Die Messung der transepitheliaalen elektrischen Impedanz wird seit den 1980er Jahren verwendet, um die Konfluenz und Barrierefunktion von epitheliaalen Monolayern in der Zellkultur zu bestimmen. Die zugrunde liegende Technik ist eine vier-Terminal-Sensorik, die verschiedene Paare von stromführenden und spannungsführenden Elektroden verwendet, um genauere Messungen zu machen. Es gibt mehrere handelsübliche Geräte zur Messung der transepitheliale Impedanz, aber trotz der Benutzerfreundlichkeit und der hohen Zuverlässigkeit gibt es auch einige Nachteile wie die nicht übersetzbare Ausgangsfrequenz und ihre Teuerkeit.
So stellen wir dar, wie man ein kostengünstiges und programmierbares Volt-Amperemeter baut. Zunächst wollen wir zeigen, wie TEER-Messungen mit handelsüblichen Geräten funktionieren. Dazu hatten wir eine Zellschicht aus Aderhautplexusepithelioal-Papillomazellen auf Transwell-Filtern mit einer Porengröße von drei Mikrometern kultiviert.
Diese Einstellung wurde von Schroten et al. als In-vitro-Modell der Blut-Zerebrospinal-Flüssigkeitsbarriere beschrieben. Nun ist eine Essstäbchenelektrode mit einem Epithelvoltammeter verbunden.
Das Gerät ist eingeschaltet und eingestellt, um den Widerstand zu messen. Die Elektrode wird in 80% Ethanol sterilisiert und anschließend in einem geeigneten Medium ausglichen. Die zu messende Impedanz dient als Referenzwert, um die Zuverlässigkeit des Volt-Amperemeters zu bewerten, das anschließend montiert wird.
In diesem Beispiel zeichnen wir eine Impedanz von 680 Ohm auf. Beginnen wir mit der Montage eines Low-Budget-Volt-Amperemeters mit programmierbarer Ausgangsfrequenz. Zuallererst benötigen Sie ein Standard-USB-Ladegerät und ein USB-Verlängerungskabel als Gleichstrom-Netzteil mit fünf Volt.
Ein 8-Bit-Mikrocontroller auf einem USB-Entwicklungsboard wird dann verwendet, um einen quadratischen Wellenstrom zu erzeugen. Vier Kabel mit Bananensteckern sind an zwei Standardmultimeter angeschlossen, um Spannung und Strom zu messen. Bitte stellen Sie sicher, dass die Multimeter in der Lage sind, Strom in einem Bereich von einigen Mikroamperen mit TrueRMS zu messen.
Ein buchser RJ14-Stecker befindet sich auf Standard-Telefonkabeln. Stellen Sie einfach sicher, dass der Stecker sechs Stifte hat, von denen mindestens die inneren vier verdrahtet sind. Schließlich benötigen Sie einige Standardausrüstung, wie unsere Kabel, ein Glanzterminal, einen 120 Kiloohm Widerstand und einige Werkzeuge als Isolationstripper, ein Crimpwerkzeug, Drahtende-Ferrules und Lötkolben.
Das Gerät wird genau wie im Layout-Diagramm dargestellt montiert. Zunächst wird die USB-Erweiterung an den Mikrocontroller angeschlossen. Während des normalen Betriebs wird es von einem Fünf-Volt-DC-USB-Ladegerät angetrieben, das leicht an einen PC zur Programmierung angeschlossen werden kann.
Zwei Kabel werden auf einer Seite abgestreift und mit Drahtend-Ferrules gekräust. Die andere Seite wird entweder direkt an Pin Null und zwei des Mikrocontrollers oder an Lötschuhe gelötet, die wiederum auf die jeweiligen Stifte geknipst werden. Als nächstes werden die stromliefernden Kabel an ein Glanzterminal angeschlossen.
Das erste Multimeter wird zur Messung des Stroms verwendet und ist in Reihe mit 120 Kiloohm Widerstand und einer stromdurchlaufenden Essstäbchenelektroden verbunden. Diese Anordnung stellt sicher, dass der Ausgangsstrom begrenzt ist, so dass die Messung keine Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit hat. Die vier Leiter des Telefonverlängerungskabels werden demontiert und wie zuvor gezeigt an Ferrules gekräuscht.
Sobald das Kabel vorbereitet ist, müssen Sie die Kontinuität der Leiter und Stifte testen. In unserem Beispiel sind Pin drei bis sechs mit dem weißen, braunen, grünen und gelben Leiter verbunden. Jetzt sind Pin fünf und sechs, also grün und gelb, mit der Glanzklemme verbunden, um Spannung auf das äußere Elektrodenpaar anzuwenden.
Schließlich müssen Sie das zweite Multimeter, das verwendet wird, um den transepitheliale Spannungsabfall zu messen, an die Pins drei und vier anschließen, d. h. in unserem Beispiel an den weißen und braunen Leiter. Wir haben uns entschieden, die Installation in einem billigen Kunststoff-Chassis zu montieren. Vor der ersten Verwendung muss der Mikrocontroller programmiert werden.
Der Quellcode ist in C+ geschrieben und kann über einen USB-Stick hochgeladen werden. Kurz gesagt, pin zero in einen mittleren Ausgabemodus. Wenn eingeschaltet, beginnt die Funktionsschleife als Pins zwischen Masse und plus fünf Volt mit variabler Verzögerung zu wechseln.
In unserem Beispiel haben wir eine theoretische Halbschwingungszeit von 40 Millisekunden verwendet. Sehen wir uns an, wie sich die Messergebnisse mit den zuvor ermittelten Referenzwerten vergleichen. Die Essstäbchenelektrode wird auf das kürzlich montierte Volt-Ammeter neu positioniert.
Das Gerät wird in drei Schritten eingeschaltet. Das heißt, ein USB-Ladegerät anschließen, das linke Multimeter auf AC-Spannungsmessung umstellen und das zweite Multimeter auf Mikroampere umschalten. Achten Sie darauf, dass Wechselstrom explizit ausgewählt werden muss.
In diesem Beispiel wird der potenzielle Abfall über das Transwell-Filtersystem als etwa 25 Millivolt gemessen, während wir einen Strom von 37,1 Mikroamperen aufzeichnen. Nach Ohms Gesetz kann die elektrische Impedanz leicht mit 674 Ohm berechnet werden, was sehr nahe am Referenzwert von 680 liegt. Wir haben gezeigt, dass Messwerte über einen Bereich von null bis 1,8 Kiloohm zuverlässig sind.
Somit kann das beschriebene Voltamperemeter sowohl für erste Experimente als auch für weitere Studien verwendet werden. Wenn Ihre Ergebnisse jedoch veröffentlicht werden sollen, sollten Sie Ihre Daten immer unterstützen, indem Sie den Molekülfluss über die jeweilige Zellschicht messen.
