Wir sind dankbar, dass Professor Richard Borgens, Center für Lähmungen Research, Purdue University, um Hilfe bei der Zusammenstellung der vibrierenden Sonde System. Diese Studie wurde von NEI gewähren NIH 1R01EY019101 auf MZ und BR unterstützt und zum Teil durch Zuschüsse aus dem California Institute of Regenerative Medicine RB1-01417, NSF MCB-0951199, und durch einen zweckgebundenen Zuschuss von Forschung zur Erblindung, UC Davis Ophthalmology verhindern.

1. Probe Herstellung Blank-Sonden werden von World Precision Instruments gekauft (Elgiloy / Edelstahl parylenbeschichteten Mikroelektroden) (siehe &quot;Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte&quot; unten). Die Sonde ist 25-30 mm hinter der Spitze geschnitten und ca. 5 mm von Parylen Isolierung an das abgeschnittene Ende schabte mit einem Skalpell (# 11 Klinge), um eine gute Verbindung zu gewährleisten. Die Sonde ist in einem Gold-R30-Anschluss mit elektrisch leitfähigem Silber beladenen Epoxid (zB Rite-Lok SL65) [* siehe Anmerkung unten] montiert. Die Sonde wird über Nacht bei Raumtemperatur gelagert, um das Epoxidharz aushärten lassen. Als nächstes wird die Sondenspitze mit Gold und Platin beschichtet, mit einer Nano-Ampere-Stromversorgung. Die Sondenspitze ist in Aceton gespült und mit dem negativen Ausgang eines nano-Amp-Stromquelle. Die Sondenspitze ist unter einem Binokular (x40) angesehen und die erste in Vergoldung Lösung (Kaliumdicyanoaurat (0,2% w / v KAu (CN) 2 in destilliertem Wasser (dH 2 O)). Ein Verweis Draht verbunden, um die positive platziert Ausgang und in Lösung schließt den Kreislauf. Ein Strom von 5 nA ist für 5 min, dann auf 20 nA erhöht, bis die Spitze ist etwa die Hälfte der gewünschte Endgröße (ca. 10-15 um) aufgebracht. Die Sondenspitze ist in dH gespült 2 O und dann in Platinierungslösung (Chlorplatinsäure Hydrat; 1% w / v H2PtCl6 * 6 H 2 O) plus Blei (II)-Trihydrat (0,1% w / v Pb (CH3CO 2) 2 * 3H 2 O in dH 2 O). Ein Strom von 250 nA ist angelegt für 5 min, dann erhöhte sich auf 500 nA bis die Spitze liegt bei ca. 80% der gewünschte Endgröße. Der Strom auf 1 uA erhöht und angewendet in 1 sec platzt, bis die endgültige Spitzendurchmesser erreicht ist (ca. 30-35 um). Schließlich ist die Spitze in dH 2 O. Probes gespült speichern kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit. Wenn Sonden beschädigt sind, das Gold R30-Anschlüsse können wieder verwendet werden. [* Hinweis: Einige Sonde Systeme der Sonde Montage direkt an den Verstärker angeschlossen, um das Signal zu tragen. Andere Systeme verfügen über einen separaten Befestigungspunkt und Signal-Anschluss. Im letzteren Fall ist eine kurze (2-3 cm) Draht mit einem R30-Stecker an einem Ende mit der ersten R30-Anschluss vor dem Einbau der Sonde (siehe Abbildung 2A) gelötet.] 2. Probe System Die Sonde ist mit einem piezoelektrischen bender befestigt montiert auf einem 3-dimensionale Mikro-Stellungsregler (Abbildung 1). Probe Vibration wird durch die schwingende Sonde Stromversorgung, die auch ermöglicht die Einstellung der Schwingungsamplitude und Frequenz angesteuert. Die Sonde Stromversorgung sendet ein Referenzsignal an den Lock-in-Verstärker, der zeigt auch die Schwingungsfrequenz und Phasenwinkel. Es ist auch nützlich, um ein Oszilloskop zu verbinden, so man eine schnelle visuelle Referenz der Sonde Schwingung hat. Das Signal von der Sonde geht auf die Lock-in-Verstärker. Die Sonde und Probe gemessen werden kann mit einem Binokular (Vergrößerung x6 auf x40) mit Glasfaser-Beleuchtung angezeigt werden. Während der Kalibrierung und Messungen der Proben, muss ein Verweis und eine Masse (Erde) Draht in die Lösung sein (siehe Abbildung 2B). Der Verstärker an einen Computer erfolgt über einen Analog-Digital-(i / o)-Schnittstelle angeschlossen. Die Daten werden aufgezeichnet mit Strathclyde Elektrophysiologie Software Whole Cell Program (WinWCP). Lock-in Verstärker-Einstellungen: Empfindlichkeit [200 uV], Dynamic Resolution [normal], Offset [on], Expand [x1], Time Constant: pre [10 s], post [0,1 s]. Wenn eine schnellere Reaktion erforderlich ist, kann der pre Zeitkonstante bis 3 s reduziert werden Die Offset-Steuerung wird verwendet, um die Sonde Spur zu bringen, die Mitte des Bildschirms in der Nähe. Wenn große Reaktionen zu erwarten sind, kann die Spur bis oder unten verschoben werden. WCP Software-Einstellungen: Record Dauer [204,8 s], Samples pro Kanal [1024], Sampling Interval [0,2 s], Spannungsbereich [+ / - 0,2 V]. Wenn große Ströme zu erwarten sind, kann der Spannungsbereich bis 1 V oder 5 V erhöht werden 3. Probe-Einstellungen Neue Sonden müssen getestet werden und ihre eigene Frequenz und Phasenwinkel bestimmt. Die neue Sonde ist in der Kalibrierkammer mit physiologischer Kochsalzlösung (Abbildung 2B) platziert. Die Stromversorgung wird eingeschaltet, und die Frequenz eingeschaltet, bis die maximale Schwingung beobachtet. Dies ist die Resonanzfrequenz der Sonde. Mit der Sonde bei dieser Frequenz kann Instabilität verursachen und produzieren Lärm in der Aufnahme, so wird die Sonde &quot;de-tuned &#39;durch Subtraktion 10 Hz bis die Sonde Arbeitsfrequenz (typischer Wert von 150-200 Hz) geben. Die Schwingungsamplitude wird so eingestellt, dass die Sonde Vibrationen Abstand die gleiche wie die Spitze Durchmesser (siehe Abbildung 2B), so dass, wenn die Sonde eine &quot;doppelte Bild&quot; der Sondenspitze wird in Schwingung versetzt wird gesehen. Zur Bestimmung der Phasenwinkel, wird die Sonde in Kochsalzlösung in die Kalibrierung Kammer platziert und ein Strom von 1,5 uA / cm 2 aufgetragen wiederholt. Der Phasenwinkel auf der Lock-in-Verstärker wird so eingestellt, bis es keine Antwort gibt. Addieren oder Subtrahieren 90 ° zu dieserWinkel gibt die maximale Reaktionszeit, und dieser Winkel ist die Sonde arbeitet Phasenwinkel. Die Frequenz und Phasenwinkel für jede Sonde sind für zukünftige Anwendungen zur Kenntnis genommen. Während eines Experiments ist es wichtig, dass diese Einstellungen von Frequenz, Amplitude und Phasenwinkel nicht geändert werden, da dies die Sonde die Reaktion verändern wird. Für die Bequemlichkeit, wenn der Strom fließt &#39;South-to-Nord &quot;, sollte diese erzeugen ein Ausschlag nach oben (hier&#39; Peak &#39;genannt) in der Aufzeichnung zu verfolgen und fließende Strom&#39; Nord-Süd-&quot; sollte eine Auslenkung nach unten zeigen ( siehe Abbildung 3A). Ist dies der falsche Weg, dann Zugabe von 180 ° um den Phasenwinkel es durch Umklappen der Antworten rund beheben. Siehe Reid et al. 1 für detaillierte Informationen über die Theorie hinter Sonde Funktion, Kalibration, etc. Kalibrierung: Die Reaktion der Sonde auf eine &quot;standardisierte&quot; Strom von genau 1,5 uA / cm 2, angewandt auf die Sonde in einem Kalibrierkammer, wird verwendet, um den Strom in der Probe zu berechnen (siehe Abbildung 2B, 3A). Vor Probe-Messung wird die Sonde in geeignete Lösung, zB BSS + künstliche Tränenflüssigkeit Lösung für Hornhaut kalibriert. Nord-Süd-und Nord-Süd, wodurch ein nach oben und nach unten Durchbiegung bzw. entspricht nach außen und innen Ströme, je nach Ausrichtung der Probe: Der Strom wird in zwei Richtungen aufgetragen. Die Sonde verfolgen sollte eine stabile Basislinie und geringes Rauschen (vgl. Abb.. 3A und 3B). Die Sonde wird am Ende des Experiments in verwendete Lösung zur Osmolalität Änderung durch Verdunstung auszugleichen kalibriert. Bei der Analyse von Daten, können die Messungen aus der ersten Hälfte des Experiments anhand der Kalibrierung beginnen Werte und Messungen aus der zweiten Hälfte errechnet Ende Kalibrierung werden. Beispiel Messung: Eine Kammer kann so ausgelegt zu halten und zu immobilisieren der Probe sein. Zum Beispiel zeigt Abbildung 3C Petrischalen mit Drahtschlingen die Augen für die Hornhaut-Messungen zu halten. Die Schale mit physiologischer Kochsalzlösung unter dem Binokular und im Bereich der Zinsen auf die Probe im Fokus in das Blickfeld platziert. Die Sonde wird dann in Lösung und orientiert parallel zur Probenoberfläche und auch im Fokus gelegt, damit es auf dem gleichen Niveau wie der Punkt auf der Probe gemessen werden soll. Die Sonde ist so weit wie praktisch (z. B. 1-2 cm) entfernt von der Probe bewegt, wandte sich die Schwingung auf (und die Computer-Software gesetzt, um record), um eine stabile (horizontal) Baseline (siehe Abbildung 4A) zu etablieren. Die Sonde wird dann in die Messposition bewegt, etwa 50 um von der Oberfläche. Wenn der neue (&#39;peak&#39;)-Wert stabil ist, wird die Sonde zurück zur Referenz-Position verschoben und die Spur auf den Ausgangswert zurück. Dies kann in regelmäßigen Zeitpunkten wiederholt werden, um Zeitraffer Daten zu erzeugen, oder die Probe bewegt / leicht gedreht und wiederholt an verschiedenen Positionen, um räumliche aktuelle Kartendaten liefern (siehe Abbildung 4B, 5B). Datenanalyse: Daten werden analysiert mit WinWCP (siehe Abbildung 5A). Die horizontale rote &quot;Null&quot;-Linie ist nach oben oder unten bewegt, so ist parallel zur Spur Ausgangswert vor der Messung Gipfel ist. Die vertikale grüne Messleitung ist über die Trace-Basislinie bewegt. Die Ausgabe liest in grün am Ende der grünen Linie sollte nahe Null (zB 0,00012). Diese Zahl zeigt die differnce zwischen dem Punkt, wo die roten und grünen Linien kreuzen, und die blaue Kurve. Die rote Linie ist dann, bis sie parallel mit der Spitze des Gipfels verschoben wird. Die grüne Ausgabe zu lesen ist die Größe des Peaks in mV. Die Daten für alle Mess-Spitzen, und die Kalibrierungsdaten werden in eine Microsoft Excel-Arbeitsblatt-Vorlage (siehe Tabelle 1) setzen. Relevante Informationen wie das Datum, die Sonde Zahl, Spannungsbereich (VR), Lösung eingesetzt, Messpositionen, Zeit-Punkte, etc. können auch in der Tabelle gesetzt werden. Die aktuelle Richtung (in oder aus der Probe: &#39;i / o&#39;) wird darauf hingewiesen, und Einwärtsströme auch einen negativen Wert in der &quot;Peak&quot;-Spalte angegeben. Der Strom in der rechten Spalte ist nach folgender Formel berechnet: Strom = Spitzenleistung * (1.5/calibration) wo 1,5 wird der Strom in uA / cm 2 angewendet bei der Kalibrierung. Also: &quot;unw1 &#39;= 12,45 * (1.5/56.12) = 0,33276907 uA / cm 2. 4. Secrets to Success Wie in allen Elektrophysiologie, hilft eine ordnungsgemäße Erdung (Erdung) lebenswichtige Geräte zu eliminieren. So zumindest der Mikro-Stellungsregler und das Chassis des Mikroskops sollten geerdet werden, und vielleicht auch die Lichtquelle (siehe Abbildung 1). Der Benutzer kann auch eine Quelle der statischen Elektrizität werden, so Erdung über ein Handgelenk-Band kann Instabilität der Sonde in einigen Fällen zu verhindern, ist aber nicht immer notwendig. Ein Faraday-Käfig ist nicht erforderlich, da die Lock-in-Verstärker filtert alle Frequenzen (zB 60Hz aus Stromnetz) abgesehen von der Frequenz der Sonde am schwingt. Eine Schwingungsisolation Tabelle ist nützlich, aber nicht unbedingt erforderlich. Eine solide, stabile Werkbank oder Tisch funktioniert genauso gut. Abgesehen von den grundlegendenInformationen in der Excel-Tabelle (siehe oben) ist es sinnvoll, in einem Labor-Buch weitere nützliche Informationen wie Veränderungen in der Temperatur, Drogen-Ergänzungen, etc. aufnehmen Wenn Fotos unten die Lupe genommen werden, beachten Sie die Vergrößerung. Gegebenenfalls ist es auch nützlich, um eine Skizze der Probe (n) zeigt Position und / oder Orientierung der Sonde Messungen (siehe Abbildung 6) zu zeichnen. Herausfordernde Schritte <ol class="lalpha"><li> Probe machen: Es muss eine gute elektrische Verbindung zwischen der Sonde und der R30-Anschluss sein. Wenn nichts passiert in der Galvanik stattfindet, dann ist dies wahrscheinlich die Ursache. </li><li> Kalibrierung: geeignete Kochsalzlösung oder Kulturmedium für die Probe Sie messen wird. Nicht über-oder unter-fill der Kalibrierkammer, da dies die Reaktion verändern kann. Die Oberfläche der Flüssigkeit sollte im oberen Bereich der Kammer flach. </li><li> Probe-Messungen: Planen Sie im Voraus, nicht zB die Sie benötigen, um eine spezielle Kammer zu halten / mount der Probe (siehe Abbildung 3C) zu machen? Bei der Messung von einer Probe, die Sonde sollte so ausgerichtet, dass die lange Achse parallel zur Probenoberfläche, so dass die Sonde die Richtung der Schwingung (und damit Richtung des Stroms gemessen) senkrecht auf die Probenoberfläche (z. B. siehe Bild 4B ). Die Probe kann und / oder gedreht für Messungen an verschiedenen Positionen bewegt werden. Es ist wichtig, einen konstanten Abstand zwischen der Sonde und der Probenoberfläche zu erhalten, wenn die Messung. Der gemessene Strom ist proportional zum Abstand von der Probenoberfläche, als die Sonde bewegt sich weg von der Probenoberfläche fällt der Strom durch die inverse quadratische Gesetz. Das heißt, wenn die Messung einen Strom an der Probenoberfläche erzeugt wird, wird die aktuelle erkannt umgekehrt proportional zum Quadrat der Entfernung von der Oberfläche. Ein Okularstrichplatte kann verwendet werden, um den Abstand zwischen der Sonde und der Probenoberfläche zu beurteilen. </li></ol> Fehlerbehebung <ul><li> Problem: keine Reaktion bei der Kalibrierung. Lösung: Überprüfen Sie Salzlösung Kontakt beider Elektroden. Überprüfen Sie die Batterie in konstanten Strom-Kalibrator. </li><li> Problem: geringe Resonanz. Lösung: saubere Sonde in dH 2 O und / oder Aceton. Überprüfen Sie Phasenwinkel. </li><li> Problem: Rauschen oder instabile Basislinie (siehe Abbildung 3B). Lösung: Überprüfen Sie Erdungskabel. </li><li> Problem: trace springt aus dem Bild. Lösung: nicht zulässig Sondenspitze Probe zu berühren. </li></ul> 5. Repräsentative Ergebnisse 3A zeigt ein gutes Beispiel für eine Kalibrierung zu verfolgen. Beachten Sie die stable (horizontal) Baseline, geringes Rauschen und große Resonanz. Zum Vergleich zeigt Abbildung 3B eine laute Spur mit instabilen Grundlinie. Aktuelle Messungen an verschiedenen Positionen bei einer Maus Hornhaut Wunde sind in Abbildung 4B gezeigt. Das obere Feld zeigt die Sonde Positionen, zeigt der Mitteltafel die Sonde Spuren wie auf dem Computer erfasst und die untere Platte ist eine graphische Darstellung der Ströme an den verschiedenen Positionen, zeigt ein Profil der Wunde Strom. 5B zeigt Messungen an einer Maus Hautwunde in regelmäßigen Zeitabständen an den Daten auf der Wunde aktuellen Zeit-Verlauf zu erzeugen. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Vibrating Tastsystem. Siehe Text für ausführliche Erläuterungen. Blauer Text beschreibt die Funktion der Anschlussdrähte. Grüne Symbole zeigen Erdungspunkte. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. A. Probe Montage. Die Sonde wird in einem goldenen R30-Stecker mit Silber beladenen Epoxy, vor Elektroporation geklebt. In manchen Systemen ist ein zweiter Anschluss mit einem kurzen Draht um das Signal zu tragen aufgelötet. Maßstabsleiste 3 mm. Die Platin-Ball ist nicht maßstabsgetreu. B. Probe Kalibrierung. Der konstante Strom-Kalibrator (links) gilt ein Strom von 1,5 uA / cm 2, um die Sonde in der Kalibrierkammer (rechts). Unten links: Nahaufnahme von einer Sonde. Wenn die Sonde in Schwingung versetzt wird (unten rechts) ist die Amplitude so eingestellt, eine doppelte-Bild von der Spitze zu sehen ist. Maßstabsbalken 100 um. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. A. Tastkopfkalibrierung Spur. Beispiel für eine gute Kalibrierung der Sonde zu verfolgen, mit einer stabilen Grundlinie, geringes Rauschen und große Resonanz. Strom fließt von Süden nach Norden gibt einen Ausschlag nach oben und fließt Nord-Süd-erzeugt eine Auslenkung nach unten. B. Ein instabiles, laut Sonde zu verfolgen. C. Chambers gemacht für die Montage der Maus (links) oder Ratte (rechts) die Augen für Hornhaut-Messungen. Maßstabsbalken 5mm. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Beweisen Messung Beispiele. A. Eine stabile Basislinie mit der Sonde in Bezug Position 1-2 aus der Stichprobe ermittelt. Wenn die Sonde zur Messung Position in der Nähe der Probe bewegt wird, erkennt es sich um eineStrom und die Spur lenkt nach oben (außen Strom). B. Messungen an verschiedenen Stellen über eine Maus Hornhaut würde. Probe orientiert sich parallel zur Oberfläche, so Vibrationen senkrecht. Upward Peaks zeigen Auswärtsströme. Maximaler Strom wird an den Wundrändern gesehen (Positionen B &amp; F). Die schematische Darstellung der Sonde ist bei Messposition F (rechts Wundrand) gezeigt. Maßstabsbalken 300 um. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig5.jpg" alt="Abbildung 5" /> Abbildung 5. A. Analyse-Sonde Spuren. Oben: die rote Null-Linie nach oben oder unten bewegt, so ist parallel mit der Spur Ausgangswert, dann die grüne Messleitung ist über die Grundlinie bewegt, so die Ausgabe zu lesen in grün ist nahe Null (0,00012). Unten: Die rote Linie ist dann, bis sie parallel mit der Spitze der Spur Spitze bewegt wird, und die Ausgabe zu lesen gibt die Größe des Peaks in mV (12.45). Der Strom wird von diesem mit der Kalibrierdaten (siehe Tabelle 1) berechnet. B. Maus Hautwunde Zeitraffer Daten. Aktuelle vor Verwundung ist zum Zeitpunkt Null (rotes Symbol) dargestellt. Die Messungen wurden an der gleichen Position bei einer Maus Hautwunde in regelmäßigen Zeitpunkten nach der Verletzung gemacht. Nach anfänglichen transienten Einwärtsströme (unter Null), umgekehrt die aktuelle und die nach außen Ströme (positive) erhob sich langsam und abgeflacht. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358fig6.jpg" alt="Abbildung 6" /> Abbildung 6. Lab-Buch Skizzen Sonde Messpositionen. A. Rattenhirn; roten Punkte zeigen Messpositionen und Sonde Symbole zeigen Sonde Orientierung. B. Rat Hornhaut Wunde, rote Punkte zeigen Messpositionen und Pfeile zeigen Richtung des Stroms gemessen. <img src="/files/ftp_upload/2358/2358tab1.jpg" alt="Tabelle 1" /> Tabelle 1. Beispiel für Excel-Tabelle für die Speicherung und die Quantifizierung Sonde Daten. pN2_cal1 = Start Kalibrierung; cal + und CAL-= Kalibrierwerte in mV; VR = Spannungsbereich, peak = Probe Messungen in mV, i / o = Stromfluss (in oder aus der Probe).

<ol>
	<li>Reid, B., Nuccitelli, R., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-invasive+measurement+of+bioelectric+currents+with+a+vibrating+probe.">Non-invasive measurement of bioelectric currents with a vibrating probe.</a> Nat. Protoc. 2, 661-9282 (2007).</li><li>Reid, B., Song, B., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+healing+in+rat+cornea:+the+role+of+electric+currents.">Wound healing in rat cornea: the role of electric currents.</a> FASEB J. 19, 379-386 (2005).</li><li>Lois, N., Reid, B., Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+and+lens+regeneration+in+the+rat.">Electric currents and lens regeneration in the rat.</a> Exp. Eye Res. 90, 316-323 (2010).</li><li>Wang, E., Reid, B., Lois, N., Forrester, J. V., McCaig, C. D., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+inhibition+of+lens+epithelial+cell+proliferation:+an+additional+factor+in+secondary+cataract.">Electrical inhibition of lens epithelial cell proliferation: an additional factor in secondary cataract.</a> FASEB J. 19, 842-844 (2005).</li><li>Guo, A., Song, B., Reid, B., Gu, Y., Forrester, J. V., Jahoda, C., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+physiological+electric+fields+on+migration+of+human+dermal+fibroblasts.">Effects of physiological electric fields on migration of human dermal fibroblasts.</a> J. Invest. Derm. , (2010).</li><li>Reid, B., Song, B., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electric+currents+in+Xenopus+tadpole+tail+regeneration.">Electric currents in Xenopus tadpole tail regeneration.</a> Dev. Biol. 335, 198-207 (2009).</li><li>Zhao, M., Song, B., Pu, J., Wada, T., Reid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-&#947;.">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-&#947;.</a> 442, 457-460 (2006).</li><li>Reid, B., EO, G. r. a. u. e. -. H. e. r. n. a. n. d. e. z., Mannis, M. J., Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+endogenous+electric+currents+in+human+corneal+wounds+-+a+novel+approach+of+bioelectric+stimulation+without+electrodes.">Modulating endogenous electric currents in human corneal wounds - a novel approach of bioelectric stimulation without electrodes.</a> Cornea. , (2010).</li><li>Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ultrasensitive+vibrating+probe+for+measuring+steady+extracellular+currents.">An ultrasensitive vibrating probe for measuring steady extracellular currents.</a> J. Cell Biol. 63, 614-628 (1974).</li><li>Hotary, K. B., Nuccitelli, R., Robinson, K. 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Wir beschreiben eine kostengünstige, einfach, aber sehr empfindlich vibrierenden Sonde zur Messung nicht-invasiv elektrischen Strom in einer Vielzahl von biologischen Systemen. Mögliche Änderungen <ol><li> Wenn Platin / Iridium-Elektroden (World Precision Instruments, cat # PTM23B20) anstelle von Edelstahl verwendet werden, dann wird die Goldschicht Bühne beseitigt werden kann. </li></ol> Anwendungen Wir haben die schwingende Sonde verwe...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>Eligoy-Stainless Electrode</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SSM33A70</td>
<td>76 mm, 7 M&Omega;, 1-2&mu;m tip</td>
</tr>
<tr>
<td>Gold R30 connector</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>www.vectorelect.com</td>
<td>R30</td>
<td>Re-usable</td>
</tr>
<tr>
<td>Silver-loaded epoxy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>3M</td>
<td>SL65</td>
<td>Mix 1-part Resin with 1-part Hardener</td>
</tr>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Olympus</td>
<td>SZ40</td>
<td>Magnification x6 to x40</td>
</tr>
<tr>
<td>Potassium dicyanoaurate (KAu(CN)2)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>379867</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Chloroplatinic acid hydrate (H2PtCl6 x 6H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>520896</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Lead(II) acetate trihydrate (Pb(CH3CO2)2 x 3H2O)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>185191</td>
<td>CAUTION: Toxic</td>
</tr>
<tr>
<td>Nano-Amp power source</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>-</td>
<td>Powered by six 1.5 V (AAA) batteries</td>
</tr>
<tr>
<td>3-dimensional micro-positioner</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Line Tool Co.</td>
<td>Model H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lock-in amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stanford Research Systems</td>
<td>SR530</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digital I/O interface</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>PCI-6220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Shielded Connector Block with BNC connections</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National instruments</td>
<td>BNC-2110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Strathclyde Electrophysiology Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>University of Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, UK</td>
<td>WinWCP V4.1.5</td>
<td>Free download from: <a href="http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm">http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</a></td>
</tr>
<tr>
<td>Calibration Chamber</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Made in-house</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Constant Current Calibrator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vibrating Probe Company</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Powered by one 9 V (PP3) battery</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

measurement of bioelectric current with a vibrating probe

Elektrische Felder, durch aktiven Transport von Ionen erzeugt werden, sind in vielen biologischen Systemen und dienen oft wichtige Funktionen in Geweben und Organen. Zum Beispiel spielen sie eine wichtige Rolle bei der Ausrichtung der Zellwanderung während der Wundheilung. Hier beschreiben wir die Herstellung und Verwendung von hochempfindlichen vibrierende Sonden zur Messung von extrazellulären elektrischen Strömen. Die Sonde ist ein isolierter, geschärft Metalldraht mit einem kleinen Platin-schwarzer Spitze (30-35 um), die Ionenströme in die uA / cm 2-Bereich erkennt in physiologischer Kochsalzlösung. Die Sonde wird auf etwa 200 Hz durch einen piezoelektrischen bender vibrierte. In Anwesenheit eines Ionenstrom, erkennt die Sonde eine Spannung zwischen den Extremen der Bewegung. Ein Lock-in-Verstärker filtert Störgeräusche durch Sperren auf, um die Sonde die Frequenz der Schwingung. Die Daten werden auf Festplatte aufgezeichnet. Die Sonde wird am Anfang und am Ende der Experimente in entsprechende Kochsalzlösung kalibriert, mit einer Kammer, die eine aktuelle gilt von genau 1,5 uA / cm 2. Wir beschreiben, wie die Sonden zu machen, das System einzurichten und zu kalibrieren. Wir zeigen auch die Technik der Hornhaut-Messung, und zeigen einige repräsentative Ergebnisse aus verschiedenen Proben (Hornhaut, Haut, Gehirn).

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Die Herstellung, Kalibrierung und Verwendung von nicht-invasive vibrierende Sonden zur bioelektrischen Strom in verschiedenen biologischen Systemen zu messen beschrieben.

Die Messung der bioelektrischen Strom mit einem vibrierenden Sonde

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

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14.1K Aufrufe.  University of California, Davis. Die Herstellung, Kalibrierung und Verwendung von nicht-invasive vibrierende Sonden zur bioelektrischen Strom in verschiedenen biologischen Systemen zu messen beschrieben.

Serie: Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium. We have developed tissue surface tensiometry (TST) specifically to measure the surface free energy of interaction between cells. The biophysical concepts underlying TST have been previously described in detail1,2. The method is based on the observation that mutually cohesive cells, if maintained in shaking culture, will spontaneously assemble into clusters. Over time, these clusters will round up to form spheres. This rounding-up behavior mimics the behavior characteristic of liquid systems. Intercellular binding energy is measured by compressing spherical aggregates between parallel plates in a custom-designed tissue surface tensiometer. The same mathematical equation used to measure the surface tension of a liquid droplet is used to measure surface tension of 3D tissue-like spherical aggregates. The cellular equivalent of liquid surface tension is intercellular binding energy, or more generally, tissue cohesivity. Previous studies from our laboratory have shown that tissue surface tension (1) predicts how two groups of embryonic cells will interact with one another1-5, (2) can strongly influence the ability of tissues to interact with biomaterials6, (3) can be altered not only through direct manipulation of cadherin-based intercellular cohesion7, but also by manipulation of key ECM molecules such as FN8-11 and 4) correlates with invasive potential of lung cancer12, fibrosarcoma13, brain tumor14 and prostate tumor cell lines15. In this article we will describe the apparatus, detail the steps required to generate spheroids, to load the spheroids into the tensiometer chamber, to initiate aggregate compression, and to analyze and validate the tissue surface tension measurements generated.

We describe a method of measuring binding energy, expressible as tissue surface tension, between cells within 3D tissue-like aggregates. Differences in tissue surface tension have been demonstrated to correlate with invasiveness of lung, muscle, and brain tumors, and are fundamental determinants of establishing spatial relationships between different cell types.

Die Messung der Aggregate Zusammenhalt durch Gewebeoberfläche Tensiometrie

Rigorous measurement of intercellular binding energy can only be made using methods grounded in thermodynamic principles in systems at equilibrium.  We ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescent Nanoparticles for the Measurement of Ion Concentration in Biological Systems

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion fluxes at the cellular level are required for initiating action potentials in excitable cells.2 Sodium regulation plays an important role in both of these cases; however, no method currently exists for continuously monitoring sodium levels in vivo 3 and intracellular sodium probes 4 do not provide similar detailed results as calcium probes. In an effort to fill both of these voids, fluorescent nanosensors have been developed that can monitor sodium concentrations in vitro and in vivo.5,6 These sensors are based on ion-selective optode technology and consist of plasticized polymeric particles in which sodium specific recognition elements, pH-sensitive fluorophores, and additives are embedded.7-9 Mechanistically, the sodium recognition element extracts sodium into the sensor. 10 This extraction causes the pH-sensitive fluorophore to release a hydrogen ion to maintain charge neutrality within the sensor which causes a change in fluorescence. The sodium sensors are reversible and selective for sodium over potassium even at high intracellular concentrations.6 They are approximately 120 nm in diameter and are coated with polyethylene glycol to impart biocompatibility. Using microinjection techniques, the sensors can be delivered into the cytoplasm of cells where they have been shown to monitor the temporal and spatial sodium dynamics of beating cardiac myocytes.11 Additionally, they have also tracked real-time changes in sodium concentrations in vivo when injected subcutaneously into mice.3 Herein, we explain in detail and demonstrate the methodology for fabricating fluorescent sodium nanosensors and briefly demonstrate the biological applications our lab uses the nanosensors for: the microinjection of the sensors into cells; and the subcutaneous injection of the sensors into mice.

Fluorescent nanoparticles produced in our lab are used for imaging ion concentrations and ion fluxes in biological systems such as cells during signaling and interstitial fluid during physiological homeostasis.

Fluoreszierende Nanopartikel für die Messung von Ionen-Konzentration in biologischen Systemen

Tightly regulated ion homeostasis throughout the body is necessary for the prevention of such debilitating states as dehydration.1 In contrast, rapid ion ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a combination of bright field and differential interference contrast imagery. Two primary approaches are presented: noninterferometric quantitative phase microscopy (NIQPM), to perform measurements of total cell mass and subcellular density distribution, and Hilbert transform differential interference contrast microscopy (HTDIC)&#160;to determine volume. NIQPM is based on a simplified model of wave propagation, termed the paraxial approximation, with three underlying assumptions: low numerical aperture (NA) illumination, weak scattering, and weak absorption of light by the specimen. Fortunately, unstained cellular specimens satisfy these assumptions and low NA illumination is easily achieved on commercial microscopes. HTDIC is used to obtain volumetric information from through-focus DIC imagery under high NA illumination conditions. High NA illumination enables enhanced sectioning of the specimen along the optical axis. Hilbert transform processing on the DIC image stacks greatly enhances edge detection algorithms for localization of the specimen borders in three dimensions by separating the gray values of the specimen intensity from those of the background. The primary advantages of NIQPM and HTDIC lay in their technological accessibility using &#8220;off-the-shelf&#8221; microscopes. There are two basic limitations of these methods: slow z-stack acquisition time on commercial scopes currently abrogates the investigation of phenomena faster than 1 frame/minute, and secondly, diffraction effects restrict the utility of NIQPM and HTDIC to objects from 0.2 up to 10 (NIQPM) and 20 (HTDIC) &#956;m in diameter, respectively. Hence, the specimen and its associated time dynamics of interest must meet certain size and temporal constraints to enable the use of these methods. Excitingly, most fixed cellular specimens are readily investigated with these methods.

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Optische Mikroskopie: Messung der Cellular biophysikalische Eigenschaften mit einem Standard Optisches Mikroskop

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

Ein Mikrofluidiktechnik to Cell Verformbarkeit Sonde

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

Oberflächenpotentialmessung von Bakterien mit Kelvin-Sonde Kraftmikroskopie

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Fabrication of a Dipole-assisted Solid Phase Extraction Microchip for Trace Metal Analysis in Water Samples

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water samples. A brief overview of the evolution of chip-based SPE techniques is provided. This is followed by an introduction to specific polymeric materials and their role in SPE. To develop an innovative dipole-assisted SPE technique, a chlorine (Cl)-containing SPE functionality was implanted into a poly(methyl methacrylate) (PMMA) microchip. Herein, diverse analytical techniques including contact angle analysis, Raman spectroscopic analysis, and laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry (LA-ICP-MS) analysis were employed to validate the utility of the implantation protocol of the C-Cl moieties on the PMMA. The analytical results of the X-ray absorption near-edge structure (XANES) analysis also demonstrated the feasibility of the Cl-containing PMMA used as an extraction medium by virtue of the dipole-ion interactions between the highly electronegative C-Cl moieties and the positively charged metal ions.

The fabrication protocol of a dipole-assisted solid phase extraction microchip for the trace metal analysis is presented.

Die Herstellung einer Dipole-unterstützte Festphasenextraktion Microchip für die Spurenanalyse in Wasserproben

This paper describes a fabrication protocol for a dipole-assisted solid phase extraction (SPE) microchip available for trace metal analysis in water ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps compared to standard metallographic sample preparation procedures. The paper proposes a novel bespoke rig for dynamic domain imaging with in situ BH (magnetic hysteresis) measurements and elaborates the protocols for the sensor preparation and the use of the rig to ensure accurate BH measurement. The protocols for static and ordinary dynamic domain imaging (without in situ BH measurements) are also presented. The reported method takes advantage of the convenience and high sensitivity of the traditional Bitter method and enables in situ BH measurement without interrupting or interfering with the domain wall movement processes. This facilitates establishing a direct and quantitative link between the domain wall movement processes&#8211;microstructural feature interactions in ferritic steels with their BH loops. This method is anticipated to become a useful tool for the fundamental study of microstructure&#8211;magnetic property relationships in steels and to help interpret the electromagnetic sensor signals for non-destructive evaluation of steel microstructures.

Optimized Setup and Protocol for Magnetic Domain Imaging with In Situ Hysteresis Measurement

This paper elaborates the sample and sensor preparation procedures and the protocols for using the test rig particularly for dynamic domain imaging with in situ BH measurements in order to achieve optimal domain pattern quality and accurate BH measurements.

Optimierte Setup und ein Protokoll für magnetische Domäne Bildgebung mit In Situ Hysterese-Messung

This paper elaborates the sample preparation protocols required to obtain optimal domain patterns using the Bitter method, focusing on the extra steps ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...