datasets are required to run a QTL scan, a genetic map based on the progeny of a recombinant cross and a quantifiable phenotype assessed in each of the progeny of that cross. These datasets are then formatted to be compatible with R/qtl software that generates a QTL scan to identify significant loci correlated with the phenotype. Although this can greatly narrow the search window of possible candidates, QTLs span regions containing a number of genes from which the causal gene needs to be identified. Having WGS of the progeny was critical to identify the causal drug resistance mutation at the gene level. Once identified, the candidate mutation can be verified by genetic manipulation of drug sensitive parasites. The most facile and efficient method to genetically modify T. gondii is the CRISPR/Cas9 system. This system comprised of just 2 components both encoded on a single plasmid, a single guide RNA (gRNA) containing a 20 bp sequence complementary to the genomic target and the Cas9 endonuclease that generates a double-strand DNA break (DSB) at the target, repair of which allows for insertion or deletion of sequences around the break site. This article provides detailed protocols to use CRISPR/Cas9 based genome editing tools to verify the gene responsible for sinefungin resistance and to construct transgenic parasites.

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

Details are presented on how QTL mapping with a whole genome sequence based genetic map can be used to identify a drug resistance gene in Toxoplasma gondii and how this can be verified with the CRISPR/Cas9 system that efficiently edits a genomic target, in this case the drug resistance gene.

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

A Standard Methodology to Examine On-site Mutagenicity As a Function of Point Mutation Repair Catalyzed by CRISPR/Cas9 and SsODN in Human Cells

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point mutations, which often are responsible for a variety of human inherited disorders. Using a well-established cell-based model system, the point mutation of a single-copy mutant eGFP gene integrated into HCT116 cells has been repaired using this combinatorial approach. The analysis of corrected and uncorrected cells reveals both the precision of gene editing and the development of genetic lesions, when indels are created in uncorrected cells in the DNA sequence surrounding the target site. Here, the specific methodology used to analyze this combinatorial approach to the gene editing of a point mutation, coupled with a detailed experimental strategy to measuring indel formation at the target site, is outlined. This protocol outlines a foundational approach and workflow for investigations aimed at developing CRISPR/Cas9-based gene editing for human therapy. The conclusion of this work is that on-site mutagenesis takes place as a result of CRISPR/Cas9 activity during the process of point mutation repair. This work puts in place a standardized methodology to identify the degree of mutagenesis, which should be an important and critical aspect of any approach destined for clinical implementation.

This protocol outlines the workflow of a CRISPR/Cas9-based gene editing system for the repair of point mutations in mammalian cells. Here, we use a combinatorial approach to gene editing with a detailed follow-on experimental strategy for measuring indel formation at the target site&#8212;in essence, analyzing onsite mutagenesis.

Eine Standardmethodik, vor-Ort-Mutagenität als Funktion der Punktmutation Reparatur katalysiert durch CRISPR/Cas9 und SsODN in den menschlichen Zellen zu untersuchen

Combinatorial gene editing using CRISPR/Cas9 and single-stranded oligonucleotides is an effective strategy for the correction of single-base point ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

Einführung eines Gene Knockout direkt in die Amastigote-Phase von Trypanosoma cruzi mit dem CRISPR/Cas9-System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

CRISPR-Cas9-Vermittelte Genombearbeitung in der filamentösen Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to visceral pathology. Deciphering the nature of the vector/parasite interactions is of primary importance for better understanding of Leishmania transmission to their hosts. Among the parameters controlling the sand fly vector competence (i.e. their ability to carry and transmit pathogens), parameters intrinsic to these insects were shown to play a key role. Insect immune response, for example, impacts sand fly vector competence to Leishmania. The study of such parameters has been limited by the lack of methods of gene expression modification adapted for use in these non-model organisms. Gene downregulation by small interfering RNA (siRNA) is possible, but in addition to being technically challenging, the silencing leads to only a partial loss of function, which cannot be transmitted from generation to generation. Targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 technology was recently adapted to the Phlebotomus papatasi sand fly. This technique leads to the generation of transmissible mutations in a specifically chosen locus, allowing to study the genes of interest. The CRISPR/Cas9 system relies on the induction of targeted double-strand DNA breaks, later repaired by either Non-Homologous End Joining (NHEJ) or by Homology Driven Repair (HDR). NHEJ consists of a simple closure of the break and frequently leads to small insertion/deletion events. In contrast, HDR uses the presence of a donor DNA molecule sharing homology with the target DNA as a template for repair. Here, we present a sand fly embryo microinjection method for targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 using NHEJ, which is the only genome modification technique adapted to sand fly vectors to date.

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

This protocol details the steps of CRISPR/Cas9 targeted mutagenesis in sand flies: embryo collection, injection, insect rearing, and identification as well as selection of mutations of interest.

Sandfliege (Phlebotomus papatasi) Embryo Mikroinjektion für CRISPR/Cas9 Mutagenese

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...