Wir danken Daphne Dambournet für viele aufschlussreiche Gespräche und Ratschläge auf gen bearbeiten, Thao für Illustration, Angelique Nelson für kritische Lektüre des Manuskripts und Andrew Tucker zur Erzeugung der mEGFP-Tags Lamin B1-Zell-Linie. Wir möchten die Stammzellen und Gene Editing und Assay-Entwicklung-Teams bei Allen Institut für Cell Science für ihre Beiträge zu bearbeiten gen und Qualitätskontrolle anerkennen. Die WTC-Linie, die wir zur Erstellung unserer gen bearbeitet Zelllinie sorgte das Bruce R. Conklin Laboratory in Gladstone Institute und UCSF. Wir bedanken uns bei Allen Institute for Cell Science Gründer, Paul G. Allen, für seine Vision, Ermutigung und Unterstützung.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die Methode, die hier vorgestellten Erzeugung endogen fluoreszierenden Proteins Fusionen im HiPSCs geregelt ist ein vielseitiges und leistungsstarkes Ansatz zur Generierung von Gen bearbeitet Zelllinien mit Anwendungen von live Cell Imaging bis hin zu verschiedenen funktionelle Studien und " in einer Schale "Krankheitsmodelle mit Patienten abgeleitet HiPSC Linien13,14,15. Während diese Methode verwendet wurde, um große FP-Tags, die N - oder C-Terminus des endogenen Proteinen einzuführen, könnte es verwendet werden, andere Tags oder kleine genetische Veränderungen vorzustellen Modell oder richtige krankheitsverursachende Mutationen22,23 . Für kleinere Einsätze die Größe der Homologie-Arm kann reduziert werden, aber allgemeinen Ansatzes für die Bearbeitung präsentiert in dieser Methode kann noch24,25gelten. Während der Einsatz von HiPSCs dringend aufgefordert, für ihre große Nützlichkeit mit sorgfältige Optimierung ist kann dieses Protokoll angepasst werden, damit um die Genome von anderen Säugetieren Zelllinien zu bearbeiten.
Wenn ein Gen des Interesses für die Markierung von FP identifiziert Transkript Fülle schätzt (von Microarray oder RNA-Seq-Daten) sind ein guter Ausgangspunkt für die Beurteilung, ob ein Gen oder Isoform von Interesse zum Ausdruck kommt, obwohl Transkript Ebenen korreliert nicht immer mit Protein-Ebene. Die hier beschriebene FACS-Anreicherung-Strategie funktioniert am besten für Gene, die zumindest mäßig gut ausgedrückt werden in der Zelle Art von Interesse. Diese Strategie wurde auch erfolgreich bei der Auswahl für Fusionen, die punktförmige und/oder diskrete Lokalisierung Muster wie centrin, Desmoplakin und Paxillin zeigen, wo ist die Signal-Hintergrund-Verhältnis sehr geringen12,19. Gene, die nicht stark ausgedrückt werden oder werden nur in Derivative Zelltypen exprimiert erfordern zusätzliche Selektionsstrategien.
Der Ausgangspunkt für CrRNA und Spender Plasmid Vorlagendesigns in humanen Zelllinien verwendet sollte der menschliche Bezug Genom (GRCh38). Da das Genom der verschiedenen Zelllinien innerhalb derselben Spezies variieren können, und CRISPR/Cas9 Sequenz-spezifisch ist, ist es äußerst hilfreich, Zelle linienspezifische Varianten (single Nucleotide Polymorphisms oder Einfügungen/Löschungen (Indels)) zu identifizieren Das unterscheiden sich von den Referenz-Genom und integrieren diese in das Design. Dadurch wird sichergestellt, dass CrRNAs mit das wirtsgenom kompatibel ist und, dass die Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme jede Zelllinie spezifischen Varianten erhalten bleibt. Eine vorgeschlagene Strategie ist homozygote Varianten in CrRNAs und Spender Vorlage Plasmid Homologie Arme während des Designprozesses zu integrieren. Einbindung der heterozygote Varianten ist optional. Die spezifischen Reagenzien für große Knock-in Experimenten verwendet und andere wichtigen Überlegungen für dieses Protokoll werden unten besprochen.
Cas9 Protein
Der Hauptvorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass die Einführung der Cas9 und gRNA als eine komplexe RNP hat gezeigt, dass eine begrenzte Dauer der Nuklease Aktivität im Vergleich zu Plasmid-basierte Ansätze wo Ausdruck der Cas9 und gRNA kann weiterhin für Tage und führen zur Folge zu größeren - und off-Target Aktivität26,27. Ein weiterer Vorteil der Verwendung von Cas9 Protein ist, dass es einmal im Inneren der Zellen Spalten zur Verfügung. Gegensatz zu herkömmlichen Methoden der Verwendung von Cas9 mRNA oder Cas9/gRNA Plasmid, die Transkription, Übersetzung und Protein26,28Verarbeitung erfordern. Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein ist jetzt von vielen kommerziellen Quellen zur Verfügung.
Guide RNA
Es gibt viele öffentlich verfügbaren Tools für die Suche nach CrRNA Ziele in der Nähe der gewünschten FP Insertionsstelle, die keine oder nur wenige vorhergesagten off-Ziele in das Wirt Genom29,30,31,32haben. Effizienzgewinne bei HDR und die Präzision der HDR-Ergebnisse variieren stark zwischen den CrRNA Zielen, die an einem bestimmten Locus12verwendet. Aus diesem Grund testen mehrere CrRNAs (2-4 und vorzugsweise innerhalb 50 bp der gewünschten Insertionsstelle) pro Locus wird empfohlen, da dies die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Bearbeitung Experiment erhöhen kann. Derzeitige Möglichkeiten für die Bereitstellung von gRNA enthalten synthetische 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA, synthetische einzelne gRNAs (SgRNAs), in-vitro- SgRNAs oder bei der Auslieferung ein Plasmid auf Zellen, die mit dem Ausdruck der SgRNA von einer U6-Promoter transkribiert. Dieses Protokoll wurde nicht für hohe Spaltung Aktivität optimiert. Unveränderte 2-Komponenten CrRNA und TracrRNA (siehe Tabelle der Materialien) wurden mit dem Ziel der Erzeugung von Mono-Allele FP-Tags Zell-Linien während die potenzielle geringsten Störung in den Zellen verursacht verwendet.
Spender-Vorlage Plasmid
Weil einige der Homologie Sequenz arm, sofern beim Spender Vorlage Plasmid während der HDR-Veranstaltung in das wirtsgenom integriert werden, sollten Punktmutationen auf die CrRNA Anerkennung Websites eingeführt werden, um weitere Spaltung durch Cas9 nach HDR zu verhindern. Oft ist die einfachste störenden Veränderungen, die PAM-Sequenz zu mutieren. Da einige nicht-kanonische PAM-Sequenzen noch von Wildtyp S. Pyogenes Cas9 erkannt werden können, empfiehlt es sich, vermeiden die Verwendung von NGG, NAG oder NGA33. Wenn die Homologie Arm mutiert, vermeiden Sie nicht Synonym Mutationen und die Einführung von seltenen Codons. Wenn ein Synonym der PAM-Sequenz nicht möglich ist, erwägen, drei gleichbedeutend Punktmutationen im Großraum Samen (10 bp proximalen PAM) der CrRNA-Bindungsstelle. Extreme Vorsicht geboten bei diesen Änderungen in der 5ʹ unübersetzte Region (UTR), da diese Regionen wichtige regulatorische Sequenzen enthalten können. Beratung einer genetischen Erhaltung Datenbank wie der UCSC Genome Browser vergleichende Genomik Spuren in diesen Fällen Hilfestellung können da Änderungen nicht konserviert Basen besser toleriert werden können, als zu hoch konservierte Basen17ändert. Manchmal reicht die bloße Aufnahme der FP-Sequenz, stören die CrRNA-Bindungsstelle (wie in Abbildung 1); Allerdings sollte die neu angehängte Sequenz für das Fortbestehen des CrRNA Bindung und PAM Sequenzen überprüft werden.
Aminosäure-Linker zwischen den FP und dem nativen Protein werden empfohlen, um die Funktion der Fusion Protein34zu sparen. Oft kann eine Aminosäure-Linker für seine besondere Belastung oder Größe gewählt werden. Wenn eine cDNA-Fusion mit einem Design ähnlich wie die gezielte endogenen ist Schmelzverfahren Protein gut untersucht worden, dass gleiche Linker-Sequenz für die CRISPR/Cas9 Knock-in Experiment12,19verwendet werden kann. Wenn diese Informationen nicht verfügbar ist, wurde auch ein kurze Linker wie GTSGGS12erfolgreich eingesetzt. Andere Studien haben Erfolg mit einer generischen kleine 3-amino Acid Linker-Sequenz für eine Vielzahl von Zielen35gezeigt.
Transfektion und FACS Bereicherung
Viele im Handel erhältlichen Transfektion Reagenzien sind für die Lieferung von bestimmten Arten von Molekülen, Zellen, formuliert, während eine Elektroporation-System verwendet werden kann, Reagenzien mit einer breiten Palette von Größe, Ladung und Zusammensetzung zu liefern. Abgesehen davon, dass eine gängige Methode der Transfektion für Zellen zu transfizieren, wie HiPSCs, trägt Elektroporation auch den Vorteil aller drei Komponenten für CRISPR/Cas9-vermittelten FP Knock-in zu liefern, wie in diesem Verfahren beschrieben. Elektroporation wurde festgestellt, dass die besten Ergebnisse im Vergleich zu anderen im Handel erhältlichen Reagenzien bei der Entwicklung dieser Methode (Daten nicht gezeigt), und wurde auch von anderen RNP Lieferung26,28,36 verwendet zu produzieren .
Wenn Sie dieses Protokoll verwenden für die Bearbeitung von HiPSCs, sollte besondere Vorsicht geboten, um schonende Behandlung der Zellen vor und nach das Gen Bearbeitungsprozess für optimale Zelle überleben und minimale spontane Differenzierung zu gewährleisten. Insbesondere sollten die FACS Anreicherungsverfahren für die Sortierung von Stammzellen mithilfe der größten Düse (130 µm), ein geringer Durchfluss (≤24 µL/min), Konservierungsstoffe Scheide Flüssigkeit angepasst werden (z. B. Kochsalzlösung, siehe Tabelle der Materialien), und niedrige Probe Druck (10 Psi). Statt einzelne Zelle Sortieren, führt zu suboptimalen Lebensfähigkeit in Stammzellen, FACS-angereicherten HiPSCs sortiert in loser Schüttung und erweitert als Population Zelle Lebensfähigkeit und Stammzellforschung Integrität zu optimieren. Jedoch kann einzelne Zelle Sortierung für weniger empfindliche Zelltypen geeignet. Um das Überleben der Zellen zu fördern, sind Zellen wieder Kultur nicht mehr als eine Stunde nach der Ernte für die FACS-Bereicherung und bei Raumtemperatur während der Sortiervorgang aufbewahrt. Für einige Zelltypen kann Zelle überleben auch durch Inkubation Zellen auf Eis (4 ° C) während das Sortierverfahren verbessert werden.
Die Bulk-Erweiterung des FP-positiven Zellen ermöglicht es, die Bevölkerung durch bildgebende Analyse für die Fusion Protein Lokalisierung vor der Generierung von klonalen Linien zu bewerten. Während der daraus resultierenden angereicherten Population von Zellen für einige Studien ausreichend sein kann, zeigen diese Populationen häufig FP Signal von unterschiedlicher Intensität. Die isolierten klonalen Linien haben einheitliche Signal (Abbildung 3), so dass sie besser geeignet für funktionelle Experimente12.
Klonale Zellgeneration Linie
Während der Bearbeitung und klonale Linie Generation ist es wichtig, die Zellmorphologie überwachen. HiPSC Kolonien gewachsen in den Feeder-freien Bedingungen sollen glatte Kanten und eine gleichmäßige, gut verpackt Zentrum12,18,19aufweisen. Differenzierte Zellen sind in weniger als 5 % der Kultur zu beachten. Bei der einzelnen Kolonien Kommissionierung, wählen Sie diejenigen die Ausstellung gute Morphologie. Während der 96-Well-Platte passagierung Veranstaltungen Klone für Morphologie zu überprüfen und diejenigen, die überwuchert haben, so kann dies ein Hinweis auf genetische Instabilität sein oder zu einer Differenzierung führen einzustellen.
Generation von klonalen Zell-Linien können für genetische Bestätigung der präzisen Bearbeitung, was wichtig ist, weil Cas9-induzierten Doppelstrang im Genom bricht oft repariert ungenau trotz Einbeziehung des Tags an den gewünschten Ort. Zuvor beschriebenen PCR-basierten Tests zeigten, dass kumulativ über zehn einzigartige genomic Loci viele (45 %) der FP exprimierenden Klone litt Spender Plasmid Rückgrat Integration bei der gezielten Lokus oder (selten) nach dem Zufallsprinzip in der Genom-12. Darüber hinaus 23 % der GFP-positiven Klone (n = 177) über zehn einzigartige Loci wurden gefunden, um Mutationen an oder in der Nähe des erwarteten CrRNA schneiden in der unmarkierten Allel, wahrscheinlich wegen NHEJ12beherbergen. Diese genetische Analyse von vielen klonalen Linien (~ 100 Klone/Edit) unterstrich die Bedeutung der genetischen Validierung, die nicht in einer Zellpopulation möglich ist, da FP-Ausdruck und erwartete Fusion Protein Lokalisierung allein keine präzise Bearbeitung12 gewährleisten . Darüber hinaus können diese PCR-basierten Tests ausgeführt werden, auf eine angereicherte Population von Zellen mit Bestimmtheit, rechtfertigt die Notwendigkeit einer klonalen Linie Generation bevor aussagekräftige Analyse abgeschlossen werden kann. Genetische Bestätigung des eingefügten FP Tags und Überprüfung der genetische Integrität des unbearbeiteten Allels (in einem Mono-Allele bearbeitete Klon) sind notwendig, um sicherzustellen, präzise Bearbeitung bei der gezielten Lokus über Tag-Ausdruck.
Eine niedrige Rate von Bi-Allele Bearbeitungen und Mangel an Ziel-Mutationen (als vermutlich durch Sanger und Exome Sequenzierung) wurden bisher mit dieser Methode (unveröffentlichte Daten)12beobachtet. Dies steht im Einklang mit früheren Studien beschreiben die Verwendung von kurz andauernde RNP CRISPR/Cas9 Experimente26,27. Das Fehlen von klonalen Zelllinien mit Bi-Allele Bearbeitungen kann auch bestimmten Locus oder wegen der Unfähigkeit der Zelle zwei tolerieren markiert Kopien ein essentielles Protein wie vorgeschlagen von zuvor veröffentlichten Experimenten wo vermeintliche Bi-Allele bearbeitete Zellen für einen Locus (LMNB1), beobachtet aber nicht eine andere (TUBA1B)12. BI-Allele vollständig validierten klonalen Zelllinien wurden mit dieser Methode zu Tag ST6 Beta-Galactoside Alpha-2, 6-Sialyltransferase 1 (ST6GAL1) und RAB5A Mitglied RAS Onkogen Familie (RAB5A) mit mEGFP19generiert.
Darüber hinaus bestätigen die Präzision der Bearbeitung im Genom, gibt es eine Vielzahl von Qualitätskontrolle-Assays, die verwendet werden können, weiter charakterisieren die klonale Linie und Klone, die erfüllen alle Stammzelle, genomische, zu identifizieren und Zelle biologischen Kriterien für die Verwendung in Zukunft Studien . Biologische und funktionelle Assays Zelle lässt sich angemessener Ausdruck, Lokalisierung und Funktion der Fusion Protein12bestätigen. Vergleich zum unbearbeiteten Kindersicherung wird dazu beitragen, den Einfluss des Bearbeitungsprozesses für Lokalisierung, Dynamik und Funktion zu beurteilen. Andere Tests festzustellen wie Wachstum Analysen und Tests für die genomische Stabilität können auch helfen, ob das tagged Protein störenden auf die Zelle. Bei Verwendung von HiPSC in dieses Protokoll kann Bewertung der Pluripotenz Marker und Differenzierung Potenzial bei der Bestimmung, dass ein Klon, das wertvoll für flussabwärts12Studien kritisch. Weil Kultur erweitert HiPSC hat gezeigt, dass genetische Instabilität, Überwachung der Wachstumsrate führen und Karyotyp klonalen Zell-Linien ist auch wichtig,12,37. Allerdings bestimmt das Finale bearbeitete Zellen wird letztlich bestimmen die Höhe und Breite der Qualitätskontrolle Analyse und variieren basierend auf der Anwendung.

Die Verwendung von Genom-Bearbeitung Strategien, vor allem CRISPR/Cas9, zelluläre Prozesse zu studieren wird immer zugänglich und wertvolle1,2,3,4,5, 6 , 7. eine der vielen Anwendungen von CRISPR/Cas9 ist die Einführung (über Homologie gerichtet Reparatur (HDR)) der großen exogene Sequenzen wie GFP in bestimmten genomic Loci, die dann als Reporter für die Aktivität von Genen oder Proteinen Produkt8 dienen . Diese Technik lässt sich eine fluoreszierendes Protein-Sequenz mit einer endogenen offenen Leserahmen verbinden wo resultierende endogen geregelten Fusionsproteins lässt sich die subzelluläre Lokalisation und Dynamik des Proteins des Interesses5 visualisieren ,6,9,10,11. Während endogen tagged Proteine viele Vorteile im Vergleich zur Überexpression Systeme bieten, ist Einfügen von großen Sequenzen in das menschliche Genom ein ineffizienter Prozess in der Regel eine Auswahl oder Bereicherung Strategie eine Bevölkerung der Zellen zu erhalten, die kann zu verlangen sein leicht studierte5,12.
Dieses Protokoll beschreibt die Einfügung einer DNA-Sequenz, die Kodierung eines fluoreszierenden Proteins (FP) in eine gewünschte genomischen Locus. Das Protokoll umfasst Planung und Lieferung von Spender-Vorlage-Plasmid und komplexe Ribonucleoprotein (RNP) (Wildtyp S. Pyogenes Cas9 Protein in Kombination mit synthetischen CRISPR-RNA (CrRNA) und Trans-Aktivierung CrRNA (TracrRNA)). Auch beschrieben ist die Bereicherung der vermeintlich bearbeitete Zellen durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) und die Generierung von klonalen Zelle Linie. Bisher hat diese Methode zum HiPSC Linien mit monoallelisches oder (selten) Bi-Allele grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tags Kennzeichnung fünfundzwanzig Proteine repräsentieren wichtige zelluläre Strukturen erzeugen. Die resultierenden bearbeiteten Zellen aus diesen Bemühungen wurden bestätigt haben das erwartete genetische einsetzen, eine korrekte Lokalisierung Fusionsproteins auszudrücken, und Pluripotenz und eine stabile Karyotyp12 (und unveröffentlichte Daten). Mit dieser Methode hat auch mehrere andere generieren Single und Dual (zwei verschiedene Proteine in derselben Zelle markiert) bearbeitet Populationen von HiPSCs (unveröffentlichte Daten).
Menschlichen iPSCs eines gesunden Spenders abgeleitet wurden Erbgut Bearbeitung dafür ausgewählt, weil im Gegensatz zu vielen herkömmlichen Zelllinien, sie diploid, karyotypisch stabil, nicht transformiert und proliferative sind. Diese Eigenschaften stellen ein attraktives Modell für das Studium fundamentale Zellbiologie und Krankheit Modellierung. Darüber hinaus bietet das Potenzial der Differenzierung der HiPSCs die Möglichkeit, mehrere Entwicklungsstadien parallel in verschiedenen Linien und Zelltypen mit isogenen Zellen einschließlich der Organellen, Gewebe und "in einer Schale" Krankheitsmodelle13 studieren ,14,15. Obwohl dieses Protokoll für HiPSCs (WTC Linie) entwickelt wurde, kann es für die Entwicklung von Protokollen mit anderen Säugetieren Zelllinien informativ sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1169px;" width="1169">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Geneious R9</td>
			<td style="width:231px;">Biomatters, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">bioinformatics software for in silico donor plasmid design</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">TE Buffer pH 8.0</td>
			<td style="width:231px;">IDT, or similar</td>
			<td style="width:119px;">11-01-02-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:305px;">HERAcell VIOS 160i CO2 incubator, or similar</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific, or similar</td>
			<td style="width:119px;">51030408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Pipettes (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 10 &#181;L, 2 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Pipette tips (1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Multi-channel Pipette (200 &#181;L)</td>
			<td style="width:231px;">Rainin, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Serological pipetes (25 mL, 10 mL, 5 mL)</td>
			<td style="width:231px;">Costar, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">BRAND 8-Channel Manifold for Quiksip, Autoclavable</td>
			<td style="width:231px;">Millipore Sigma, or similar</td>
			<td style="width:119px;">BR704526-1EA</td>
			<td style="width:515px;">use with non-filtered pipet tips, such as Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10, below</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Molecular BioProducts Low Retention Pipet Tips, Pure 10</td>
			<td style="width:231px;">Thermo Fisher, or similar</td>
			<td style="width:119px;">3501-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">XP2 Pipette Controller</td>
			<td style="width:231px;">Drummond, or similar</td>
			<td style="width:119px;">4-000-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Disposable Pasteur Pipets</td>
			<td style="width:231px;">VWR, or similar</td>
			<td style="width:119px;">53300-567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:231px;">CELLGARD, or similar</td>
			<td style="width:119px;">NU-481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Matrigel Matrix, Growth Factor Reduced</td>
			<td style="width:231px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td style="width:515px;">lot tested before use with hiPSC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DMEM/F12 (-phenol red)</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11039-021</td>
			<td>cold, for diluting Matrigel 1:30</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mTeSR1 Complete Media</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">85850</td>
			<td>recommended growth media for WTC hiPSC line</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">WTC hiPSC line</td>
			<td style="width:231px;">Coriell</td>
			<td style="width:119px;">GM25256</td>
			<td>the hiPSC line used in this protocol is available through Coriell</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture dish 100 mm</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">6-well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">StemPro Accutase</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">A11105-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) no calcium, no magnesium</td>
			<td style="width:231px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">15 mL polystyrene conical</td>
			<td style="width:231px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">62.554.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Y-27632 (ROCK Inhibitor)</td>
			<td style="width:231px;">StemCell Technologies</td>
			<td style="width:119px;">72308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic crRNA, unmodified (custom sequence)</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">Custom0247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA</td>
			<td style="width:231px;">Dharmacon</td>
			<td style="width:119px;">U-002005-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Recombinant wild-type Streptococcus pyogenes Cas9-NLS purified protein, 40 &#181;M</td>
			<td style="width:231px;">University of California-Berkeley QB3 Macrolab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">Custom donor plasmid (PriorityGENE)</td>
			<td style="width:231px;">Genewiz</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:515px;">donor insert design was synthesized and cloned into pUC57 backbone by Genewiz</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">DNA LoBind Tube 1.5 mL</td>
			<td style="width:231px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">22431021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td style="width:231px;">Clontech</td>
			<td style="width:119px;">740424.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfetion System</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Neon Transfection System, 100 &#181;L kit</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MPK10096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">5 mL Polystyrene Round-bottom Tube with Cell Strainer Cap</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:305px;">15 mL High Clarity Polyproylene Conical Tube</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSAriaIII Fusion</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">656700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FACSDiva software</td>
			<td style="width:231px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">FlowJo version 10.2</td>
			<td style="width:231px;">TreeStar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">NERL Blood Bank Saline</td>
			<td style="width:231px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">8504</td>
			<td>used as preservative-free FACS Buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Olympus SZX7 Stereo Microscope, or similar</td>
			<td style="width:231px;">Olympus, or similar</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tissue culture plate, 96-well</td>
			<td style="width:231px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">96 well Cell Culture Plate, V-Bottom</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">351180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">CryoStor CS10</td>
			<td style="width:231px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C2874-100ML</td>
			<td>used as cryopreservation buffer for cells in 96-well plate format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Parafilm</td>
			<td style="width:231px;">Bemis</td>
			<td style="width:119px;">PM-996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">24 well Cell Culture Plate</td>
			<td style="width:231px;">CELLSTAR</td>
			<td style="width:119px;">662160</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

endogenous protein tagging in human induced pluripotent stem cells using crispr/cas9

Ein Protokoll wird für die Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSCs), die express körpereigene Proteine fusioniert, um in-N - oder C-terminalen fluoreszierende Tags Frame dargestellt. Die prokaryotische CRISPR/Cas9 System (gruppierten regelmäßig dazwischen kurz palindromische Wiederholungen/CRISPR-assoziierten 9) kann eingesetzt werden, große exogene Sequenzen in genomic Loci über Homologie gerichtet Reparatur (HDR) einzuführen. Erreichung der gewünschten Knock-in beschäftigt dieses Protokoll Ribonucleoprotein (RNP)-basierten Ansatz wo Wildtyp Streptococcus Pyogenes Cas9 Protein, synthetische 2-teilig Guide RNA (gRNA) und ein Spender Vorlage Plasmid werden, um die Zellen über geliefert Elektroporation. Vermeintlich bearbeitete Zellen mit dem Ausdruck das eindringmittel tagged Proteine werden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) bereichert. Klonale Linien werden dann generiert und für präzise Bearbeitung Ergebnisse analysiert werden können. Durch die Einführung der fluoreszierenden Tags bei der genomischen Lokus des Gens von Interesse, kann die daraus resultierende subzelluläre Lokalisation und die Dynamik des Fusionsproteins unter endogenen regulatorischen Kontrolle, eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Überexpression untersucht werden Systeme. Die Verwendung von HiPSCs als Modellsystem für die Markierung von Gen bietet die Möglichkeit, die tagged Proteine in nontransformed, diploiden Zellen zu studieren. Da HiPSCs in mehreren Zelltypen unterschieden werden können, bietet dieser Ansatz die Möglichkeit, erstellen und tagged Proteine in einer Vielzahl von isogenen zellulären Kontexten zu studieren.

Das Ziel dieses Experiments wurde zu mEGFP (Monomere verbesserte GFP) verschmelzen mit dem nuklearen lamin B1-Protein durch die Einführung der mEGFP-Sequenz am 5ʹ Ende des LMNB1-Gens (N-Terminus des Proteins). Ein Linker (Aminosäure-Sequenz SGLRSRAQAS) wurde von Michael Davidson fluoreszierende Protein Sammlung21basierend auf vorherigen cDNA Konstrukte gewählt. Da die CrRNA Bindung Region in dem Spender Vorlage Plasmid für jeden Kandidaten CrRNA nach dem einsetzen in Silico des mEGFP und der Linker-Sequenz unterbrochen wurde, musste keine Punktmutationen unternommen werden, um potenzielle CrRNA Anerkennung und Spaltung durch stören Cas9 der Spender-Sequenz (Abbildung 1). Die Spender-Sequenz enthalten 1 kb Homologie Arme flankieren beidseitig die mEGFP-Linker-Sequenz. Die daraus resultierende 2.734 bp DNA geklont wurde in einem pUC57 Rückgrat, Reihenfolge überprüft, und die daraus resultierende Spender Vorlage Plasmid gereinigt wurde, mit einem Endotoxin-freie Maxi Prep. Die Spender Vorlage Plasmid und komplexe RNP transfiziert wurden, vermeintlich bearbeitete Zellen angereichert wurden und die Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1 Fusionsproteins wurde bestätigt durch Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 2). Nur Ergebnisse aus der crRNA1-Transfection werden hier beschrieben, obwohl beide CrRNA Sequenzen vermeintlich bearbeiteten Populationen12hergestellt.
Im Vergleich zu der negativen Kontrolle, die keine gRNA, Cas9 Protein oder Spender Vorlage Plasmid in die Elektroporation Reaktion (nur Puffer) enthalten, die LMNB1 crRNA1 transfizierten enthalten Zellen 0,95 % mEGFP-positiven Zellen repräsentieren die vermeintlich bearbeitete mEGFP-Kern lamin B1 Bevölkerung (Abb. 3a). Dieses Ergebnis war im Bereich der Knock-in Effizienz über viele genomic Loci, die mit dieser Methode, wie bereits berichtet12beobachtet.
Die mEGFP-positiven Zellen wurden durch FACS isoliert und durch live Mikroskopie erwarteten Lokalisierung des mEGFP des Nuklearbereichs lamin B1-Fusionsproteins, die Kernhülle bestätigen abgebildet. Nach FACS-Anreicherung waren etwa 90 % der sortierten Zellen aus der LMNB1 crRNA1 Bevölkerung mEGFP-positiv (wie von Mikroskopie bestimmt), was darauf hindeutet, das einige mEGFP-Negative Zellen mit den GFP-positiven Zellen während der Sortierung Prozedur Co gereinigt. Dies war ein akzeptables Niveau der Bereicherung, die für die Kommissionierung von 96 Klonen erlaubt, die für die erfolgreiche Bearbeitung dann genetisch untersucht werden konnte. Im Allgemeinen ist ein Cut-off für erfolgreiche Bereicherung 50 % GFP positiv.
Der Großteil der sortierten Zellpopulation Fluoreszenz an die Kernhülle (nukleare Peripherie) in den nondividing Zellen angezeigt und eine erweiterte nuclear Lamina im Zytoplasma während der Mitose mit Vertrauen in die richtigen genomische bearbeiten in der LMNB1 Locus. Die angereicherte Bevölkerung enthaltenen Zellen mit entweder hell oder dunkel-Signal. Dieser Unterschied in der Signalintensität spiegeln eine Kombination der richtigen und falschen bearbeiten, Ergebnisse und Highlights, die das Dienstprogramm erzeugen eine genetisch validierte klonale Linie für weitere Studien (siehe Diskussion) (Abb. 3 b)12. Klonale Linie hinweg validiert genetisch Zellen zeigte gleichmäßige Intensität der GFP in Mikroskopie Experimente (Abb. 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig1.jpg"> Abbildung 1 . Design-Strategie für die N-Terminus GFP Kennzeichnung des LMNB1 Gens. Das GFP-Tag wurde für N-terminale Einfügung 5ʹ des ersten Exons des LMNB1 befindet sich auf Chromosom 5 entwickelt. 5ʹ und 3ʹ Homologie Arme sind 1 kb und Treffen zwischen dem Start-Codon (ATG) und dem zweiten Codon (Homologie Arme nur teilweise dargestellt in Abbildung). Zwei Kandidaten CrRNAs wurden entwickelt, um Cas9, so nah wie möglich an die vorgesehene Einstichstelle wie möglich, während immer noch einzigartig in das Genom zu Spalten führen. Sequenz zur mEGFP und eine Aminosäure Linker waren eingefügten nur 3ʹ von dem Start-Codon (mEGFP und Linker Sequenz nicht maßstabsgetreu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig2.jpg"> Abbildung 2 . Arbeitsablauf für die Herstellung von endogen getaggt klonalen Linien HiPSC. Transfektion Komponenten, einschließlich des Cas9/CrRNA/TracrRNA RNP-komplexes (dargestellt als rote Cas9 Protein mit gold CrRNA und lila TracrRNA), dem Spender Vorlage Plasmid enthält die Homologie Arme (HAs, gezeigt in Gold), und FP + Linker Sequenz (gezeigt im grün), wurden elektroporiert. Nach 4 Tagen wurden die vermeintlich bearbeitet FP-Positive Zellen angereichert durch FACS erweitert als Population durch impfen aller sortierten Zellen in einen einzigen Brunnen einer 96-Well-Platte (~ 1.000 Zellen) und dann bis mehrere Millionen Menschen arbeiten in Kultur erweitert Zellen könnten als "angereicherte Bevölkerung" geprüft werden (siehe Protokoll Schritt 3,8). Die Ausbeute an FP-positiven Zellen unterscheidet sich durch Experiment durch Variablen Zinssätzen von HDR-12; eine erfolgreiche Bereicherung umfassen in der Regel ~ 300-5.000 Zellen nach Transfektion von ca. 1,6 x 106 HiPS-Zellen. Bildgebende Voruntersuchungen bestätigt das Signal und die Lokalisierung des Fusionsproteins in der angereicherten Bevölkerung. Kolonien wurden manuell in eine 96-Well-Platte für Expansion und Kryokonservierung abgeholt. Weitere genomische Qualitätskontrolle Screening mit Tröpfchen digitalen PCR (DdPCR) und andere PCR-basierte Assays wurde dann verwendet, um richtig bearbeitete Klone als zuvor beschriebenen12zu identifizieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58130/58130fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58130/58130fig3.jpg"> Abbildung 3 . Anreicherung von vermeintlich bearbeitete Zellpopulationen. (A) Flow Cytometry Grundstücke der LMNB1 Zellen vier Tage nach Transfektion bearbeitet. Die y-Achse zeigt GFP Intensität und der x-Achse forward Scatter. Sortier Tore wurden basierend auf den Puffer nur Kontrolle festgelegt. Da HiPSCs empfindlich auf Störungen reagieren, lebenden/Toten Fleck wurde weggelassen und eine sehr konservative FSC/SSC-Tor wurde stattdessen verwendet. (B) nach der Bereicherung, bearbeitet die Bevölkerung der LMNB1 Cr1 Zellen zeigten ca. 90 % der Zellen mit GFP Lokalisierung, die Kernhülle (erwartete LMNB1 Lokalisierung). Die Bevölkerung enthaltenen Zellen unterschiedlicher Intensität der GFP sowie einige GFP-negativen Zellen. Maßstabsleisten sind 10 Mikron. (C) nach klonalen Linie Generation Zellen zeigte eine einheitliche GFP-Intensität, mit einigen Zellzyklus abhängige Unterschiede. Maßstabsleiste ist 20 Mikrometer.

Watch this Scientific Journal Video about Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endogene Protein Tagging in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9

Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

endogenous-protein-tagging-human-induced-pluripotent-stem-cells-using

Research

JoVE Journal

Genetics

26.0K Aufrufe.  Allen Institute for Cell Science. Hier beschrieben ist, dass ein Protokoll für die Markierung von endogen Proteine mit fluoreszierenden Tags in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen mit CRISPR/Cas9 ausgedrückt. Vermeintlich bearbeitete Zellen werden bereichert durch Fluoreszenz aktiviert Zellsortierung und klonale Zell-Linien entstehen.

Serie: Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

Mit Hilfe eines Fluoreszenz-PCR-Kapillar-Gel-Elektrophorese-Technik CRISPR zum Genotyp / Cas9 vermittelte Knock-out Mutanten in einem Hochdurchsatz-Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Forschung

Genetik

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Keim Urzelle Transplantation für CRISPR/Cas9-basierte in Xenopus überspringen

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Mikroinjektion CRISPR/Cas9 Protein in Channel Catfish, Ictalurus Punctatus, Embryonen für Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been co-opted as a powerful tool for precise eukaryotic genome engineering. Here, we present a rapid and simple method using chimeric single guide RNAs (sgRNA) and CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for the efficient and precise generation of genomic point mutations in C. elegans. We describe a pipeline for sgRNA target selection, homology-directed repair (HDR) template design, CRISPR-Cas9-RNP complexing and delivery, and a genotyping strategy that enables the robust and rapid identification of correctly edited animals. Our approach not only permits the facile generation and identification of desired genomic point mutant animals, but also facilitates the detection of other complex indel alleles in approximately 4 - 5 days with high efficiency and a reduced screening workload.

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

Here, we present a method to engineer the genome of C. elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and homology dependent repair templates.

Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical regions, is caused by infection with Plasmodium parasites. The development of more effective drugs to combat malaria can be accelerated by improving our understanding of the biology of this complex parasite. Genetic manipulation of these parasites is key to understanding their biology; however, historically the genome of P. falciparum has been difficult to manipulate. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been utilized in malaria parasites, allowing for easier protein tagging, generation of conditional protein knockdowns, and deletion of genes. CRISPR/Cas9 genome editing has proven to be a powerful tool for advancing the field of malaria research. Here, we describe a CRISPR/Cas9 method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in P. falciparum. This method is highly adaptable to other types of genetic manipulations, including protein tagging and gene knockouts.

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

We describe a method for generating glmS-based conditional knockdown mutants in Plasmodium falciparum using CRISPR/Cas9 genome editing.

CRISPR/Cas9 gen Bearbeitung zu machen bedingte Mutanten der menschlichen Malaria-Parasiten p. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generierung definierter genomischer Modifikationen mit CRISPR-CAS9 in humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...