Die Bewertung molekularer Profile in lokalen Geweben ist ein entscheidender Schritt, um den Wirkmechanismus von Wirkstoffen zu verstehen, da sie in krankheitsrelevanten präklinischen Modellen bewertet werden. Im Bereich der Arthritisforschung sind die kleinen gewichtstragenden Gelenke, die aus einer komplexen Mischung aus Knochen, Knorpel, Muskel und Immunzellen bestehen, von Interesse. Hier beschreiben wir eine zuverlässige, robuste Methode zur mechanischen Störung und/oder Pulverisierung dieser komplexen Gewebeumgebung in einer kryogen kontrollierten Umgebung.
Diese Methode kann dann verwendet werden, um nachgelagerte proteomische und transkriptionelle Profilierungsbemühungen zu generieren, um molekulare Signaturen von Krankheiten aus einer einzigen einheitlichen Probenquelle zu ermitteln. Diese Methode erzeugt ein homogenes Pulver im Gegensatz zu vielen anderen alten Techniken. Zusätzlich ermöglicht das alte Temperaturisolationsverfahren die Isolierung hochwertiger RNA.
Diese Methode kann dann verwendet werden, um nachgeschaltete proteomische und transkriptionelle Profilierung zu erzeugen, die eine molekulare Charakterisierung relevanter Krankheitswege von Interesse ermöglicht. Diese Methode kann Einblicke in jedes Forschungsfeld geben, das molekulare Signaturen aus Geweben ableitet. Die Methode könnte auf jedes komplexe Gewebesystem ausgedehnt werden, das dichte und schwer zu dissoziierende Bestandteile hat.
Obwohl wir bis zu diesem Punkt nicht bewertet haben, konnten wir eine mögliche Anwendung auf dichte Knorpelgewebe wie Ohren oder Knochen sehen. Die zeitkritische Natur der Übertragung des Pulvers auf Rohre zum Wiegen ist etwas, das Übung erfordert. Wenn zu viel Zeit in Anspruch genommen wird, beginnt das Pulver zu tauen und amorph zu werden.
Es ist wichtig, die Anzahl der Proben auf 10 bis 15 zu begrenzen, bis Sie mit dem Verfahren vertraut sind. Am Tag der Gewebeverarbeitung alle benötigten Instrumente auf Trockeneis für mindestens 10 Minuten vorchillen. Tragen Sie Thermohandschuhe, um nicht durch die extreme Kälte geschädigt zu werden.
Als nächstes jede der vorbereiteten Mauspfote in ein separates 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr übertragen und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die gefrorenen Pfoten bei minus 80 Grad Celsius auf. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, füllen Sie eine Gefriermühle mit flüssigem Stickstoff und lassen Sie sie mindestens 10 Minuten aushalten.
Legen Sie die unverarbeitete Probe auf Trockeneis und halten Sie sie dort auf, um Frost-/Tauzyklen zu vermeiden. Dann eine Hinterpfote in eine vorgekühlte große Polycarbonat-Schleifflasche mit einem unteren Stahlstecker geben. Setzen Sie den vorgekühlten Stahlstoßsozer ein und schließen Sie die Polycarbonat-Schleifflasche mit dem vorgekühlten Stahlstopfen.
Die großen Polycarbonat-Schleiffläschchen mit den Proben in die fertige Gefriermühle geben und den Deckel mit dem an der Vorderseite des Instruments gefundenen Gummiverschluss schließen. Lassen Sie die Proben eine Minute im flüssigen Stickstoff abkühlen. Als nächstes stellen Sie die Gefriermühle auf das einminütige Programm mit 10 Zyklen pro Sekunde.
Drücken Sie die Lauftaste und warten Sie, bis die Gefriermühle ihren Zyklus abgeschlossen hat. Danach öffnen Sie den Deckel der Gefriermühle und nehmen Sie die große Polycarbonat-Schleifflasche heraus. Legen Sie die Schleifflasche in einen Extraktor und entfernen Sie den oberen Stahlstecker, indem Sie den schwarzen Griff nach unten drücken, bis der Stahlstecker aus dem Polycarbonatrohr gleitet.
Übertragen Sie die geöffnete Schleifflasche auf Trockeneis und verwenden Sie vorgekühlte Zangen, um den Stahlstoßsoper zu entfernen. Das gefrorene Pulver in ein vorgekühltes 50-Milliliter-Konusrohr geben. Wiegen Sie zwischen 30 und 50 Milligramm des gefrorenen Pulvers in eine gestufte 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhre für die RNA-Extraktion und zwischen 100 und 200 Milligramm für die Proteinextraktion.
Bewahren Sie die pulverisierten Proben bei minus 80 Grad Celsius auf und gehen Sie innerhalb von 24 Stunden zu RNA- und Proteinisolationen über. Fügen Sie zunächst 10 Mikroliter Beta-Mercaptoethanol für jeden Milliliter RLT-Puffer hinzu. Berechnen Sie das Volumen des RLT-Puffers entsprechend einem Verhältnis von 23,3 Milliliter pro Milligramm Gewebe und fügen Sie das entsprechende Volumen des RLT-Puffers mit Beta-Mercaptoethanol mit gefrorenem Pulver in die Röhre ein.
Wirbeln Sie die Probe bei 3.000 RPM für 10 Sekunden. Verwenden Sie einen Ein-Milliliter-Pipetter, um 10 Mal kräftig nach oben und unten zu pipette und die Probe 20 Sekunden lang bei 3.000 Umdrehungen wieder zu wirbeln. Zentrifugieren Sie bei 13.000 mal g für zwei Minuten und übertragen Sie 700 Mikroliter des Überstandes auf ein frisches Rohr.
700 Mikroliter 70%Ethanol in diese Röhre geben und 700 Mikroliter der Probe auf eine RNA-Reinigungskolonne laden. Zentrifugieren Sie das Rohr mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für 30 Sekunden. Entsorgen Sie den Durchfluss und laden Sie den restlichen Teil der Probe 30 Sekunden lang auf die RNeasy-Säule und zentrieren Sie das Rohr wieder mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g.
Entsorgen Sie den Durchfluss und waschen Sie die Säule, indem Sie 700 Mikroliter RW1-Puffer hinzufügen und mindestens die Geschwindigkeit von 10.000 mal g für 30 Sekunden zentrifugieren. Bei der Durchführung der Option DNAse-Verdauung werden 350 Mikroliter RW1 vor der DNAse-Behandlung hinzugefügt. Und nach der Behandlung von DNAse werden weitere 350 Mikroliter RW1 hinzugefügt.
Waschen Sie dann die Säule zweimal, indem Sie 500 Mikroliter RPE-Puffer und Zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für 30 Sekunden hinzufügen, um sicherzustellen, dass der Durchfluss jedes Mal verworfen wird. Danach trocknen Sie die Säule, indem Sie sie mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für zwei Minuten zentrieren. Elute die RNA durch Zugabe von 50 Mikroliter Wasser und Zentrifugieren mit einer Geschwindigkeit von mindestens 10.000 mal g für zwei Minuten.
Sammeln Sie den Durchfluss und übertragen Sie ihn in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr. Bestimmen Sie die RNA-Menge mit der Methode der Wahl des Forschers und speichern Sie sie bei negativen 80 Grad Celsius vor der weiteren Analyse. Verdünnen Sie die 10-fache Zelllyse-Stammlösung zu einer 1X Zelllyse-Stammlösung mit Zellkultur-Wasser.
Rekonstituieren Sie den Protease-Hemmer-Cocktail mit einem Milliliter Wasser, um einen 100-Fach-Protease-Hemmer-Bestand zu bilden. Fügen Sie 100 Milliliter Protease-Inhibitor zu 9,9 Milliliter 1X Zelllysepuffer hinzu, um eine 1X Endstocklösung zu erhalten. Fügen Sie vier Mikroliter eiskalte ZelllysePuffer für jedes Milligramm Gewebepulver und fügen Sie eine fünf Millimeter Edelstahl Perle in das Rohr.
Wirbeln Sie das Rohr bei 3.000 U/min für 60 Sekunden. Übertragen Sie die Röhre auf nasses Eis und fahren Sie mit der nächsten Probe fort. Darüber hinaus können Forscher feststellen, dass das Platzieren der Box vertikal eine bessere Vermischung mit der Perle erleichtern kann.
Nach einer Stunde zentrieren Sie die Rohre bei 10.000 mal g und bei vier Grad Celsius für 15 Minuten. Übertragen Sie die Überräube in ein frisches Rohr, um sicherzustellen, dass die Fettschicht auf der Oberseite zu vermeiden. Bestimmen Sie die Gesamtproteinkonzentration.
Jede Probe in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhren zu führen und bei negativen 80 Grad Celsius aufbewahren, bis sie für weitere Analysen bereit sind. In dieser Studie wird eine kryogene Pulverisierungsmethode verwendet, um murine Pfoten zu verarbeiten, um die Ausbeute und Qualität der aus den Geweben extrahierten RNA oder Proteine zu verbessern und die Analyse molekularer Profile im Zusammenhang mit Entzündungsreaktionen zu ermöglichen. Eine repräsentative Gelbildvisualisierung zeigt die RNA, die aus den Vorderpfoten von CIA-Mäusen extrahiert wurde.
Die 28S rRNA und die 18S rRNA Bänder zeigen an, dass alle Proben eine ausreichende Menge an intakter RNA haben. Hier wird eine repräsentative Streuungsdarstellung der gesamten Proteinkonzentrationen auf Basis der Protein-BCA-Analyse gezeigt. Die Gesamtproteinkonzentrationen von naiven Mäusen, CIA-Mäusen oder CIA-Mäusen unter verschiedenen Behandlungen sind gruppenübergreifend vergleichbar.
Luminex-Analysen werden dann durchgeführt, um die Konzentrationen von entzündlichen Zytokinen und Chemokinen im Proteinextrakt zu bestimmen. Eine repräsentative Streuung der Konzentrationen normalisierter Zytokine und Chemokine zeigt, dass im Vergleich zu naiven Mäusen mehrere Zytokine bei CIA-Mäusen erhöht werden und die Behandlung mit Anti-IL17A-Antikörpern die Produktion mehrerer Zytokine erheblich hemmt. Die Mikroarray-Analyse wird durchgeführt, um Transkriptom-Änderungen in CIA und behandlungsbedingte Effekte zu bewerten.
Eine repräsentative Heatmap-Diagramm von Genen deutlich erhöht bei CIA-Mäuseim Vergleich zu naiven Mäusen wird hier gezeigt. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es für die Forscher wichtig, die Zeit zu minimieren, die die Röhre und das Pulver aus Trockeneis herausgehalten werden. Dies hilft, das Auftauen des Pulvers und nachfolgende Probleme mit der abgebauten RNA und dem Protein zu verhindern.
Die hohe Qualität der durch diese Technik erzeugten molekularen Signaturen ermöglicht es den Forschern, das einzigartige Profil, das ein Therapeutisches vermittelt, abzuhören und ermöglicht darüber hinaus die Differenzierung von Mechanismen, die zur Behandlung von arthritischen Bedingungen eingesetzt werden können. Diese Technik könnte verwendet werden, um eine Reihe von dichten Geweben wie Ohren und Knochen zu extrahieren, um molekulare Signaturen in diesen Geweben von Interesse weiter zu bewerten. Das Verständnis, wie Therapeutika die molekularen Signaturen von Krankheiten modulieren, ermöglicht es uns, besser zu beurteilen, welche spezifischen Signalwege moduliert werden.
Und vielleicht noch wichtiger, welche Wege nicht reguliert werden, wenn der therapeutische Mechanismus bewertet wird. Bei der Arbeit mit flüssigem Stickstoff und Trockeneis ist es unerlässlich, persönliche Schutzausrüstung einschließlich ordnungsgemäß bewerteter Handschuhe und Gesichtsschutzmittel zu verwenden. Die Exposition der Haut für mehr als ein paar Sekunden kann schwere Verbrennungen verursachen.
Bei der Arbeit mit großen Mengen Trockeneis ist es wichtig, in einem gut belüfteten Bereich zu arbeiten, da Trockeneis Kohlendioxid freisetzt.
